副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法

专利名称：：副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法
技术领域：
：本发明是一种对副干酪乳杆菌产生的抗菌肽进行分离和纯化的方法。
背景技术：
：目前抗菌肽的潜在应用价值受到了国内外学者的广泛关注，现已成为生命科学领域的一个研究热点。
发明内容本发明的目的是提供一种本专利通过一系列分离手段的实施，从副干酪乳杆菌体内分离纯化出具有抑菌活性的抗菌肽。上述的目的通过以下的技术方案实现副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其组成包括选取副干酪乳杆菌a"cto^i7/"s/mracflw')，制作培养基，其特征是利用最高产肽方式发酵获得的发酵液在离心力10,000克，离心，冷藏并分离，发酵原液为阳离子交换层析的样品；经阳离子交换层析并过积累浓縮，使用超滤离心管在冷冻低温高速离心超滤除盐，同时收集流出液和保留液，将保留液通过分离纯化；高效液相色谱HPLC;采用蛋白浓縮试剂盒对样品进行浓縮，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，12-垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对分离到抗菌肽进行分子量估测，基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS和串联质谱Q-TOF2实验测定氨基酸序列。所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，所述的制作培养基包括a.将20毫升水琼脂倒入12厘米平板，作为下层培养基，待凝固后摆牛津杯；b.将新鲜的枯草芽胞杆菌及s"6制成菌悬液107菌落形成单位/毫升)混入30毫升牛肉膏培养基(0.75%琼脂)中，倒在水琼脂上，作为上层培养基；c.待上层培养基凝固后，轻轻的将牛津杯垂直拔出，在平板底部做好标记；d.用移液枪取120微升样品(分别为发酵上清液，浓縮10倍的发酵上清液，过柱后各馏分浓縮样，对应浓度的样品缓冲液)垂直点样孔点样；e.将平板在4'C正置30分钟，以使待检样品充分渗透进入培养基内，然后移入37'C培养箱中，正置培养16小时后测量抑菌圈大小，拍照。所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，所述的阳离子交换层析包括以下步骤a.离子交换介质处理；b.装柱与平衡；C.上样；d.洗脱a.离子交换介质的处理将弱阳离子交换树脂CMSepharoseFF原包装置于室温下，使其温度与室温相同，由于CMSepharoseFF储存于20X甲醇溶液中，需将甲醇溶液倾出，再用平衡缓冲液(0.05摩尔乙酸铵，pH6.0)代替，达到总体积32.5毫升(75XCMSepharoseFF;25%0.05M乙酸铵，pH6.0)。b.装柱与平衡取一只层析柱(16亳米x200毫米)，先装入l/4高度、0.05M乙酸铵缓冲液(pH6.0)，止住其流出，将上述处理好的CMS印haroseFF装入柱内，等其完全沉淀后，放开下端流出口，以同一缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分钟，等流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，即可上样分离；c.上样将离心后的发酵液上清原液上样，流速为3毫升/分钟至饱和，上样量约70毫升，然后用上述平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定为止；d.洗脱层析柱流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，用0.05M1M乙酸铵pH6.0以1毫升/分钟梯度洗脱(分管收集)，此时采用自动收集器定时收集馏分。所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，所述的凝胶层析系统包括以下步骤a.凝胶介质的选择及溶胀；b.装柱；C.上样；d.洗脱a.凝胶介质的选择及溶胀选择颗粒均一，杂质含量低的凝胶介质，本实验选择的为葡聚糖凝胶层析SephadexG-50/G-25/G-10:称取25克g凝胶干粉放入500毫升烧杯中，加入0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液(510倍体积)，在沸水浴中热溶涨12小时，冷却至室温后，抽真空或髙压灭菌脱去凝胶中残留的空气，备用；b.装柱取一直长度为100厘米，内径为1厘米的层析柱。