专利名称：一种高产没食子酸的茶条槭悬浮细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，具体讲是以 植物细胞培养技术为手段，通过在细胞培养器中进行的茶条槭悬浮细 胞培养，并在悬浮细胞中分离产生没食子酸。本发明属于生物工程领 域。
背景技术：
茶条槭(Acer ginnala Maxim)属槭树禾斗，槭树属；为落叶小 乔木或灌木，株高可达8-IO米；树形优美，叶型清秀，尤其是秋后 叶色鲜红艳丽，极具观赏价值，是园林绿化和观赏树种。茶条槭在我 国主要分布在东北山地、内蒙古及华北山地，长江流域也有生长，在 黑龙江省主要分布在小兴安岭、完达山、张广才岭等山区，具耐寒抗 风雪的特性，因此是一难得的东北地区绿化树种。茶条槭嫩叶可制成 茶叶，具有生津止渴，退热明目之功效；更主要的是茶条槭树叶中含 有大量的没食子酸(Gallic acid,GA)，即3、 4、 5—三羟基苯甲酸， 没食子酸是医药、纺织、石油、化工、机械、国防、轻工业、塑料、 食品等工业的重要原料，在医药工业中，没食子酸及其衍生物对冠心 病、脑血栓、胃溃疡、抗菌、抗血吸虫、抗病毒性肝炎、老年性痴呆、 抗肿瘤等显示出多方面的功效，在化工、轻工、食品等方面，没食子 酸作为原料均有广泛的应用。目前销售价格在8 10万元4—、现今市场对没食子酸的需求量 越来越大，仅黑龙江省每年就计划生产600吨，需茶条槭干叶8000 吨左右。这种方式使茶条槭基因资源遭到了很大浪费和破坏，原料的 质量和数量很难得到保证，此外，叶片也受到季节的限制，同时，天 然树叶中没食子酸含量很低。因此没食子酸的原料保障就成为其是否 能成功走向市场的最为关键因素，植物细胞培养是解决问题的有效途 径之一。 发明内容本发明的目的在于提供一种产没食子酸的茶条槭悬浮细胞，来代
替茶条槭叶片。此细胞生长快、周期短、不受季节限制、产没食子酸。 为了达到上述目的，本发明经过多年的时间，在分析、研究国内 外没食子酸研究成果的基础上，系统的研究了植物组织细胞悬浮培养 技术应用到茶条槭有效次生代谢产物没食子酸的理论、技术及可行 性，包括从材料选择、外植体诱导、悬浮培养系的建立过程，完成了 实验室研究，建立了茶条槭悬浮培养体系，获得了大量的茶条槭悬浮 培养细胞，并检测此细胞产没食子酸。本发明所采用的技术方案是取茶条槭组培苗的幼嫩叶片或茎 段，在固体培养基中得到愈伤组织，然后将愈伤组织转入液体培养基 中进行悬浮培养并筛选高效合成没食子酸的悬浮细胞系。培养选出的 细胞系，收获细胞，提取没食子酸。选出的细胞系采用继代保存和-196 "C液氮中保存。本发明的优点是1、 本发明用茶条槭悬浮细胞代替叶片，保护了环境资源。2、 本发明的茶条槭悬浮细胞生长快、周期短、不受季节限制。3、 本发明的茶条槭悬浮细胞生产没食子酸比用茶条槭叶片生产没食子酸提高了81.6倍。4、 本发明的茶条槭悬浮细胞成本低，所需劳动力少。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述-本发明取茶条槭组培苗的幼嫩叶片和茎段为外植体，接种于WPM+TDZ0. 01 mg/L +6-BA0. 1 mg/L固体培养基中，23-25。C，光照培 养15天获得愈伤组织。然后，将愈伤组织转入WPM+TDZ0, 002-0. 01mg/L +6-BAO. 05-0. 15 mg/L固体培养基中继代培养，7-15天1继代。选择长势好的愈伤组织转入3倍的大量元素WPM液体培养基中， 激素为TDZO. 004mg/L和6-BAO. lmg/L，蔗糖为2%， pH值为5. 8-6. 0，培养条件.-23-25。C， 120转/min，光照8h/d，光照强度16001,x。 28天为一周期，3代后吸取悬浮液转入固体培养基上铺板，3周后长 成细胞系，分别取不同颜色和质地的生长旺盛细胞系进行一个继代的
