MMHRL1转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用的制作方法

本发明涉及生物学和肿瘤学领域，更具体地涉及新型H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系MMHRL1、及建立方法和应用。

背景技术：

人类疾病的发生和发展是一个非常复杂的过程。深入研究各类疾病的发病机制及临床药物治疗效果，以达到预防和治愈各种疾病的目的，是人类坚持不懈的奋斗目标。但基于人道主义，不能采用直接对患者进行实验的方法。而遵循动物保护法，可以通过动物实验对各类疾病发生发展的规律和生命现象进行深入研究，以便达到控制人类疾病的发生发展进程，缓解患者的病痛，直至治愈疾病的目的。

在人类长期的摸索实践中发现，临床疾病研究将健康人体和患病人体作为研究对象难以推动医学的快速和深入发展，而且存在人文、伦理、道德等诸多问题。另外，临床疾病研究还存在大量样本积累和长时间观察等局限性。

人类疾病动物模型(Animal modle of human diseases)是指生物医学研究中建立的具有人类疾病表现的实验动物和材料。通过人类疾病动物模型研究人类疾病的发生和发展规律以及治疗措施是现代生物医学研究中至关重要的实验方法和手段。其中，细胞培养已有百余年的历史，是进行体外基础医学研究的重要方法。

随着人们生活方式的改变、社会工业化进程和寿命的延长，肿瘤发病率也随之升高，已成为威胁人类生命健康的主因之一。肝癌号称“癌中之王”，是我国重点的防治病患，但其病因繁多、过程复杂、治愈率差，机制尚不清楚，仍有待于深入阐明。

目前，建立的人类肝癌细胞系已有数十种之多，但由于各个肝癌细胞系的来源背景复杂，分子机制各异，不利于对病因进行精准分析。另外，这些细胞系还存在成瘤能力有限、传代不稳定等不足，也不利于肝肿瘤的基础研究。小鼠是典型的人类疾病动物模型，可以通过建立单一病因诱发的原发性肝肿瘤动物模型对肝癌的病因学进行深入剖析。但由于小鼠的体内实验费用高、耗时耗力，并且影响因素复杂，急需建立相应的小鼠肝肿瘤细胞系。但相比之下，小鼠肝肿瘤细胞系的建立较为困难。因此，目前可应用的小鼠肝肿瘤细胞系屈指可数。

所以，本研究领域迫切需要研发病因明确、传代稳定、高成瘤性、适用于建立多种动物模型的小鼠肝肿瘤细胞系。

技术实现要素：

本发明目的在于为肝肿瘤基础研究和临床治疗提供一种肝肿瘤细胞系，该细胞系具有传代稳定、成瘤性好、适用于建立多种肝肿瘤动物模型。

本发明的另一个目的在于提供所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系的制备方法以及用途。

在本项发明的第一方面，提供了一种H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞，所述肝肿瘤细胞是H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1，它保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2016192。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所描述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞的子代细胞，所描述子代细胞能够导致裸鼠形成肝肿瘤。

在另一优选例中，所描述的子代细胞基本保留或完全保留亲代H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的特性。

在另一优选例中，所述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1或其子代细胞具有如下特性：

(a)100％细胞表达H-ras12V转基因；

(b)具有免疫缺陷小鼠皮下成瘤能力。

在本项发明的第三方面，提供了本发明上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1或其子代细胞的用途，它们可以被应用于裸鼠体内产生肝肿瘤。

在本发明的第四方面，提供了一种建立肝肿瘤动物模型的方法，包括步骤：

(a)将1×10⁶-1×10⁸的本发明上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1或其子代细胞接种于裸鼠体内；

(b)饲养步骤(a)的裸鼠14-90天，获得肝肿瘤动物模型。

在另一优选例中，所述的接种是接种于以下部位：肝脏、腹腔、尾静脉、皮下部位或者其组合。

在另一优选例中，步骤(b)中培养裸鼠7-100天，获得肝肿瘤动物模型。

在本项发明的第五方面，提供了一种体外培养肝肿瘤细胞的方法，包括步骤：在合适的培养基中培养本发明上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1或其子代细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种筛选治疗肝肿瘤的候选药物的方法，它包括步骤：