洗净，在柱的下端用夹子夹住，向柱内装入1/4左右柱床体积的0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液，然后把溶涨处理好的凝胶浓浆，一次装入层析柱内，使凝胶慢慢沉降，当凝胶沉降至柱床高度的1/2时，打开下端，然后用0.05M乙酸铵(pH6.0)以葡聚糖凝胶层析，0.8毫升/分钟(S叩hadexG-25/G-50)或0.5毫升/分钟(SephadexG-10)流速流动平衡；c.上样拧开柱上端的螺旋帽，待柱内的缓冲液下降至与凝胶表面相切。取适当体积的上一步骤分离到的有活性的馏分浓縮样品(3mLCMSepharoseFF分离馏分；2mLSephadexG-50/G-25分离馏分)溶液沿着管壁小心加在胶上面，用缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全进入凝胶，再加入几毫升缓冲液，然后拧紧柱上端的螺旋帽接口并与储液瓶连接，柱的出口端与紫外检测仪和自动收集器相连；d.洗脱在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸铵(pH6.0)进行洗脱，采用自动收集器收集，待层析结束后，合并高峰管以内的各管收集液。将过SephadexG-10的活性峰馏分收集并浓縮后，用超滤柱除盐，进一步用HPLC分离纯化。所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，所述的HPLC操作步骤如下a.向贮液瓶中倒入足够当天操作用的溶剂，不同体积比的水一乙腈，并注意溶剂预先过滤并脱气；b.紫外可见检测仪应预热30分钟后，打开Waters公司生产的泵开关以及系统电源；c.向泵中充入新鲜溶剂水乙腈；d.冲洗仪器1.将泵出口管导至废液瓶；2.将流量设在5毫升/分钟，冲洗2分钟，若色谱柱以前使用过，则至少要使30毫升溶剂通过此柱；3。设定分析条件；e.进样1.将卡住插塞的手柄扳至开位置，取下插塞；2.用微量进样器把所需体积的样品充入进样器中，插入插塞，并将卡住插塞的手柄板至关闭位置；3.将进样注射手柄板至注射位置；f.记录色谱图，打印色谱经过对同类物质HPLC条件分析和摸索设定如下流动相系统表1副干酪乳杆菌抑菌肽类物质分离所用HPLC体系(上样量15pL)线性梯度AB运行时间30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)0100%0%20/300%100%21/31100%0%本发明使用的菌种畐'J干酷乳杆菌(Zflrcto6fla7/ws/wwvicflwe/)。种子培养基大豆蛋白胨10克(g),牛肉膏10g，酵母提取物5g,D(+)G(D)(D(+)葡萄糖)20g，K2HP04(磷酸氢二钾)2g，Na2S03(亚硫酸钠)O.lg，NaAc(醋酸钠)5g，MgS04(硫酸镁)0.2g，MnS04(硫酸锰)0.05g，柠檬酸铵2g，吐温801亳升(mL)，水lOOOmL，调pH5.5,121摄氏度(°C)灭菌15分钟(min)。发酵培养基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g,酵母提取物5g，K2HP042g，Na2S03O.lg，NaAc5g,MgS040.2g，MnSO40.05g，柠檬酸铵2g，吐温801mL，水1000mL，调pH5.5，121。C灭菌15min。这个技术方案有以下有益效果-通过本发明，成功分离得到了副干酪乳杆菌的抗菌肽。抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽，是生物天然的、非特异性防御系统的重要组成部分。这种小分子多肽氨基酸数目小于IOO，常带正电荷。天然抗菌肽广泛分布在细菌、病毒以及动植物等各种生物体内31。由于其具有相对分子质量小、对热稳定、水溶性好和抗菌谱广等特点，以及不同于抗生素的全新的抗菌机制。利用本发明成功的分理处抗菌肽，为抗菌肽，及其抗菌肽技术在人们生活和医药、农业等领域的进一步发展奠定了基础。附图l是CMSepharoseFF(弱阳离子交换树脂)离子交换层析谱图。附图2是SephadexG-50(葡聚糖凝胶层析填料G-50)层析谱图。附图3是S印hadexG-25(葡聚糖凝胶层析填料G-25)层析谱图缓冲液流速0.8mL/min。附图4是SephadexG-10(葡聚糖凝胶层析填料G-10)层析谱图。附图5是S印hadexG-10洗脱峰II谱图具体实施例方式实施例l:副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其组成包括选取副干酪乳杆菌(Z(K^M"7/附/;tfmawe/)，制作培养基，利用最高产肽方式发酵获得的发酵液在10，000g，离心，冷藏并分离，发酵原液为阳离子交换层析的样品；经阳离子交换层析并过积累浓缩，使用超滤离心管在冷冻低温高速离心超滤除盐，同时收集流出液和保留液，将保留液通过分离纯化；HPLC;采用蛋白浓縮试剂盒对样品进行浓縮，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE对分离到抗菌肽进行分子量估测，MOLDI-TOF-MS和Q-TOF2实验测定氨基酸序列。