一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于植物组织和细胞工程领域，具体地说，涉及一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法。
【背景技术】
[0002]良好的植物悬浮细胞系不仅是体细胞胚大量同步发生的最佳材料，也是许多作物原生质体的主要来源，酶解后细胞壁被讲解的仅由质膜包围的裸露单细胞可以作为外源基因导入的直接受体，还可进行种间甚至是属间的体细胞杂交，从而创造新的种质资源。此夕卜，植物悬浮细胞还可用来制造人工种子，筛选突变体以及生产次生代谢物质等。因此，如何建立良好的植物悬浮细胞培养体系是非常有实用价值和应用前景的研究课题。
[0003]不同物种及同一物种不同品种其悬浮细胞系建立的难易程度存在很大差异。目前在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.，以下简称橡胶树)中仅有少数几个品种成功建立了稳定的悬浮细胞系并用于后续的科学研究。然而目前橡胶树悬浮细胞系建立的方法均是从花药或内珠被固体培养诱导愈伤组织，经过多次继代培养筛选出易碎胚性愈伤组织后，再转入液体培养基中进行悬浮培养，在这一阶段仍需经过多次继代筛选培养才最终获得稳定分散的悬浮细胞系，从外植体的起始培养到细胞悬浮系的最终建立需花费6-10个月甚至更长的时间，相当耗时费力。前期的实验周期过长，亦非常不利于后续试验材料的获取，从而限制了某些有价值的科学研究的开展。此外，悬浮细胞系在建立后随着继代次数的增加，分化能力逐渐下降甚至消失，细胞系的变异风险增大。也就是说，悬浮细胞系建立后并非就一劳永逸，继代培养一段时间后仍需从起始材料重新建立新的具有良好分化能力的细胞系。因此，探寻一种快速稳定且适用于橡胶树多个品种的悬浮细胞系建立的方法，可有效解决上述问题，且为批量体细胞胚同步诱导再生植株，或进行原生质体培养与体细胞杂交，以及利用原生质体为受体进行外源基因的直接转化等技术体系快速提供良好的材料来源。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种简单易行且快速建立橡胶树悬浮细胞系的方法。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法，包括材料的选取和消毒、悬浮培养诱导愈伤组织过程、继代筛选培养过程。具体步骤如下:
[0006](I)材料的选取和消毒:在早上九点前摘取橡胶树单核靠边期未成熟雄花蕾，先用75%酒精对花蕾进行表面消毒50?70秒，再用0.1%的氯化汞消毒8?12分钟，无菌水漂洗3?5次后用灭菌金属网收集花蕾，置于铺有无菌滤纸的培养皿中。
[0007](2)悬浮培养诱导愈伤组织过程:在超净工作台上用镊子和解剖针完整剥出上述消毒花蕾中的花药，将50?100粒花药接种于含15?30ml液体培养基的三角瓶中，置于80?10rpm摇床上，温度为26?28°C条件下暗培养30?40天，期间更换I?2次液体培养基。
[0008]所述液体培养基的成分为:改良的MS基本培养基、0.1?Img.L—M-BAj.2?2mg.IZ1NAAa-Smg.L—hd-D'0.l — l.0mg.L—1TDZj.I?5mg.IZ1AgNO3WO ?80ml.L—1 椰子水和40?50g.L—1鹿糖。
[0009]MS的改良成分为:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4.H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L^10
[0010](3)继代筛选培养过程:在花药悬浮培养长出愈伤组织后每5-7天用与步骤(2)相同的液体培养基进行继代培养I次，并筛除老化和褐化的组织，持续继代培养20?30天游离出小细胞团后，吸取适量的小细胞团按细胞团体积占液体培养基体积3%_6%的比例添加新的液体培养基继续继代培养I?3次，即获得稳定分散的悬浮细胞系。
[0011]与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果:
[0012](I)本发明提供的快速建立橡胶树悬浮细胞系的方法简单易行、耗时短，极大降低了生产成本，缩短了实验周期，且普遍适用于国内多个重要栽培品种。
[0013](2)本发明提供的快速建立橡胶树悬浮细胞系的方法可为批量体细胞胚同步诱导再生植株，或进行原生质体培养与体细胞杂交，以及利用原生质体为受体进行外源基因的直接转化等技术体系快速提供良好的材料来源。
[0014](3)本发明采用直接悬浮培养的方法一步到位建立生长迅速、分散均匀的悬浮细胞系，为利用生物技术育种方式进行橡胶树品种改良和种质创新开拓了新的便利途径。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
[0016]本发明一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法实施时，步骤如下:
[0017](I)材料的选取和消毒是在早上九点前摘取橡胶树单核靠边期未成熟雄花蕾，先用75%酒精对花蕾进行表面消毒60秒，再用0.1%的氯化汞消毒10分钟，无菌水漂洗4次后用灭菌金属网收集花蕾，置于铺有无菌滤纸的培养皿中。
