携带muc1肿瘤抗原表位pdtrp的嵌合型病毒样颗粒及在胰腺癌中的应用
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，具体是一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒及其在胰腺癌中的应用。本发明提供了一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒的制备，并成功诱导持久的体液及细胞应答。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。
【专利说明】
携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒及在胰腺 癌中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及医学和生物工程技术领域，具体地说，是一种携带MUC1肿瘤抗原表位 PDTRP的嵌合型病毒样颗粒及在胰腺癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是消化系高度恶性肿瘤，预后差。积极寻找治疗胰腺癌的有效方法成为国 际热点问题。MUC1是Mucins粘蛋白家族成员，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细 胞表面，由多肽核心和侧枝糖链构成。其核心肽胞外段含有许多2 0个氨基酸 (SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT)的串联重复序列（variable numbers of tandem repeat， VNTRs)。糖链占 MUC1蛋白重量的50%以上，多以0-型糖苷键与肽骨架连接。正常组织如乳 腺、前列腺、卵巢、胰腺等，MUC1分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，糖基化 丰富；而在肿瘤组织，其广泛分布并异常丰富地表达于细胞表面，糖基化不完全，因此暴露 出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击的靶点。MUC1核心肽的TOTRP表位既能被多种 MUC1抗体识别，也可被CTL(cytotoxic lymphocyte)细胞识别和杀伤，且不受MHC限制。因此 MUC1 是较理想的抗肿瘤革E1 分子（Taylo Papadimitriou J，Burchell J,Miles DW，et al .MUC1 and cancer .Biochim Biophys Acta，1999，1455: 3012313)。由于PDTRP是一小分 子量短肽，不能诱导有效的免疫应答，因此寻找一个合适的基因载体，使抗原表位能够有效 的表达和被递呈亦是基因免疫诱导特异性免疫应答的关键。
[0003] 乙肝病毒核心蛋白（HBc)可自我组装形成亚病毒颗粒，成为能高表达外源表位的 载体。插入各种不同外源表位的HBc融合蛋白仍可保持其原有特性，形成嵌合体病毒样颗粒 (virus-like particles，VLP)并刺激产生针对外源表位的细胞及体液免疫反应(Yang R.， Murillo F.M.,Lin K.Y,et al.Human papillomavirus type-16 virus-like particles activate complementary defense responses in key dendritic cell subpopulations.J Immunol.2004.173,2624-2631.)
[0004] 目前尚无文献报道用生物工程方法制备携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病 毒样颗粒疫苗，也尚无文献报道将该疫苗用于预防或治疗胰腺癌的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒， 本发明的另一目的在于提供该携带MUC1肿瘤抗原表位TOTRP的嵌合型病毒样颗粒在防治胰 腺癌中的应用。
[0006] 本发明人研究发现，MUC1肿瘤表位TOTRP cDNA可以与HBc-VLP的cDNA重组并在大 肠菌中表达出携带roTRP的嵌合体VLP疫苗。
[0007] 本发明的主要技术方案是：将MUC1肿瘤表位PDTRP cDNA与HBc-VLP的cDNA重组并 在大肠菌中表达出携带roTRP的嵌合体VLP，研究本发明构建的VLP疫苗在治疗胰腺癌中的 作用。
[0008] 本发明的第一方面，提供一种携带MUC1肿瘤抗原表位roTRP的重组基因，所述重组 基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0009] 所述的重组基因是将PDTRP对应的基因序列插入到截断的HBc的第72个氨基酸的 第2和第3个碱基之间。
[0010] 本发明的第二方面，提供一种重组载体，所述的重组载体包含上述携带MUC1肿瘤 抗原表位H)TRP的重组基因，所述的载体为PET28a载体。
[0011] 本发明的第三方面，提供一种重组菌，所述的重组菌中包含上述重组载体，所述的 菌为大肠杆菌。