(a)将1×10⁶-1×10⁸的本发明上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1或其子代细胞接种于裸鼠；

(b)饲养步骤(a)的裸鼠14-90天，获得肝肿瘤动物模型；

(c)将测试药物应用于步骤(b)中获得的肝肿瘤动物模型，并与未应用药物的步骤(b)中获得的肝肿瘤动物模型进行比较，其中应用后导致肝肿瘤症状改善或治愈的测试药物就是治疗肝肿瘤的候选药物。

在另一优选例中，在步骤(c)中，将测试化合物的用药方式有如下选择：局部给药于肝肿瘤病灶部位、静脉给药、口服给药。

在本发明的第七方面，提供了用本发明上述方法制备的形成的肝肿瘤模型动物。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案，限于篇幅，在此不再一一描述。

附图说明

图1显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的培养情况。图1A显示了半干法培养12天时细胞爬出肝肿瘤组织块形成肿瘤细胞团的情况(200×)；图1B显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1细胞培养至第20代的生长形态(200×)。

图2显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的细胞形态及增殖情况。图2A显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的细胞形态(400×),；图2B显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的增殖情况。

图3显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的H-ras12V转基因的基因型鉴定和表达水平的检测。

图4显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1的信号通路活化水平的Western Blot检测结果。

图5显示了本发明H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1皮下接种裸鼠成瘤的实验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对一只H-ras12V转基因雄性小鼠的肝肿瘤样本进行原代培养，最后建立了具有无限增殖能力的H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1。在此基础上完成了本项发明。

具体而言，本发明人将一只H-ras12V转基因雄性小鼠的肝肿瘤组织进行体外培养，建立相应的体外细胞系。

对细胞系进行相关的生物学检测鉴定。筛选得到一种纯种H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1。该细胞系生长稳定(已经稳定传代至80代)，并且该细胞系在光学显微镜下的形态学特征均一。

动物学实验表明，该H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1接种于裸鼠后可导致裸鼠产生肿瘤，其组织病理形态学与H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤组织相一致。

本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系MMHRL1不仅能够制备肝肿瘤动物模型，而且能够用于筛选治疗肝肿瘤的候选药物。

一种优选的筛选治疗肝肿瘤(或肝肿瘤细胞生长)的候选药物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的培养体系中添加测试化合物，并且观察H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的细胞数量和/或生长情况；在对照组中，在H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的培养体系中不添加测试化合物，并且观察H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的细胞数量和/或生长情况；

其中，如果测试组中H-ras12V转基因雄性小鼠细胞MMHRL1的数量或生长速度超过对照组(存在显著性差异)，则提示，该测试候选药物对肝肿瘤细胞的生长或增殖具有促进作用。

在另一优选例中，所描述的小于表示测试组与对照组的数量之比或者生长速度之比≤0.8，或更佳比为≤0.4。

在另一优选例中，所描述的大于表示测试组与对照组的数量之比或生长速度之比≥2.5，或更佳之比为≥0.5。

在另一优选例中，所描述的显著性差异为P<0.05.

一种优选的筛选治疗肝肿瘤的候选药物的方法，包括步骤：

(a)将1×10⁶-1×10⁸(较佳的1×10⁶-1×10⁷，更佳的1×10⁷-1×10⁸)上述的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1接种于裸鼠；

(b)饲养步骤(a)的裸鼠14-90天，获得肝肿瘤动物模型；

(c)将测试药物施用于步骤(b)的肝肿瘤动物模型，并与未施用测试药物的步骤(b)的肝肿瘤动物模型进行比较，其中，施用后能够使得肝肿瘤动物模型肝肿瘤症状出现好转或者治愈的测试药物可以认为是治疗肝肿瘤的候选药物。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1来自H-ras12V转基因雄性小鼠；

(b)本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1性状稳定，能够稳定进行多次传代；

(c)本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1成瘤性良好，肝肿瘤发病原因和遗传特性明确，是研究肝肿瘤机制和临床前期试用的理想细胞系；