悬浮培养，扩大繁殖后，重新继代，1个周期后收集细胞，测定没 食子酸含量，筛选没食子酸含量高且细胞生长迅速的悬浮细胞系。悬浮细胞系的超低温保存取培养14d的细胞进行超低温保存； 10。/。二甲基亚砜(DMS0)+8。/。葡萄糖作为冰冻保护剂；按如下程序降温在(TC中预处理30min后移入-2(TC中停留180min，然后转入-7(TC中 停留30min，最后投入-196。C液氮中保存。实例l:在无菌条件下，取图1所示茶条槭愈伤组织20g/L，加入 到50-100ml的3WPM液体培养基中，激素为TDZO. 004mg/L和 6-BA0. lmg/L，蔗糖为2%， pH值为5.8-6.0。按上述培养条件进行培 养，培养后得到如图2所示的细胞系，收集细胞得到结果为鲜重达 47.82g，干重可达2. 23g，没食子酸含量达0. 229%。实例1说明悬浮细胞生长速度快、周期短、没食子酸含量高。
图l适于茶条槭悬浮培养的愈伤组织图2高效生产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞系图3没食子酸标样液相色谱4悬浮培养茶条槭样品没食子酸液相色谱图。
权利要求
1、一种高产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞系，其特征在于该细胞是产茶条槭次生代谢产物——没食子酸的悬浮培养细胞。
2、 根据权利要求l所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，其 特征在于该悬浮细胞是茶条槭悬浮培养细胞。
3、 根据权利要求l所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，其 特征在于此悬浮培养细胞能产生没食子酸。
4、 根据权利要求l所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，其 特征在于此悬浮培养细胞在3倍大量元素WPM培养基上进行悬浮培养。
5、 根据权利要求1和4所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞， 其特征在于在3WPM培养基上添加TDZ—0. 002 0. 01mg/L、 6-BA— 0. 05 0. 15 mg/L，蔗糖为2 3%， pH值5. 8-6.0。
6、 根据权利要求1和5所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞， 其特征在所说的TDZ为噻重氮基苯基脲，6-BA为6-苄基氨基嘌呤。
7、 根据权利要求l所述的产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，其 特征在于此悬浮培养细胞在23-25°C， 110 130转/min，光照8 10h/d，光照强度1400 1700Lx条件下培养，7-15天继代1次。
全文摘要
本发明提供了一种生产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞。其特征在于将适量的茶条槭愈伤组织接种于WPM+TDZ0.002-0.01mg/L+6-BA0.05-0.15mg/L固体培养基中继代培养，15-20天1继代。选择长势好的愈伤组织转入3倍的大量元素WPM液体培养基中，激素为TDZ0.002-0.010mg/L和6-BA0.05-0.15mg/L，蔗糖为2-3％，pH值为5.8-6.0，接种量鲜重为20-40g/L。23-25℃，110-130转/min，光照8-10h/d，光照强度1400-1700Lx，7-15天1继代，20-30天为一周期，1个周期后收集细胞。鲜重达478.2g/L，干重可达22.3g/L，没食子酸含量达2.29％，没食子酸产量0.51g/L，一年可收获6.1227g/L。本发明是第一次在茶条槭植物中能通过细胞工程方法高产没食子酸的悬浮细胞。解决了没食子酸生产上的原料问题，易操作，周期短，成本低，能节省大量人力、物力、提高劳动生产率，进而保护环境，保护茶条槭植物资源。
文档编号C12N5/04GK101210231SQ20071014487
公开日2008年7月2日 申请日期2007年12月20日 优先权日2007年12月20日
发明者曾凡锁, 李淑娟, 由香玲, 范桂枝, 杰 董, 詹亚光, 齐凤慧 申请人:东北林业大学;詹亚光;齐凤慧