MSTN双敲细胞系及其构建方法与流程

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种稳定敲除MSTN基因的细胞系及其构建方法。

背景技术：

在哺乳动物中，MSTN主要在骨骼肌中表达，并且在生长时期和成熟期的骨骼肌中均有表达。在猪胚胎期21～35d可以检测到MSTN mRNA分子，在49d该基因表达水平明显提高，妊娠105d时开始降低，出生后2周达到最低水平，在生长期猪的骨骼肌、心肌和乳腺中一直有表达。

Taylor WE等于2001年研究检测了重组MSTN对鼠骨骼肌细胞的影响，结果发现重组MSTN蛋白可抑制细胞的增生、DNA的合成以及蛋白质的合成，从而抑制肌肉的生长。Rios等将编码鼠MSTN cDNA重组体瞬时转染C2C12成肌细胞，有效地抑制了细胞的增殖，并发现MSTN蛋白可能具有上调细胞周期依赖性磷酸转移酶抑制因子的作用。Joulia通过稳定转染MSTN基因在骨骼肌细胞中表达，发现减少了分化过程中G0/G1期细胞的数目，另外还检测到P21和P53蛋白表达有所提高。Thomas M通过向培养基中添加MSTN蛋白，进一步证明随着该种蛋白浓度的增加，对C2C12成肌细胞的抑制作用增强，MSTN可抑制成肌细胞从C1期向S期的转化，并且Western杂交结果表明MSTN可以影响与细胞增殖相关的蛋白质的表达，如可以促进P21的表达、降低Cdk2的表达。

Wayne E研究表明，MSTN基因抑制C2C12细胞增生可能是通过该基因作用于TGF家族的其他成员，如丝氨酸-苏氨酸激酶家族的特异受体。这种对细胞增生的抑制作用可以通过除去MSTN而解除，对C2C12的抑制作用比对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)更加明显，提供了MSTN基因优先作用于骨骼肌的证据。

Lee SJ发现纯化的C-末端二聚体复合物能够作用于激活素(ACT II)受体，MSTN可与Act RIIB连接，ACT是多功能的生长因子，有促进细胞系分化，诱导胚胎中胚层发育及维持神经存活、诱导肝细胞发生凋亡等作用，其生物学活性与TGF-β有相似之处。另外，高浓度的MSTN蛋白前体还可与卵泡抑素(FS)相结合，而Fs通过与ACT结合起作用。也有研究认为MSTN可与卵泡抑素相关基因(FLRG)直接作用，二者结合的复合物是血液循环中的MSTN蛋白存在的一种主要形式，FLRG可抑制MSTN的活性。通过这条途径，MSTN基因可抑制肌肉的生长，但是各种因子相互作用的具体途径还有待进一步研究。研究还发现，MSTN基因与肌源性决定基因(MyoD)的功能相关。超表达的内源性MSTN可降低MyoD蛋白水平并诱导其磷酸化模式的改变，在成肌细胞分化周期中MyoD表达发生变化：在细胞周期的C1期MSTN启动子的活性相对较高，此时MyoD表达水平最大，认为MSTN可能是MyoD的下游靶基因，MyoD可以通过调控MSTN基因的表达来调节成肌细胞的细胞周期。

总之，目前认为MSTN基因可以影响到多种与生长分化有关的蛋白质或生长因子的作用，失活MSTN基因可以解除MSTN对肌肉生长的抑制作用。

技术实现要素：

鉴于失活MSTN基因可以解除MSTN对肌肉生长的抑制作用，本发明的目的在于提供一种稳定敲除MSTN的细胞系及其构建方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种稳定敲除MSTN基因的细胞系，包括真核表达载体，所述的真核表达载体含有用于敲除MSTN基因的序列。

在本发明最优选的实施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列为表达sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。

在本发明最优选的实施例中，所述的细胞系为猪肾细胞PK15细胞系。

在本发明最优选的实施例中，所述的真核载体为pX330质粒。

在本发明最优选的实施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表达sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330质粒经过Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之间。

本发明的第二个目的在于提供一种稳定敲除MSTN基因的细胞系的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示，逆转录得到表达sgRNA的序列；