本发明使用的菌种副干酪乳杆菌(丄acto6flc/〃MS/wimawe/)。保藏在CCTCC保藏号M205015保藏日期20050205保藏存活证明在200510009788.3肽类天然微生物防腐剂产生菌及应用和防腐剂的制备方法专利申请案巻中。种子培养基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，D(+)G20g，K2HP042g，Na2SO30.1g，NaAc5g，MgS040.2g，MnSO40.05g，柠檬酸铵2g,吐温801mL，水1000mL，调pH5.5，121'C灭菌15min。发酵培养基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HP042g，Na2S03O.lg，NaAc5g，MgS040.2g,MnSO40.05g,拧檬酸铵2g，吐温801mL，水lOOOmL，调pH5.5，121。C灭菌15min。实施例2:以上实施例所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法中，所述的制作培养基包括a.将20ml水琼脂倒入12厘米平板，作为下层培养基，待凝固后摆牛津杯；b.将新鲜的枯草芽胞杆菌As"6(以下简称5.s"Z0制成菌悬液107cfti/mL(菌落形成单位/毫升的縮写)混入30mL牛肉膏培养基(0.75%琼脂)中，倒在水琼脂上，作为上层培养基；c.待上层培养基凝固后，轻轻的将牛津杯垂直拔出，在平板底部做好标记；d.用移液枪取120微升(fiL)样品(分别为发酵上清液，浓縮10倍的发酵上清液，过柱后各馏分浓縮样，对应浓度的样品缓冲液)垂直点样孔点样；e.将平板在(C正置30min，以使待检样品充分渗透进入培养基内，然后移入37'C培养箱中，正置培养16小时后测量抑菌圈大小，拍照。实施例3:以上实施例所述的所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法中，所述的阳离子交换层析包括以下步骤a.离子交换介质处理；b,装柱与平衡；C.上样；d.洗脱a.离子交换介质的处理将CMSepharoseFF原包装置于室温下，使其温度与室温相同，由于CMS印haroseFF储存于20X甲醇溶液中，需将甲醇溶液倾出，再用平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)代替，达到总体积32.5mL(75%CMSepharoseFF;25%0.05M乙酸铵，pH6.0)。b.装柱与平衡取一只层析柱(16毫米x200毫米)，先装入l/4高度、0.05M乙酸铵缓冲液(pH6.0),止住其流出，将上述处理好的CMSepharoseFF装入柱内，等其完全沉淀后，放开下端流出口，以同一缓冲液(0.05摩尔(M)乙酸铵，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分钟(以下标记为mL/min)，11等流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，即可上样分离；c.上样将离心后的发酵液上清原液上样，流速为3mL/min至饱和，上样量约70mL，然后用上述平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定为止；d.洗脱层析柱流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，用0.05M1M乙酸铵pH6.0以lmL/min梯度洗脱(分管收集)，此时采用自动收集器定时收集馏分。实施例4:以上实施例所述的所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法中，所述的凝胶层析系统包括以下步骤a.凝胶介质的选择及溶胀；b.装柱；C.上样；d.洗脱a.凝胶介质的选择及溶胀选择颗粒均一，杂质含量低的凝胶介质，本实验选择的为SephadexG-50/G-25/G-10:称取25g凝胶干粉放入500mL烧杯中，加入0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液(510倍体积)，在沸水浴中热溶涨12h,冷却至室温后，抽真空或髙压灭菌脱去凝胶中残留的空气，备用；b.装柱取一直长度为100cm，内径为lcm的层析柱。