本发明涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，具体涉及一种全人源化EGFRvIIICART细胞及其制备方法。
背景技术：
：据《2011年中国肿瘤登记年报》报道，脑瘤或中枢神经系统肿瘤是死亡率排名第十位的恶性肿瘤。脑瘤内恶性程度较高的为胶质母细胞瘤，约占胶质瘤一半的比例。当前，胶质母细胞瘤的治疗方式主要是手术、放疗和化疗，存在着治愈率低、药物副作用大和复发率高等问题，至今仍没有有效的治疗手段，使得患者生存时间通常少于2年。近年来，随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫治疗作为一种新的治疗手段，主要通过人为干预来调动机体自身免疫系统，对癌细胞进行杀灭的作用日益受到重视。目前，最热门、最有效的免疫治疗手段包括免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorTcells，CART)。其中，免疫检查点抑制剂包括针对CTLA4、PD1、PDL1等免疫抑制分子的抗体，已被美国FDA批准用于黑色素瘤、肺癌等的治疗(中国国内正在进行临床试验)；CART在治疗白血病和淋巴瘤时，显示了巨大的优势，对于儿童复发、难治白血病，临床数据达到了93％的完全缓解率(CR)。天然状况下，由免疫反应(病毒、肿瘤抗原)活化的T细胞在识别、杀死靶细胞时，主要受到两种信号的刺激，一个为第一信号，来自T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)和CD3分子复合体，另一个为协同刺激信号，来自协同刺激分子CD28、4-1BB。T细胞只有受到这两种信号刺激时，才能充分活化，发挥杀伤功能。但是，许多肿瘤细胞会通过下调TCR分子识别的MHC-抗原肽复合物，或者下调共刺激分子，使T细胞不能发挥杀伤功能，从而逃避免疫系统的攻击，影响其治疗效果。CART是基因工程改造的T细胞，是近年来发展的靶向免疫治疗新策略，CAR分子一端为抗体的抗原识别区(单链抗体scFv)，另一端为胞内区，活化T细胞。不同代数CART的胞内区不同，最早的第一代CART只有CD3分子的胞内区，不能充分增殖，临床效果不好；第二代CART胞内区为协同刺激分子CD28+CD3ζ或4-1BB+CD3ζ，能够传递T细胞活化的两种信号，在2011年临床试验治疗白血病时显示了神奇的效果，能够清除所有白血病细胞，达到完全治愈肿瘤的目的；第三代CART中加入了两种协同刺激分子CD28和4-1BB分子，连同CD3ζ分子，能提供T细胞更多的活化信号，赋予T细胞更强的增殖性、持久的生命力，特异性地识别靶向性杀伤肿瘤细胞，尚未在临床应用。理想的肿瘤抗原应该是在正常组织中不表达或极少表达，在肿瘤组织的细胞中表达率高，它为肿瘤细胞生长过程中所必须的，避免肿瘤细胞通过不表达该抗原而逃避免疫监视。表皮生长因子受体III突变体(EGFRvIII)为表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变体，EGFRvIII主要表达于胶质母细胞瘤内，EGFRvIII常与EGFR基因扩增同时存在，EGFR和EGFRvIII的表达见表1。表1-EGFR和EGFRvIII在不同肿瘤组织的表达肿瘤类型EGFR高表达比例EGFRvIII高表达比例胶质母细胞瘤40-63％24-64％头颈癌43-100％42-48％非小细胞肺癌32-84％0-5％乳腺癌14-91％27-36％结直肠癌25-77％0％胰腺癌30-95％无数据相比EGFR，EGFRvIII主要为EGFR胞外区的外显子2-7缺失，但是剩余基因的阅读框没有改变，能够继续转录、翻译出EGFR外显子8后面的氨基酸，由此形成肿瘤特异性表位，其胞内区能够传递信号，导致细胞向恶性转化，EGFRvIII特异性表达于肿瘤细胞内，正常组织没有表达，因此EGFRvIII是较好的肿瘤免疫治疗的靶点。细胞学方面的实验表明EGFRvIII促进细胞增殖、浸润，抵抗凋亡，使肿瘤细胞对放疗及一些化疗药物具有抵抗性，与肿瘤的发生、发展有密切关系。EGFRvIII在人类肺鳞癌标本内，有5％的检出率；EGFRvIII基因在小鼠肺组织内表达能够导致肿瘤，表明EGFRvIII过表达能够促进肿瘤发生，过表达EGFRvIII的胶质母细胞瘤细胞对通常的EGFR抑制剂治疗无效，恶性程度较高。临床试验以EGFRvIII特异肽段增强的DC细胞回输患者，可将患者中位生存时间从63.3周提高到110.8周。2013年，SampsonJ.H.构建了针对EGFRvIII的3代CART细胞，与放疗配合，在动物实验中能够有效的清除胶质瘤细胞。然而，SampsonJ.H尽管使用了3代CART结构，但是其使用的识别EGFRvIII的抗体序列为鼠源的，活化T细胞的分子也是鼠源的，使得构建的3代CART结构只能活化小鼠T细胞，不能够活化人T细胞。现有技术CN201480009507.1公开了使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症中主要用到是小鼠抗体序列3C10，而选用139抗体序列只做了2代CAR，没有做动物实验。因此，全人源化EGFRvIIICART细胞关键之处在于设计全人源识别EGFRvIII的scFV序列使用在3代CART结构，证明此种设计能够使CART细胞具有杀伤EGFRvIII表达细胞的功能，通过细胞实验和动物实验均证明有效才可行。