(2)利用表达sgRNA的序列构建包括用于敲除MSTN基因的真核表达载体；

(3)将所述用于敲除MSTN基因的真核表达载体转染到PK15细胞中，得到所述稳定敲除MSTN基因的PK15细胞系。

在本发明构建方法最优选的一个实施例中，所述用于敲除MSTN基因的序列为表达sgRNA的序列，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。在本发明构建方法最优选的一个实施例中，所述细胞系为PK15细胞系。

在本发明构建方法最优选的一个实施例中，所述真核载体为pX330质粒。

在本发明构建方法最优选的一个实施例中，所述用于敲除MSTN基因(用于表达sgRNA)的DNA序列插入到所述pX330质粒经过Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之间。

本发明的第三个目的在于提供一对特异识别MSTN基因的sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，所述的sgRNA-F如序列表的序列1所示，所述的sgRNA-R如序列表的序列2或序列3所示。

本发明的第四个目的在于一对DNA分子，由编码权利要求7中的所述sgRNA-F的DNA分子甲和编码权利要求7中的所述sgRNA-R的DNA分子乙组成。优选地，所述的一对DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子甲如序列表的序列4所示，所述的DNA分子乙如序列表的序列5或序列6所示。

与现有技术相比，本发明通过在PK15细胞基因组中删除了MSTN基因的第三外显子序列中1063～1082的204bp碱基序列，构建了稳定敲除MSTN基因的细胞系，不仅在体外成功模拟了MSTN的表达状态，为研究MSTN基因在肌肉发育中作用提供了模型，而且也为MSTN的功能研究提供了帮助。

附图说明

图1为原始的pX330质粒的图谱；

图2为稳定敲除MSTN的细胞系的构建方法的流程图；

图3为western检测PK15稳定敲除MSTN基因细胞系蛋白表达量的结果图；

图4为本发明构建的细胞模型在明场和荧光下的观察结果图；

图5为载体测试以及试验载体的线性化结果图；

图6为细胞基因组与供体DNA之间连接的PCR产物电泳图谱；

图7为构建的Cas9/sgRNA表达载经PstnI内切酶消化后的电泳图谱；

图8为供体DNA经内切酶Nsi I和Xho I消化后的电泳图谱。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。

以下实施例中用到的试剂和仪器：pX330载体购自Biovector。oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自北京Invitrogen公司。T4DNA连接酶购自NEB公司。胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。质粒少量抽提试剂盒购自Roche公司。质粒大量抽提试剂盒购自TIANGEN公司。DMEM1640培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；采用电转染的方法，电转染试剂购自Sigma公司；PK15细胞用含10％胎牛血清的DMEM1640培养液培养。荧光倒置显微镜为Olympus产品。

如图1所示，用于敲除MSTN基因表达sgRNA的DNA序列插入所述pX330质粒粒经过Bbs Ⅰ酶切形成的粘性末端之间。

如图2所示的上述稳定敲除MSTN的细胞系的构建方法，包括如下步骤：将用于敲除MSTN基因的表达sgRNA的DNA序列序列插入到Bbs I酶切质粒所形成的的粘性末端之间，得到包括用于敲除MSTN表达的真核表达载体。得到的包括用于敲除MSTN表达的序列的真核表达载体可以通过PCR酶切后，跑DNA电泳鉴定。

实施例1：sgRNA表达质粒的构建及活性验证

表达sgRNA的双链DNA(退火产物)合成：NEB Buffer3(10×)，20μL体系。取单链的Cas9/sgRNA-MSTN-F和Cas9/sgRNA-MSTN-R核酸片段各10pmol退火形成双链。退火条件95℃，5min关闭PCR仪让其自然冷却2h。

Cas9/sgRNA表达载体合成：Bbs Ⅰ酶切pX330质粒载体将其线性化，凝胶回收线性化载体。退火产物和线性化载体体积比1:1，混合于试剂Solution Ⅰ环化载体。