洗净，在柱的下端用夹子夹住，向柱内装入1Z4左右柱床体积的0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液，然后把溶涨处理好的凝胶浓浆，一次装入层析柱内，使凝胶慢慢沉降，当凝胶沉降至柱床高度的1/2时，打开下端，然后用0.05M乙酸铵(pH6.0)W0.8mL/min(SephadexG-25/G-50)或0.5mL/mm(SephadexG-10)流速流动平衡；C.上样拧开柱上端的螺旋帽，待柱内的缓冲液下降至与凝胶表面相切。取适当体积的上一步骤分离到的有活性的馏分浓縮样品(3mLCMSepharoseFF分离馏分；2mLSephadexG-50/G-25分离馏分)溶液沿着管壁小心加在胶上面，用缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全进入凝胶，再加入几毫升缓冲液，然后拧紧柱上端的螺旋帽接口并与储液瓶连接，12柱的出口端与紫外检测仪和自动收集器相连；d.洗脱在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG画IO)的流速用0.05M乙酸铵(pH6.0)进行洗脱，采用自动收集器收集，待层析结束后，合并高峰管以内的各管收集液。将过SephadexG-10的活性峰馏分收集并浓縮后，用超滤柱除盐，进一步用HPLC分离纯化。实施例5:以上实施例所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法中，所述的HPLC操作步骤如下意溶剂预先过滤并脱气。)b.打开Waters泵开关以及系统电源。(注意紫外可见检测仪应预热30min)。c.向泵中充入新鲜溶剂(水乙腈)d.冲洗仪器1.将泵出口管导至废液瓶。2.将流量设在5mL/min，冲洗2min。若色谱柱以前使用过，则至少要使30mL溶剂通过此柱。设定分析条件，例如:流速，检测波长等。e.进样1.将卡住插塞的手柄扳至开位置，取下插塞。2.用微量进样器把所需体积的样品充入进样器中，插入插塞，并将卡住插塞的手柄板至关闭位置。3.将进样注射手柄板至注射位置。f.记录色谱图，打印色谱图。—经过对同类物质HPLC条件分析和摸索设定如下流动相系统表l副干酪乳杆菌抑菌肽类物质分离所用HPLC体系(上样量15pL)Table.2誦lThesystemofHPLC线性梯度^^~运行时间30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)0100%0%20/300%100%21/31100%0%实施例6:一种副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，包括1、副干酪乳杆菌产生的抗菌肽抑菌方法的确定a.将20ml水琼脂倒入12cm平板，作为下层培养基，待凝固后摆牛津杯；b.将新鲜的fi.s"6制成菌悬液10、fu/mL混入30mL牛肉膏培养基(0.75%琼脂)中，倒在水琼脂上，作为上层培养基；c.待上层培养基凝固后，轻轻的将牛津杯垂直拔出，在平板底部做好标记；d.用移液枪取12(HiL样品(分别为发酵上清液，浓縮10倍的发酵上清液，过柱后各馏分浓縮样，对应浓度的样品缓冲液)垂直点样孔点样；e.将平板在4'C正置30min，以使待检样品充分渗透进入培养基内，然后移入37'C培养箱中，正置培养16h后测量抑菌圈大小，拍照。2、抗菌肽的分离纯化方法2.1阳离子交换层析利用最高产肽方式发酵获得的发酵液在10，000g，4'C离心10min后，于4'C冷藏并尽快进行分离，发酵原液作为阳离子交换层析的样品。阳离子交换层析系统包括以下6个步骤a.离子交换介质处理；b.装柱与平衡；C.上样；d.洗脱；e.离子交换柱的再生；f.离子交换介质的再生。a.离子交换介质的处理将CMS印haroseFF原包装置于室温下，使其温度与室温相同，由于CMSepharoseFF储存于20X甲醇溶液中，需将甲醇溶液倾出，再用平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6,0)代替，达到总体积32.5mL(75XCMS印haroseFF;25%0.05M乙酸铵，pH6.0)。b.装柱与平衡取一只层析柱(16mmx200mm),先装入l/4高度、0.05M乙酸铵缓冲液(pH6.0),止住其流出，将上述处理好的CMSepharoseFF装入柱内，等其完全沉淀后，放开下端流出口，以同一缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，流速控制在10mL/min,等流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，即可上样分离。c.上样将离心后的发酵液上清原液上样，流速为3mL/min至饱和，上样量约70mL，然后用上述平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定为止。d.