技术实现要素：本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种全人源化EGFRvIIICART细胞，所述T细胞表面表达全人源化EGFRvIIICAR基因，其碱基序列如SEQIDNO:3所示。进一步，所述全人源化EGFRvIIICAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR结构基因通过重叠PCR进行拼接。进一步，所述合成的ScFV基因包括编码CD8信号肽的核苷酸+全人源化139抗体的轻链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸+编码linker(G4S)3+全人源化139抗体的重链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。进一步，所述合成的3代CAR结构基因包括编码CD8铰链区+CD28跨膜区、胞浆区+4-1BB胞浆区+CD3ζ胞浆区的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种全人源化EGFRvIIICART细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)构建3代慢病毒CAR载体：首先将合成的ScFV基因或合成的3代CAR结构基因分别扩增PCR，得到合成的ScFV基因片段的PCR产物和合成的3代CAR结构基因片段的PCR产物；然后进行重叠PCR将这两个基因片段的PCR产物连接在一起，得到3代CAR结构的EGFRvIIICAR基因；最后将Pre-Lenti-EF1-MCS载体和EGFRvIIICAR基因双酶切，连接，转化，提质粒，测序，得到序列正确的表达EGFRvIIICAR的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR；(2)包装EGFRvIIICAR慢病毒，感染T细胞，制备得到CART进行细胞杀伤实验验证，证明有效；(3)再次制备EGFRvIIICART，进行动物实验功能验证，证明有效。进一步，步骤(1)中，用于所述扩增PCR的引物为EGFRvIII-EcoRI-up序列如SEQIDNO:4所示和EGFRvIII-BamHI-down序列如SEQIDNO:5所示。进一步，步骤(1)中，用于所述重叠PCR的引物为Middle-R如SEQIDNO:6所示和Middle-F如SEQIDNO:7所示。进一步，步骤(1)中，所述测序引物为Pre-up-Seq，如SEQIDNO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQIDNO:9所示。进一步，步骤(1)中，所述双酶为EcoRI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶。本发明的优点在于利用全人源化139抗体序列设计构建了3代全人源化EGFRvIIICART的结构，进行了细胞实验和动物实验，皆证明有效,能够活化人T细胞，是目前最新的针对EGFRvIII靶点的CART设计，能够用于人体肿瘤的治疗，为EGFRvIIICART细胞进行临床试验、临床研究提供了基础。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：图1为本发明EGFRvIIICAR慢病毒载体构建流程图。图2(a)-(b)为CART细胞杀死表达EGFRvIII的MC38靶细胞的镜下图。图3为Real-timePCR鉴定MC38EGFRvIII的表达。图4为LDH释放实验检测CART的杀伤率。其中1为MC38-EGFRvIII+controlCART的杀伤率；2为MC38-EGFRvIII+EGFRvIIICART的杀伤率。图5为EGFRvIIICART抑制小鼠皮下肿瘤实验设计流程。图6为EGFRvIIICART抑制小鼠皮下肿瘤体积变化。图7为EGFRvIIICART抑制小鼠皮下肿瘤体重变化。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。实施例1：Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR载体构建1、合成的ScFV基因：包括编码CD8信号肽的核苷酸+全人源化139抗体的轻链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸+编码linker(G4S)3的核苷酸+全人源化139抗体的重链可变区氨基酸密码子优化的核苷酸序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。其中，全人源化识别EGFRvIII的139抗体序列参见世界专利WO2005010151A2。2、合成的3代CAR基因：包括编码CD8铰链区+CD28跨膜区、胞浆区+4-1BB胞浆区+CD3ζ胞浆区的核苷酸片段，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。3、将合成的ScFV基因和合成的3代CAR基因通过重叠PCR反应进行拼接，得到3代结构的EGFRvIIICAR基因，如SEQIDNO:3所示。