[0012]本发明的第四方面，提供一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒， 所述的嵌合型病毒样颗粒由上述重组菌表达。
[0013]所述的携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒是通过以下方法制备得 到的：
[0014] A、目的基因获取(利用基因合成）：根据GeneBank网站上公布的HBV的基因序列，查 找HBc第1个氨基酸至第144氨基酸对应的基因序列（SEQ ID N0:1)，同时查找MUC1序列获取 核心肽PDTRP编码的cDNA序列（SEQ ID N0:2);
[0015] B、将roTRP对应的基因序列插入到截断的HBc的第72和第73三个氨基酸之间，基因 序列如SEQ ID N0:3所示;其中第216-230位为TOTRP对应的基因序列；
[0016] C、基因合成完毕后将合成好的序列直接连接到PET28a载体上，经测序验证，开始 进行后续的蛋白诱导表达；
[0017] D、蛋白诱导表达:将构建好的嵌合型载体PET28a-HBcP转化到BL21感受细胞，摇菌 后菌体诱导表达蛋白，在确定诱导蛋白后，将重组蛋白大量纯化。
[0018] 本发明的第五方面，提供上述重组基因、重组载体、重组菌或携带MUC1肿瘤抗原表 位roTRP的嵌合型病毒样颗粒在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
[0019] 本发明的第六方面，提供一种疫苗，所述的疫苗的活性成分为上述携带MUC1肿瘤 抗原表位roTRP的嵌合型病毒样颗粒。
[0020] 本发明提供了一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒的制备，并 成功诱导持久的体液及细胞应答。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。
【附图说明】
[0021] 图1.质粒图谱；
[0022]图2.酶切验证结果；
[0023] 图3 .蛋白的体外诱导检测结果：注：1:蛋白m; 2 : Oh对照；3: 2h(0.3mMIPTG); 4: 4h (0.3mMIPTG)；5：2h(0.5mMIPTG)；6：4h(0.5mMIPTG)；
[0024] 图4.WB检测重组的HBc蛋白；
[0025] 图5.SDS-PAGE 鉴定嵌合体 HBc-VLP;
[0026] 图6上1^13六结果显示嵌合型邢(3，1^疫苗产生的11^12及正对农度增加；
[0027] 图7.不同实验组小鼠的肿瘤形成情况，A.注射携带MUC1的胰腺癌嵌合型疫苗，B. 注射不携带MUC1的胰腺癌疫苗。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0029] 实施例1
[0030] 实验材料：
[0031] 表 1
[0032]
[0033]
[0034] 1、嵌合型HBc-VLP基因合成
[0035] a、基因合成的相关信息:基因名称:HBcP基因长度:459bp，克隆载体:pET28a，克隆 位点:Ndel/Xhol，克隆载体抗性:Kan，结构图（图1)。
[0036] b、亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的 特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3'端向5 '端合成，相邻的核苷酸通过3 ' -5 '磷酸二酯键连接。
[0037] c、载体构建:将合成目的基因片段和载体分别用限制性内切酶Xhol和Nde頂每切
[0038]酶切体系： 片段（载体） 35μ1 Xho 丨 5μ1 Ndel 5μ1
[0039] 10*Η 10μ1 BSA ΙΟμΙ Λ：崗水 35μ1
[ο040] 37?水济 2h 30min、-.
[0041 ] d、连接：
[0042] 连接体系： 片段（合成基因） 5μ1 载体（Pet-28) 3μ1
[0043] Τ4 连接酶 ΙμL 迹接 buffer ΙμL 16°C过夜连接。
[0044] e、转化:从-70 °C冰箱中取200uL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置 于冰上，加入质粒，轻轻摇匀，冰上放置30min.管中加入lmLLB，混匀后37 °C培养lh，使细菌 恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素基因（氨苄青霉素），将上述菌液摇匀后取 1 OOuL涂布于平板，37 °C培养16-24h。
[0045] f、测序获得重组载体的全序列：（反向互补）（SEQ ID N0:4)。
[0046] h、酶切验证（图2)。
[0047] 基因合成完毕后将合成好的序列直接连接到PET28a载体上，经测序验证。
[0048] 结合图1和图2,嵌合型HBc-VLP基因合成的结果显示，合成好的许裢已经连接到 PET28a载体上，经过酶切和测序后验证成功。
[0049] 2、蛋白的体外诱导