洗脱层析柱流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，用0.05M1M乙酸铵pH6.0以lmL/min梯度洗脱(分管收集)，此时采用自动收集器定时收集馏分。e.离子交换柱的再生当结束洗脱后，用0.05M乙酸铵(含12MNaCl，pH6.0)再生液以10mL/min流速冲洗层析柱，流量为100200mL，再生交换柱，然后此再生后的交换柱可以继续进行下一轮的洗脱。f.离子交换介质的再生当进行多次洗脱后，须将交换介质进行再生。先将离子交换柱再生(步骤e)，再用lMNaOH以1.3mL/min冲洗柱子，流量为100mL，最后用70%甲醇溶液以同样速度冲洗柱子，流量为80mL。用前再用100mL0.05M乙酸铵(pH6.0)冲洗，即可达到重复使用的要求。2.2凝胶层析经阳离子交换层析得到的有抑菌活性的馏分通过积累浓縮，首先通过SephadexG-50层析分离，之后将收集到的具抑菌活性的馏分通过S印hadexG画25进行再次分离，由于收集到的SephadexG-25洗脱峰I经多次浓縮得到，样液中含盐量较高，使用超滤离心管UFC(产品编号)卯0508在冷冻低温高速离心机4'C，4000g离心30min超滤除盐，同时收集流出液和保留液，将保留液通过SephadexG-10凝胶层析柱进一步分离纯化。凝胶层析系统包括以下4个步骤a.凝胶介质的选择及溶胀；b.装柱；C.上样；d.洗脱。a.凝胶介质的选择及溶胀选择颗粒均一，杂质含量低的凝胶介质，本实验选择的为S印hadexG-50/G-25/G-10。称取25g凝胶干粉放入500mL烧杯中，加入0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液(510倍体积)，在沸水浴中热溶涨12h，冷却至室温后，抽真空或高压灭菌脱去凝胶中残留的空气，备用。b.装柱取一直长度为100cm，内径为lcm的层析柱。洗净，在柱的下端用夹子夹住，向柱内装入1/4左右柱床体积的0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液，然后把溶涨处理好的凝胶浓浆，一次装入层析柱内，使凝胶慢慢沉降，当凝胶沉降至柱床高度的l/2时，打开下端，然后用0.05M乙酸铵(pH6.0)以0.8mL/min(SephadexG-25/G-50)或0.5mL/min(SephadexG-10)流速流动平衡。C.上样拧开柱上端的螺旋帽，待柱内的缓冲液下降至与凝胶表面相切。取适当体积的上一步骤分离到的有活性的馏分浓縮样品(3mLCMSepharoseFF分离馏分；2mLSephadexG-50/G-25分离馏分)溶液沿着管壁小心加在胶上面，用缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全进入凝胶，再加入几毫升缓冲液，然后拧紧柱上端的螺旋帽接口并与储液瓶连接，柱的出口端与紫外检测仪和自动收集器相连。d.洗脱在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸铵(pH6.0)进行洗脱，采用自动收集器收集，待层析结束后，合并高峰管以内的各管收集液。将过SephadexG-10的活性峰馏分收集并浓缩后，用超滤柱除盐，进一步用HPLC分离纯化。2.3HPLC选择Waters公司的HPLC系统，该系统包括Waters510HPLCpump(沃特斯510高效液相色谱泵)，WatersTM996PhotodiodeArrayDetector(沃特斯996紫外检测器)，Delta-PakC18300A5jim3.9x150mmHPLCColumn(Delta-PakTMC18300A(埃)5jim(微米)3.9x150mm(毫米)高效液相色谱柱)。HPLC操作步骤如下a.向贮液瓶中倒入足够当天操作用的溶剂(不同体积比的水一乙腈)。(注意溶剂预先过滤并脱气。)b.打开Waters泵开关以及系统电源。(注意紫外可见检测仪应预热30min)。c.向泵中充入新鲜溶剂(水乙腈)d.冲洗仪器1.将泵出口管导至废液瓶。2.将流量设在5mL/min，冲洗2mhi。若色谱柱以前使用过，则至少要使30mL溶剂通过此柱。设定分析条件，例如:流速，检测波长等。e.进样1.将卡住插塞的手柄扳至开位置，取下插塞。2.用微量进样器把所需体积的样品充入进样器中，插入插塞，并将卡住插塞的手柄板至关闭位置。3.将进样注射手柄板至注射位置。f.记录色谱图，打印色谱图。g.结束工作1.若流动相为酸和碱，用蒸馏水先冲洗至中性。2.1000%甲醇或乙腈洗至吸光度稳定，约半小时。h.关机。经过对同类物质HPLC条件分析和摸索设定如下流动相系统表l副干酪乳杆菌抑菌肽类物质分离所用HPLC体系(上样量15jiL)"""^"""*线性梯度"~"~"~~~~运行时间30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)20/300%100%21/31100%0%2.4抗菌肽的分离纯化结果本专利采用蛋白浓縮试剂盒对样品进行浓縮，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。