具体过程如下：(1)引物设计：使用序列分析软件pDRAW32分析EGFRvIIICAR基因序列，单酶切位点EcoRI、BamHI适合用于基因克隆，能够和Pre-Lenti-EF1-MCS载体的多克隆位点匹配，设计两端引物：EGFRvIII-EcoRI-up序列：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC，如SEQIDNO:4所示；EGFRvIII-BamHI-down序列：CGGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，如SEQIDNO:5所示。用于重叠PCR的引物：Middle-R，GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGGCTAGACACTGTGACCAGTG，如SEQIDNO:6所示。Middle-F，CACTGGTCACAGTGTCTAGCCCAGCGAAGCCCACCACGAC，如SEQIDNO:7所示。(2)PCR扩增、分子克隆：EGFRvIII-EcoRI-up和Middle-R引物以EGFRvIIIScFV基因为模板得到前面片段EGFRvIIIScFV，Middle-F和EGFRvIII-BamHI-down引物以3代CAR基因为模板得到后面片段CD8铰链区-CD28跨膜区+胞浆区-4-1BB胞浆区-CD3ζ胞浆区，然后重叠PCR，得到全长3代EGFRvIIICAR基因，克隆到Pre-Lenti-EF1-MCS载体，送测序，测序引物为：Pre-up-Seq引物，GGAGCCTACCTAGACTCAGC，如SEQIDNO:8所示，Pre-down-Seq引物，CAACCAGGATTTATACAAGG，如SEQIDNO:9所示。测序结果经比对，完全正确，得到了表达EGFRvIII3代CAR基因的慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR(见图1)。由此，采用容易在T细胞表达的EF1启动子，采用全人源识别EGFRvIII的抗体序列，使用慢病毒表达体系构建了完全适合临床试验、临床研究的CART用EGFRvIII载体。实施例2：细胞杀伤实验1、慢病毒包装：(1)包装细胞293T细胞培养于37℃，5％CO2孵箱内，培养基为DMEM(Hyclone)/10％FBS(兰州百灵)。(2)包装前一天，0.25％胰酶消化293T细胞，1×107细胞/培养皿种植10cm培养皿。(3)转染细胞时，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR穿梭质粒外，还要加入包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染，其中Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR质粒5μg，psPAX2质粒3.75μg，pMD2.0G质粒1.25μg。转染时，将三种质粒的混合物加入500μlMEM培养基(Hyclone)内，在另一个微型离心管内将25μlLipofectamine2000试剂(LifeTechnologies)加入到500μlMEM培养基(Hyclone)内，然后将稀释的转染试剂缓慢逐滴加入稀释的质粒上方，轻轻涡旋，离心，室温静置20min，期间将10cm培养皿内旧培养基换为MEM培养基，最后将质粒和转染试剂的混合物均匀加入10cm培养皿内，轻轻摇晃混匀，放入CO2孵箱；孵育5h后，将培养基换为新鲜含血清培养基。(4)细胞转染48h后，可以收获病毒，将10ml含病毒培养基转入15ml离心管内，4℃，1250rpm，离心5min，去除混入的293T细胞；然后将含病毒培养基通过0.45um滤器过滤，浓缩，分装，-80℃冻存，并留存部分病毒(约40ul)测定滴度。2、外周血单核细胞分离(1)抽血：在无菌条件下，抽取肝素抗凝的人体静脉血10ml。(2)分离外周血单核细胞：采用淋巴细胞分离液(达科为生物工程有限公司)，依照产品说明书进行，获得外周血单核细胞，用含IL2(1000u/ml)、10％灭活血清的1640培养基重悬，计数。3、T细胞纯化(1)外周血单核细胞计数：取1×107个外周血单核细胞于1.5ml微型离心管中。(2)250g，22℃，离心10分钟，收集细胞沉淀。(3)吸弃上层液体，80μL无菌磁珠分离液重悬细胞，加入20μl无菌的人CD3MicroBeads(美天旎)。(4)4℃冰箱中放置1小时，期间，轻弹一次，悬起细胞。(5)1小时后，加入1mL的磁珠分离液，轻轻上下颠倒混匀，250g，4℃离心10min。期间准备纯化过滤柱，将纯化过滤柱安放在磁铁上(美天旎)，用500μl的磁珠分离液润洗。(6)离心后的细胞弃上清，500μl磁珠分离液重悬，加入过滤柱，细胞悬液随重力流出后，纯化过滤柱用500μl的磁珠分离液洗四次。(7)将纯化过滤柱从磁铁上卸掉，使用1mL磁珠分离液将磁性吸附的T细胞快速冲出，至1.5ml微型离心管。(8)250g，4℃，离心10min。(9)含IL2(1000u/ml)、含10％灭活血清的1640培养基重悬，计数。