[0018](2)悬浮培养诱导愈伤组织过程是在超净工作台上用镊子和解剖针完整剥出上述灭菌花蕾中的花药，将60粒花药接种于含15ml液体培养基的三角瓶中，置于90rpm摇床上，温度为27°C条件下暗培养30天，期间更换I次液体培养基。
[0019]所述液体培养基的成分为:改良的MS基本培养基、0.5mg.L—M-BA、I.2mg.L—1NAAUJmg.1^2,4~?>,OAmg.IZ1TDZJmg.!/1AgNO3JOml.L—1 椰子水和45g.L—1 蔗糖。
[0020]MS的改良成分为:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4.H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L^10
[0021](3)继代筛选培养过程是在花药悬浮培养长出愈伤组织后每6天用与步骤(2)相同的液体培养基进行继代培养I次，并筛除老化和褐化的组织，持续继代培养4次游离出小细胞团后，吸取适量的小细胞团按细胞团占液体体积3 %的比例添加新的液体培养基继续继代培养2次，即获得稳定分散的悬浮细胞系。
实施例2
[0022]本发明一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法实施时，步骤如下:
[0023](I)材料的选取和消毒是在早上九点前摘取橡胶树单核靠边期未成熟雄花蕾，先用75%酒精对花蕾进行表面消毒50秒，再用0.1%的氯化汞消毒12分钟，无菌水漂洗4次后用灭菌金属网收集花蕾，置于铺有无菌滤纸的培养皿中。
[0024](2)悬浮培养诱导愈伤组织过程是在超净工作台上用镊子和解剖针完整剥出上述灭菌花蕾中的花药，将80粒花药接种于含20ml液体培养基的三角瓶中，置于90rpm摇床上，温度为27°C条件下暗培养30天，期间更换I次液体培养基。
[0025]所述液体培养基的成分为:改良的MS基本培养基、0.5mg.L—M-BA、1.2mg.L—1NAAdJmg.L—hj-D'0.emg.IZ1TDZdmg.!/1AgNO3JOml.L—1 椰子水和45g.L—1 蔗糖。
[0026]MS的改良成分为:MgS04.7H20 550mg.L—\KH2PO442Omg.L—\CaCl226Omg.L-\MnSO4-H2O 30mg.L—\CuSO4.5H20 0.25mg.L—、
[0027](3)继代筛选培养过程是在花药悬浮培养长出愈伤组织后每6天用与步骤(2)相同的液体培养基进行继代培养I次，并筛除老化和褐化的组织，持续继代培养4次游离出小细胞团后，吸取适量的小细胞团按细胞团占液体体积5 %的比例添加新的液体培养基继续继代培养2次，即获得稳定分散的悬浮细胞系。
[0028]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法，其特征在于包括材料的选取和消毒、悬浮培养诱导愈伤组织过程和继代筛选培养过程;步骤如下: (1)材料的选取和消毒:选取橡胶树单核靠边期未成熟雄花蕾为起始材料，并采用75%酒精和0.1 %氯化汞常规二次消毒的方法对其进行表面消毒； (2)悬浮培养诱导愈伤组织过程:在超净工作台上用镊子和解剖针完整剥出上述消毒花蕾中的花药，将50?100粒花药接种于含15?30ml液体培养基的三角瓶中，置于80?10rpm摇床上，温度为26?28°C条件下暗培养30?40天，期间更新I?2次液体培养基； 所述液体培养基的成分为:改良的MS基本培养基、0.1?Img.L—?2mg.L—1NAAd-Smg.L—hd-D'0.l — l.0mg.L—1TDZJ.1?5mg.IZ1AgNO3AO?80ml.L—1 椰子水和40?50g.L—1鹿糖； 所述改良的MS基本培养基中的改良成分为:MgS04.7H20 550mg.L"1 ,KH2P04420mg.L—\CaCh260mg.L-1^MnSO4.H2O 30mg.L—1、C11SO4.5H20 0.25mg.L_1； (3)继代筛选培养过程:在花药悬浮培养长出愈伤组织后每5-7天用与步骤(2)相同的液体培养基进行继代培养I次，并筛除老化和褐化的组织，持续继代培养20?30天游离出小细胞团后，吸取适量的小细胞团按细胞团占液体体积3%?6%的比例添加新的液体培养基继续继代培养I?3次，即获得稳定分散的悬浮细胞系。
【专利摘要】本发明公开了一种建立橡胶树悬浮细胞系的方法，包括材料的选取和消毒、悬浮培养诱导愈伤组织过程和继代筛选培养过程。本发明提供快速建立橡胶树悬浮细胞系的方法工艺流程简单，用时相对较短，只需60～90天即可建立一个稳定均匀、分散性良好、生长迅速的悬浮细胞系，比采用常规方法建立橡胶树悬浮细胞系花费的时间至少缩短一半以上，极大降低了生产成本，缩短了实验周期，可为批量体细胞胚同步诱导再生植株，或进行原生质体培养与体细胞杂交，以及利用原生质体为受体进行外源基因的直接转化等技术体系快速提供良好的材料来源。
【IPC分类】C12N5/04, A01H4/00
【公开号】CN105557524
【申请号】CN201510951623
【发明人】戴雪梅, 杨先锋, 黄天带, 李季, 辛士超, 黄华孙
【申请人】中国热带农业科学院橡胶研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月18日