SDS-PAGE对分离到抗菌肽进行分子量估测。MOLDI-TOF-MS和Q-TOF2实验测定氨基酸序列。2.5抗菌肽的分离结果经过如上方法的分离，由副干酪乳杆菌产生的抗菌肽得到良好的分离。CMS印haroseFF阳离子交换层析得到一个活性峰，见图1。继续用S印hadexG-50凝胶层析也得到一个活性峰，见图2;在S叩hadexG-25层析过程中，累积浓縮后通过蛋白质浓度测定得到峰II蛋白质含量极低判定其大部分为盐分子，而峰I蛋白含量较高，且有抑菌效果，见图3。用G25峰II馏分过G—10后，得到5个峰，只有峰2有明显的抑菌效果，见图4。对G-10峰2进一步用HPLC检测分析表明，其具有单一组份，也是我们所获得的组份。见图5。对各个分离步骤的抗菌肽进行蛋白浓度的检测结果见表2。表2蛋白质浓度步骤体积(mL')总蛋白(g/L)产率(％)发酵液上清原液700.108100%CMSepharoseFF0.03362.22%洗脱峰SephadexG-500.03152.08%SephadexG-25洗脱30.03081.22%峰ISephadexG-10洗脱10.01100.145%峰n随着洗脱步骤的增多，蛋白含量在逐渐减少。从而也分析出得到的抑菌物质18在发酵液上清中的含量是0.145%。说明此菌株虽然产抗菌肽含量不高，但其具有的抑菌活性却可在食品生产保藏中起到很强的抑菌作用。如对菌株进行改良，发酵条件进一步优化，提高其抗菌肽产量，将有望应用于食品防腐。经过电喷雾质谱(MOLDI-TOF-Ms和Q-TOF2)测定，该肽段质荷比为746.88的肽段序列为KSGYQCGFDEVFL，相对分子质量是1491.7444Da(道尔顿)。权利要求1.一种副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其组成包括选取副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，制作培养基，其特征是利用最高产肽方式发酵获得的发酵液在离心力10,000克，离心，冷藏并分离，发酵原液为阳离子交换层析的样品；经阳离子交换层析并过积累浓缩，使用超滤离心管在冷冻低温高速离心超滤除盐，同时收集流出液和保留液，将保留液通过分离纯化；高效液相色谱HPLC；采用蛋白浓缩试剂盒对样品进行浓缩，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，12-烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对分离到抗菌肽进行分子量估测，基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS和串联质谱Q-TOF2实验测定氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其特征是所述的制作培养基包括a.将20毫升水琼脂倒入12厘米平板，作为下层培养基，待凝固后摆牛津杯；b.将新鲜的枯草芽胞杆菌fi.s"6制成菌悬液107菌落形成单位/毫升)混入30毫升牛肉膏培养基(0.75%琼脂)中，倒在水琼脂上，作为上层培养基；c.待上层培养基凝固后，轻轻的将牛津杯垂直拔出，在平板底部做好标记；d.用移液枪取120微升样品(分别为发酵上清液，浓縮10倍的发酵上清液，过柱后各馏分浓縮样，对应浓度的样品缓冲液)垂直点样孔点样；e.将平板在4'C正置30分钟，以使待检样品充分渗透进入培养基内，然后移入37'C培养箱中，正置培养16小时后测量抑菌圈大小，拍照。3.根据权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其特征是所述的阳离子交换层析包括以下步骤a.离子交换介质处理；b.装柱与平衡；C.上样；d.洗脱a.离子交换介质的处理将弱阳离子交换树脂CMSepharoseFF原包装置于室温下，使其温度与室温相同，由于CMSepharoseFF储存于20X甲醇溶液中，需将甲醇溶液倾出，再用平衡缓冲液(0.05摩尔乙酸铵，pH6.0)代替，达到总体积32.5毫升(75%CMSepharoseFF;25%0.05M乙酸铵，pH6.0)。b.装柱与平衡取一只层析柱(16毫米x200毫米)，先装入l/4高度、0.05M乙酸铵缓冲液(pH6.0)，止住其流出，将上述处理好的CMSepharoseFF装入柱内，等其完全沉淀后，放开下端流出口，以同一缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分钟，等流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，即可上样分离；c.