4、T细胞慢病毒感染(1)纯化得到的T细胞计数，2×106T细胞/培养孔(6孔板)种植，培养过夜后，加入MOI(感染复数)为2的对照病毒液(空载体包装，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液，换为酶标板离心转子，1000g，22℃，离心30min，放入CO2孵箱，感染过夜。(2)感染第一天，补加1ml新鲜培养基(IL2(1000u/ml)、10％灭活血清)。(3)感染第三天，T细胞增殖非常旺盛，将T细胞收获、洗涤离心后转入25cm2塑料培养瓶。(4)CART细胞扩增至一定数量后，利用流式细胞仪(使用Jacksonimmnuoresearch的FITC标记山羊抗人Fab段抗体)鉴定EGFRvIIICART表面,识别EGFRvIII的单链抗体的表达阳性率。5、杀伤实验(1)通过Real-timePCR的方法，检测了9种肿瘤细胞系，都没有检测到EGFRvIII的表达。因此，我们构建了表达EGFRvIII的慢病毒载体，感染MC38或BxPC细胞，得到的稳定细胞系能够高水平的表达EGFRvIII(图3)。计数高表达EGFRvIII的MC38细胞，1×104个细胞/孔(96孔板)；计数感染的T细胞(Control病毒液感染的ControlT细胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液感染的EGFRvIIICART细胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入MC38-EGFRvIII细胞上层，实验设计见表2。表2-杀伤实验设计表(靶细胞：MC38-EGFRvIII)6、杀伤测量通过测量被CART杀死的死亡细胞释放的LDH，来确定CART细胞杀死靶细胞的效果(图2、图4)。(1)操作按照Promega公司LDH释放试剂盒说明书(CytoTox96非放射性细胞毒性检测，货号：G1780)进行。(2)步骤5中的杀伤实验过夜，约18h后，最大释放孔加入10×细胞裂解液(10xlysisbuffer)20ul，混匀。(3)2h后，96孔板内每孔取50μl上清，加入50μlLDH酶底物，室温避光静置反应20min，酶标仪测量波长492nm处的吸光度OD492。(4)杀伤率计算公式为式中，实验孔为不同设计效靶比得到的OD492，效应细胞自发为ControlT细胞或EGFRvIIICART细胞的OD492，靶细胞自发为靶细胞最小释放，靶细胞最大为加入裂解液后，细胞全部死亡的最大释放。CART细胞杀死表达EGFRvIII的MC38靶细胞，见图2(a)-(b)。由图2(b)可知，梭型的肿瘤细胞几乎消失，CART细胞活化后聚集成团。根据杀伤率计算公式计算得到的杀伤率见图4。由图4可知，LDH释放实验检测CART的杀伤率与对照相比，CART细胞杀伤效果较好，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICART杀伤功能较好。实施例3：动物实验1、小鼠品系：为NSG免疫缺陷小鼠品系，免疫系统缺乏T细胞、B细胞和NK细胞功能。2、肿瘤接种：使用外源高表达EGFRvIII的BxPC-1肿瘤细胞系，3×106细胞/100ulPBS皮下注射8只小鼠，见图5。3、CART注射：肿瘤细胞接种6天后，其中，4只小鼠为一组尾静脉注射Control，另4只小鼠为一组尾静脉注射EGFRvIIICART细胞(1×107细胞/200ulPBS)，见图5。4、每隔2天观察小鼠，测量体重，直至CART细胞注射22天后，EGFRvIIICART处理的4只小鼠皮下肿瘤消失。对肿瘤体积变化和体重变化作图，见图6、图7。由图6可知，CART细胞处理后，每隔2天测量肿瘤体积1次，对照组肿瘤生长至较大体积，而EGFRvIIICART处理组肿瘤生长被抑制。由图7可知，每隔2天，测量小鼠体重，EGFRvIIICART注入小鼠体内，没有影响体重。综上可见，EGFRvIIICART处理可以显著抑制肿瘤生长。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。SEQUENCELISTING<110>北京普瑞金科技有限公司；普瑞金（深圳）生物技术有限公司<120>一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法<130>2017<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>783<212>DNA<213>合成的ScFV基因<400>1atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agc783<210>2<211>939<212>DNA<213>合成的3代CAR基因<400>2ccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcg60tcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcac120acgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttaccta180gacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagt240cccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctg300gcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagagg360agcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgc420aagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggc480agaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaa540gaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgaga600gtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctat660aacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgg720gaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat780gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc840cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc900tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa939<210>3<211>1722<212>DNA<213>EGFRvIIICAR基因<400>3atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agcccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatc840gcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtg900cacacgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttac960ctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtcca1020agtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtc1080ctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaag1140aggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacc1200cgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacgg1260ggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactact1320caagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg1380agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc1440tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc1500cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac1560aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag1620cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac1680acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa1722<210>4<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>4cggaattcgccaccatggccttaccagtgaccgc34<210>5<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>5cgggatccttagcgagggggcagggcctg29<210>6<211>40<212>DNA<213>人工合成<400>6gtcgtggtgggcttcgctgggctagacactgtgaccagtg40<210>7<211>40<212>DNA<213>人工合成<400>7cactggtcacagtgtctagcccagcgaagcccaccacgac40<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>8ggagcctacctagactcagc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>9caaccaggatttatacaagg20当前第1页1 2 3