[0050] 2.1构建好的嵌合型载体PET28a-HBcP转化BL21感受细胞
[0051 ] 转化步骤如下：
[0052] a、取一管制备好的感受态细胞置于冰上解冻5-10min，用无菌枪头在超净台内将 连接产物全部吸取加入到感受态细胞中，用手指弹匀，插入冰上30min;
[0053] b、取样品插入漂浮板上，于42°C恒温水浴锅热激1.5min，快速放回冰上3-4min;
[0054] c、取400yL无抗生素的液体LB培养基，在超净台内加入到EP管中，置于37 °C恒温摇 床，100转，预表达50min左右；
[0055] d、超净台内取200yL预表达的菌液涂布在含Kan抗生素的固体LB平板上，在37 °C恒 温培养箱，倒置培养12-15h;
[0056] 2.2蛋白表达
[0057] a、挑阳性菌接种到5mL的LB加 Amp的液体培养基中，37°C活化菌液；
[0058] b、次日，按照100mL的LB加 Amp转接lmL的菌进行转接，37 °C摇菌2h(0D值为0.4左 右)；
[0059] c、超净台内取一管菌液作为Oh的对照，同时加 IPTG，使其终浓度为0.5mM;
[0060] d、把菌液再放入37°C摇床，每隔两小时取1管菌液，连续取三次，并做好标记；
[00611 e、将零小时的和所取的诱导菌，高速离心30s，去上清，存放_20°C。
[0062] 2.3跑变性胶检测诱导的蛋白（图3，4)
[0063] a、取零小时的和诱导的菌，加1 X SDS上样缓冲液1 OOyL(用2 X的现配现用，并加适 量的DTT防止S-S键的形成），震荡，使菌悬浮，在沸水浴中煮5min，高速离心3min，即为制备 好的样品；
[0064] b、取配套的蛋白胶板，洗净吹干，用对应的制胶器将胶板架好；
[0065] c、配制10%的变性胶。根据说明书，先配5mL的下层胶加入胶板（胶面距离顶端 1.5-2cm用于加上层胶），再加 lmL的去离子水使胶面压平，待下层胶凝好时，倒掉上面的水， 并用吸水纸吸干净，配制2mL的上层胶加入胶板，并插入对应的梳子，15min左右，上层胶就 凝好。
[0066] d、垂直拔掉梳子，将制备好的胶放入蛋白电泳槽内，加入适量的蛋白电泳液，取20 μL样品的上清进行点样；
[0067] e、先用60V电压跑，等溴酚蓝跑到上层胶和下层胶的交界处时，换用80V电压跑，直 到溴酚蓝跑到胶板底部边缘处即可拆胶。
[0068] f、用考马斯亮蓝(R-250)染色液染色3_4h(过夜染色也可以），再用脱色液脱色，直 至条带清晰(期间要更换2-3遍脱色液）。
[0069] g、观察结果并拍照。
[0070] 结合图3和图4,表达后的蛋白大小为我们所需的目的蛋白。
[0071] 3、重组蛋白的大量纯化
[0072] a、取诱导好的菌液200mL，12000rpm，4°C，离心5min;
[0073] 13、弃上清，加131^€61'重悬（10〇1111^菌加81111^柱131^€61')，并加溶解酶至终浓度为111^/ mL，置于冰上30分钟，让细胞壁溶解充分；
[0074] c、用高压破碎仪破碎细胞3-4遍，12000rpm，4°C，离心15min;
[0075] d、取上清于新的管中，加树脂进行蛋白结合反应。
[0076] e、用漂洗buffer漂洗结合的蛋白3-4次；
[0077] f、用洗脱buffer洗脱结合的目的蛋白。
[0078] 4、蛋白定量
[0079] 用BCA蛋白定量试剂盒定量所纯化的蛋白。
[0080] a、标准曲线的绘制:取一块酶标板，按照下表加入试剂：
[0081] 表 2
[0082]
[0083] b、根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分 混匀；
[0084] c、各孔加入160μ1 BCA工作液；
[0085] d、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37°C放置30分钟，然后在562nm下测定吸光 度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度(yg/μL)为纵坐标，绘出标准曲线；
[0086] e、在酶标板中加入2μ1待测蛋白和18μ1 roS(稀释10倍），加入160μ1 BCA工作液， 把酶标板放在振荡器上振荡3〇SeC，37°C放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。
[0087] f、根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(yg/yl)，乘以 样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位:yg/yl)。
[0088] g、用复性缓冲液稀释所纯化的蛋白至2mg/ml。
[0089] h、复性蛋白溶液用双蒸水进行透析去除尿素，透析时每隔4小时换一次双蒸水，共 三次。
[0090] i、将复性的蛋白用BCA试剂盒定量。
[0091] 5、制备的嵌合体HBc-VLP的鉴定（图5)
[0092] a、PAGE胶的制备
[0093] b、上样及电泳
[0094] c、转膜
[0095] d、膜上蛋白的检测
[0096] e、膜的封闭及抗体孵育