供体DNA合成：引物Cas9-T3-LF和Cas9-T2-LR扩增打靶载体555bp左同源臂；引物Cas9-T2-RF和Cas9-T2-RR扩增423bp的右同源臂，左、右同源臂亚克隆于HRX-2MCS载体。合成的供体DNA含有正筛选标记Neo、EGFP，负筛选标记DesRed。

表1引物设计

Cas-S引物测序表明在特异的位点含有sgRNA序列，PstnI内切酶消化后形成了一条带为100000bp(见图7)，与测序结果一致，证明Cas9/sgRNA表达载体构建成功。

供体DNA含有正筛选标记Neo基因和EGFP基因，负筛选标记DesRed，图中箭头代表载体序列方向；一旦MSTN打靶位点双链断裂产生，供体DNA转染PK15细胞可实现双链断裂介导的同源重组，从而在MSTN基因外显子3上实现长度为204bp序列的特异性敲除。合成的供体DNA总长为9167bp，内切酶Nsi I和Xho I消化供体DNA，被消化的产物经凝胶电泳分离形成了大小不同的2条带(见图8)。其带型大小与测序分析结果一致，一条短链2395bp，一条长链为6772bp。证明构建的Cas9/sgRNA表达载体有活性。

实施例2：确定筛选培养基中合适浓度的G418浓度

G418的配制：配制1M Hepes：23.8g HEPES粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH调节PH至7.3，过滤除菌，4℃保存，终浓度为1mol/L。

制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL、1200μg/mL。24孔板，每孔1mL培养基(含有G418的完全培养基)，每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4mL，现用现配。

将冻存的细胞复苏培养，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态，铺24孔板(20000/孔)，12h换液，加筛选培养基。

确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天换液一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。试验中所确定的最佳筛选浓度为600μg/mL。

实施例3：电转染贴壁细胞及抗性细胞克隆的筛选

接种PK15细胞至6孔板，用含10％胎牛血清的DMEM1640培养液培养至密度约为70～80％时可用于转染。将电转试剂及质粒溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合液：50μL电转液、2.5μg质粒，用该溶液重悬细胞。混匀后用200μL的移液枪将细胞悬液加入1mm电击杯中，放入电击槽。电转参数设定：电压170V，脉冲为1pulse，时间为3ms。给电击的细胞更换新的培养基后将混合液加入9cm标准培养皿，摇匀。静置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，培养12h移除培养基，更换为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM1640培养基继续培养，转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。在换液一两次后(换液后培养过夜)，细胞达50％-80％时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22μm过滤，加入2倍体积的新鲜的最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10％血清，此时则可以采用20％血清。培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。筛选约14天后可见有抗性克隆出现。挑单克隆:高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。G418浓度为800μg/mL筛选大约25d，借助倒置荧光显微镜(Leica 4000B，Gemany)筛选阳性细胞克隆。

单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA,RT-PCR检测目的基因的表达，同时western检测目的基因表达。RT-PCR检测结果和western检测目的基因的结果如图3所示，其中：(A)在MSTN第3外显子，PK15只有野生型，PK3108含有野生型和包含标记基因两种，L18含有包含标记基因和204bp缺失这两种(没有标志以及一侧的Loxp)。泳道M是1kb的marker(TaKaRa)，泳道1是空白对照，泳道2是PK15细胞基因组，泳道3是PK3108细胞基因组，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2细胞基因组，泳道6是供体供体DNA，泳道7是L18细胞基因组。(B)Western blot检测PK3108、L18、PK15以及对照组细胞系中MSTN的表达。MSTN敲除后与对照相比，表达量明显降低。说明我们转入的sgRNA已经切开PK15细胞基因组并使MSTN基因失活。由图3可见，MSTN的蛋白表达量比正常细胞明显降低，说明目的基因已切开PK15细胞基因组并使MSTN基因失活。