(d)本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1可进行肝肿瘤相关基因的体外研究；

(e)本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1可进行肝肿瘤敏感性药物的体外筛选。

下面结合具体实施例，进一步阐述本项发明。应理解，以下实施例仅用于说明本项发明，而不是用于限制本项发明的范围。以下实施例中，未标注具体实验条件的实验方法，按照常规实验条件或按照制造厂家建议实验条件完成实验。除非标注说明，否则百分比以及份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的建立

(a)来源

H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系来自于H-ras12V转基因雄性小鼠，其具体信息如下表所示。

表1

取得该H-ras12V转基因雄性小鼠原发性肝肿瘤组织，直接进行肝肿瘤组织体外培养，反复进行消化和传代，最终获得稳定传代的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞系。具体包括以下过程：

无痛苦处死上述H-ras12V转基因雄性小鼠，无菌术切下肝肿瘤。将肝肿瘤置于装有常温灭菌生理盐水的10cm培养皿中，充分清理掉肿瘤包膜，使用手术刀将上述操作后留取的肝肿瘤组织切割至1×1×1mm³大小的组织块，加入肝肿瘤组织培养液通过半干法培养。肝肿瘤组织培养液成分为DMEM high glucose培养基，添加10％热灭活胎牛血清、100IU/ml青-链霉素、50mg/ml庆大霉素。新接种的肝肿瘤组织块24h后换液，H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞培养过程中隔72h换液。半干法培养12天后即可以在肝肿瘤组织块周围观察到有细胞爬出。此时对上述肝肿瘤组织进行常规细胞培养消化、铺板，并在多次消化、铺板过程中去除原有肝肿瘤组织培养中的成纤维细胞。原代细胞第一次传代至第10代时即能够得到大量形态均一的上皮样细胞，命名为MMHRL1。

目前，H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1已经传代至第80代，细胞生长情况稳定，状态良好，还在继续传代和培养中(图1B和图2A)。

获得的该株H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1于2016年11月08日保藏与中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉·中国)，保藏号为CCTCC NO：C2016103，保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山（八一路299号）。

实施例2

H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1的生物学特性

在本实施例中，使用常规方法对保藏号为CCTCC NO:C2016103的纯种H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1进生物学特性的检测，结果如下：

2.1细胞形态

普通光学显微镜下观察H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1，可见肝肿瘤细胞多数为圆形或多边形，细胞形态均一(图2A)。使用Cell Counting Kit-8(CCK8试剂盒)，检测该细胞系增殖状态，操作完全按照试剂盒操作指南进行(图2B)。细胞稳定增殖。

2.2H-ras12V转基因的基因型鉴定

取实施例1中获得的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1(保藏号：C2016103)，经消化液(0.25％胰酶、0.02％EDTA、pH7.3)消化后，收集，提取基因组DNA和总RNA，进行RAS转基因基因型的PCR定性鉴定和RAS基因表达的RT-PCR检测。

(a)RAS转基因PCR定性鉴定方法：

提取H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系细胞MMHRL1基因组DNA，进行普通PCR，上样量如下表2，结果见图3A

表2

(b)RAS转基因RT-PCR定量检测方法：

提取H-ras12V转基因雄性小鼠细胞系细胞MMHRL1mRNA，按照(a)中方法合成cDNA，后进行RT-PCR，上样量如下表3，结果见图3B

表3

2.3H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1细胞的Western Blot检测

本实施例中对H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1细胞进行Western Blot检测。结果如图4所示。

结果表明：H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1细胞的MEK/ERK和AKT/mTOR信号通路显著激活。

实施例3

使用H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1建立肝肿瘤动物模型

取实施例1中获得的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1(保藏号：C2016103)，经消化液(0.25％胰酶、0.02％EDTA、pH7.3)消化后，收集并计数，按照1×10⁶或者1×10⁸细胞数量/只小鼠接种于小鼠右侧腋下皮下部位，接种小鼠为5只5周龄裸鼠。

接种后14-60天之间，5只小鼠均陆续发生肿瘤。用实施例2相同的方法进行生物学检测，证实在动物模型上诱发肝细胞肝肿瘤。结果如图5所示。

细胞系保藏

本发明的H-ras12V转基因雄性小鼠肝肿瘤细胞MMHRL1，于2016年11月08日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉·中国)，保藏号为CCTCC NO：C2016103。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连医科大学

<120> MMHRL1转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用

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