上样将离心后的发酵液上清原液上样，流速为3毫升/分钟至饱和，上样量约70毫升，然后用上述平衡缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定为止；d.洗脱层析柱流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出的基线稳定后，用0.05M1M乙酸铵pH6.0以1毫升/分钟梯度洗脱(分管收集)，此时采用自动收集器定时收集馏分。4.根据权利要求1或2或3所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其特征是所述的凝胶层析系统包括以下步骤a.凝胶介质的选择及溶胀；b.装柱；C.上样；d.洗脱a.凝胶介质的选择及溶胀选择颗粒均一，杂质含量低的凝胶介质，本实验选择的为葡聚糖凝胶层析SephadexG-50/G-25/G-10:称取25克g凝胶干粉放入500毫升烧杯中，加入0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液(510倍体积)，在沸水浴中热溶涨12小时，冷却至室温后，抽真空或高压灭菌脱去凝胶中残留的空气，备用；b.装柱取一直长度为100厘米，内径为1厘米的层析柱。洗净，在柱的下端用夹子夹住，向柱内装入1/4左右柱床体积的0.05M乙酸铵(pH6.0)缓冲液，然后把溶涨处理好的凝胶浓浆，一次装入层析柱内，使凝胶慢慢沉降，当凝胶沉降至柱床高度的1/2时，打开下端，然后用0.05M乙酸铵(pH6.0)以葡聚糖凝胶层析，0.8毫升/分钟(SephadexG-25/G-50)或0.5毫升/分钟(S印hadexG-lO)流速流动平衡；c.上样拧开柱上端的螺旋帽，待柱内的缓冲液下降至与凝胶表面相切。取适当体积的上一步骤分离到的有活性的馏分浓縮样品(3mLCMSepharoseFF分离馏分；2mLSephadexG-50/G-25分离馏分)溶液沿着管壁小心加在胶上面，用缓冲液(0.05M乙酸铵，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全进入凝胶，再加入几毫升缓冲液，然后拧紧柱上端的螺旋帽接口并与储液瓶连接，柱的出口端与紫外检测仪和自动收集器相连；d.洗脱在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸铵(pH6.0)进行洗脱，采用自动收集器收集，待层析结束后，合并高峰管以内的各管收集液。将过SephadexG-10的活性峰馏分收集并浓縮后，用超滤柱除盐，进一步用HPLC分离纯化。5.根据权利要求1或2或4或3所述的副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法，其特征是所述的HPLC操作步骤如下a.向贮液瓶中倒入足够当天操作用的溶剂，不同体积比的水一乙腈，并注意溶剂预先过滤并脱气；b.紫外可见检测仪应预热30分钟后，打开Waters公司生产的泵开关以及系统电源；c.向泵中充入新鲜溶剂水乙腈；d.冲洗仪器1.将泵出口管导至废液瓶；2.将流量设在5毫升/分钟，冲洗2分钟，若色谱柱以前使用过，则至少要使30毫升溶剂通过此柱；3。设定分析条件；e.进样1.将卡住插塞的手柄扳至开位置，取下插塞；2.用微量进样器把所需体积的样品充入进样器中，插入插塞，并将卡住插塞的手柄板至关闭位置；3.将进样注射手柄板至注射位置；f.记录色谱图，打印色谱图；经过对同类物质HPLC条件分析和摸索设定如下流动相系统表l副干酪乳杆菌抑菌肽类物质分离所用HPLC体系(上样量15jiL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>全文摘要副干酪乳杆菌产生的抗菌肽的分离纯化方法。目前抗菌肽的应用已成为生命科学领域的一个研究热点。本发明包括选取副干酪乳杆菌制作培养基，获得的发酵液在离心力10,000克，离心，冷藏并分离，经阳离子交换层析并过积累浓缩，使用超滤离心管在冷冻低温高速离心超滤除盐，同时收集流出液和保留液，将保留液通过分离纯化；高效液相色谱HPLC；采用蛋白浓缩试剂盒对样品进行浓缩，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，12-烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE对分离到抗菌肽进行分子量估测，基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS和串联质谱Q-TOF2实验测定氨基酸序列。本发明应用于抗菌肽的分离纯化。文档编号C12P21/02GK101451158SQ20071014473公开日2009年6月10日申请日期2007年12月4日优先权日2007年12月4日发明者凌宏志,刚宋,平文祥,李秀凉,杜春梅,葛菁萍,虹雷申请人:黑龙江大学