实施例4：PK15MSTN knock-out稳定细胞系蛋白表达量的检测

本实施例中使用三鹰公司的兔抗鼠MSTN蛋白C端多肽特异性抗体以及山羊抗鼠IgG抗体。

将正常的PK15细胞与我们所构建的稳定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15细胞系同时收样做蛋白检测。首先，去除培养基后加入4℃PBS将细胞用细胞刮刮下来放入15m1离心管中，2000转5min离心，去除上清，再每管加入1m1 4℃PBS把细胞沉淀吹匀后转移到1.5m1EP管内再次离心并去上清。接着开始裂解细胞，将RAPA强裂解液与蛋白酶抑制剂，100:1的比例混合后加到细胞沉淀中，4℃摇晃裂解1h后，4℃14000转离心，取上清即样品。最后测样品蛋白浓度，并加入Loading buffer煮沸8min，再调平上样量用SDS-聚丙烯凝胶电泳跑胶。电泳3小时，转膜2小时，之后抗体孵育，一抗2小时，二抗1小时，显色曝光。

实施例5：目的细胞的筛选:

将正常的PK15细胞与我们所构建的稳定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15细胞系同时培养，正常的PK15细胞贴壁生长，与MSTN敲除的PK15细胞形态差异不明显。

转染质粒后，使用G418浓度为800μg/ml的10％胎牛血清的DMEM1640培养基进行筛选，获得抗性克隆。在含G418的培养液中，未转染质粒的细胞死亡。将获得的抗性细胞混合克隆，再用G418进行系列稀释、鉴定、选择后得到单克隆抗性细胞株，用10％胎牛血清的DMEM1640培养基持续培养。

图4为本发明构建的细胞模型在明场和荧光下的观察结果；左上、下为明场下观察的细胞图片，中上、下为绿色荧光下观察的细胞图片，右上、下为红色荧光下观察的细胞图片。只有中下这个有绿色荧光的激发，说明基因敲除成功。

图5为载体测试以及试验载体的线性化结果图，其中：(A)MSTN第3外显子的Cas9/sgRNA体外表达载体构建。序列结果显示sgRNA正确的插入所设计的PX330载体的位点里面。(B)M泳道是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白对照，泳道2是环状Cas9/sgRNA表达载体，泳道3是用Kpn Ⅰ酶切的线性化的Cas9/sgRNA表达载体。(C)pTurbo-Cre的长度是5894bp，EcoR Ⅰ酶切线性化后的两个片段大小分别是4794bp和1100bp，这将在体外表达删除两边增加相同的Loxp序列的标记基因。泳道M是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白对照，泳道2是环状pTurbo-Cre载体，泳道3是EcoR Ⅰ酶切的线性化的pTurbo-Cre载体。(D)供体DNA包含阳性标志Neo/EGFP阴性标志DesRed。供体DNA长度是8583bp，Nsi Ⅰ和Xho Ⅰ线性化后的两个片段大小分别是6578bp和2005bp。泳道M是1kb大小的Takara marker，泳道1是空白对照，泳道2是环状供体DNA，泳道3是用Nsi Ⅰ和Xho Ⅰ酶切的线性化的供体DNA。

图6细胞基因组与供体DNA之间连接的PCR产物电泳图谱，其中：(A)上游接头：泳道M是DL5000marker，泳道1是空白对照，泳道2是PK15细胞基因组，泳道3是PK3108细胞基因组，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2细胞基因组，泳道6是供体供体DNA，泳道7是L18细胞基因组。(B)下游接头：泳道M是DL5000marker，泳道1是空白对照，泳道2是PK15细胞基因组，泳道3是PK3108细胞基因组，泳道4是pTurbo-Cre，泳道5是PK3108-2细胞基因组，泳道6是供体供体DNA，泳道7是L18细胞基因组。

本研究首次成功构建稳定敲除MSTN(MSTN knock-out)的PK15细胞系，通过失活MSTN基因，以明显降低MSTN的蛋白表达量。该稳定表达细胞系的建立，不仅成功在体外模拟了骨骼肌细胞MSTN的表达状态，为研究MSTN基因在肌肉发育中的作用提供了模型，而且也为MSTN的功能的研究提供了帮助。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> MSTN双敲细胞系及其构建方法

<160> 6

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcuguguaa ugcauguaug ugg 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggauuuugaa gcuuuuggau ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcaaagaac aaauaauaua ugg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctgtgtaa tgcatgtatg tgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggattttgaa gcttttggat ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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