[0097] f、显色:按照DAB显色试剂盒的使用说明书配制显色试剂盒，进行显色反应。
[0098] 结合图5,嵌合体HBc-VLP的鉴定结果是嵌合体HBc-VLP能够获得纯化的蛋白。
[0099] 6、ELISA检测TOTRP多肽免疫小鼠后炎性因子的表达
[0100] a.取免疫后小鼠的血清，离心后备用。
[0101] b.将准备好的试剂盒提取20min从冰箱中取出，平衡至室温；
[0102] c.分别设好空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100yL，余 孔分别加标准品或待测样品l〇〇yL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量 不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37 °C孵育90分钟。
[0103] d.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100yL (在使用前 15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37°C温育1小时。
[0104] e.弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μLν每孔，甩干并在吸 水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0105] f.每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100yL，加上覆膜，37°C温育30分 钟。
[0106] g.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
[0107] h.每孔加底物溶液(TMB)90yL，酶标板加上覆膜37°C避光孵育15分钟左右。
[0108] i.每孔加终止液50yL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与 底物溶液的加入顺序相同。
[0109] j .立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(0D值）。
[0110] 结合图6,炎性因子的检测结果是免疫后，可以分别提高小鼠体内血清中IL-12和 IFN- γ的表达量
[0111] 7. CCK-8验证roTRP诱导免疫细胞的免疫应答作用
[0112] a.断颈处死小鼠后，分离小鼠的淋巴细胞。
[0113] b.用1ml淋巴细胞培养基重悬细胞计数，稀释200倍计数。
[0114] c.按适当密度种至培养皿中，37度，5 % C02培养。
[0115] d.体外TOTRP抗原多次刺激，3天后用CCK8的法检测淋巴细胞的特异性增殖。
[0116] 结合表3, CCK8的方法验证TOTRP的结果是PDTRP能够诱导特异性细胞免疫应答作 用。
[0117] 表3 CCK8的方法验证roTRP诱导特异性细胞免疫应答作用
[0118]
[0119]实施例2
[0120] PDTRP多肽能够在胰腺癌细胞成瘤后保护BALB/c小鼠
[0121] 带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP基因的胰腺癌嵌合型HBc-VLP疫苗和不含MUC1肿瘤抗 原表位TOTRP的HBc-VLP对照分别于第0周和第四周体内免疫，在末次免疫后第2周，皮下接 种PANC1-PDTRP肿瘤细胞，观察不同实验组小鼠的肿瘤形成情况。
[0122] 实验结果
[0123] 见图7,由实验结果可知：与阴性对照相比，注射携带MUC1的嵌合型疫苗对瘤细胞 的致瘤起到抑制作用。
[0124] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO:3所示。2. -种重组载体，其特征在于，所述的重组载体包含权利要求1所述的重组基因，所述 的载体为PET28a载体。3. -种重组菌，其特征在于，所述的重组菌中包含权利要求2所述的重组载体，所述的 菌为大肠杆菌。4. 一种携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒，所述的嵌合型病毒样颗粒 由权利要求3所述的重组菌表达。5. 如权利要求1所述的重组基因在制备治疗胰腺癌药物中的应用。6. 如权利要求2所述的重组载体在制备治疗胰腺癌药物中的应用。7. 如权利要求3所述的重组菌在制备治疗胰腺癌药物中的应用。8. 如权利要求4所述的携带MUC1肿瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒样颗粒在制备治疗 胰腺癌药物中的应用。9. 一种疫苗，所述的疫苗的活性成分为权利要求4所述的携带MUC1肿瘤抗原表位TOTRP 的嵌合型病毒样颗粒。
【文档编号】C12N15/62GK106086050SQ201610485376
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】孙畅, 李兆申
【申请人】中国人民解放军第二军医大学