一种干酪乳杆菌发酵过程及终产物中抗菌肽快速检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速检测微生物发酵产物抗菌肽的方法。该抗菌肽，来源于干酪乳杆菌，该抗菌肽提取物具有广谱的抑菌活性且抑菌活性较高、分子量小、热稳定性强，可代替抗生素添加到饲料中，预防畜禽各类细菌性疾病的发生，从而达到保护人体健康的目的。本发明可用于干酪乳杆菌发酵过程和终产物中抗菌肽的生物量测定以及快速检测。目前的检测方法费时费力还需如HPLC这样的大型设备，本发明方法具有灵敏度高、特异性强、准确度高、所需时间短等优点，对干酪乳杆菌发酵条件和产品质量的控制、产品的使用以及衍生产品的开发有实际应用意义。
【专利说明】
一种干酪乳杆菌发酵过程及终产物中抗菌肽快速检测方法
技术领域
[0001] 本发明可用于干酪乳杆菌发酵过程以及终产物中抗菌肽的检测技术，属于免疫检 测领域。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平和健康水平的不断提高，人们对绿色食品的需求越来越大，消 费者更关心食品的安全性。目前世界各国，尤其是欧洲、日本等发达国家都在大力研究和开 发高效安全的天然生物防腐剂。随着研究的深入，国内外学者们发现细菌素具有非常优良 的特性。对细菌素产生菌的研究，目前主要集中于乳酸菌属中，乳酸菌几乎每个属中的每个 种，甚至每一株菌都能产生一种甚至几种细菌素。
[0003] 干酪乳杆菌是一种可以调节动物肠内菌群平衡、促进消化吸收的益生菌，发酵产 生具有抑菌谱广、无抗原性、对热稳定的抗菌肽(细菌素），其对革兰氏阴性和阳性病原菌具 有良好的抑制和预防作用。它还是一种益生菌，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫 力，促进营养物质吸收等多种功能，被广泛地应用于食品发酵和防腐方面、乳制品中、医疗 保健等领域。特别是可以利用农副产品原料，发酵干酪乳杆菌，制备成干酪乳杆菌饲料添加 剂，替代抗生素，添加于畜禽饲料，制成绿色饲料，达到调节畜禽肠道菌群平衡，抑制畜禽各 类病原菌的繁殖，预防各类细菌性疾病的发生，提高畜产品品质，保护人们的身体健康的目 的，也是目前公认的一类具有潜在开发能力的天然生物性食品防腐剂。
[0004] 但是在我国干酪乳杆菌的工业化程度还较低，菌种以及发酵剂等多来至国外厂 商，没有形成大规模的产业链，因此干酪乳杆菌行业具有很大的发展空间。申请号： 2015107183493,发明名称为"一种干酪乳杆菌抗菌肽的合成和抗体制备"，公开了一种干酪 乳杆菌的发酵液所产抗菌肽的合成和多克隆单体的制备。但是对于具体的发酵液中抗菌肽 含量快速精确的检测，未有进一步的研究。目前对于抗菌肽的检测方法费时费力还需要如 HPLC这样的大型设备，因此为了适应大规模发酵生产中对抗菌肽含量检测的迫切需要，建 立一种快速、灵敏、易行的检测抗菌肽含量的方法至关重要。不仅可用于抗菌肽发酵过程和 产品质量的控制，而且对产品的使用以及衍生产品的开发也具有重要的指导意义。该技术 的关键在于能够快速的检测出抗菌肽在生产过程中和终产物中的量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速检测干酪乳杆菌发酵产生的抗菌肽的检测方法， 可用于生产中以及终产物中抗菌肽的快速检测以及生物量的测定。
[0006] 本发明的技术方案如下： 1.抗原的制备:采用质谱仪对得到的细菌素进行结构分析，采用固相化学合成法，用多 肽自动合成仪合成人工干酪乳杆菌抗菌肽。在合成所述多肽序列时，在其C端增加一个半胱 氨酸，以方便与载体蛋白偶联。多肽与KLH偶联(偶联剂为Sulfo-SMCC)作为免疫抗原，多肽 与BSA偶联(偶联剂为戊二醛)作为检测抗原。
[0007] 2.多克隆抗体的制备:多肽与KLH偶联(偶联剂为Sulfo-SMCC)作为免疫抗原，免疫 新西兰白兔，利用现有的多克隆抗体制备与纯化技术获得多克隆抗体，该抗体可与抗原特 异性结合。
[0008] 3. ELISA 操作方法： (1)包被过程:将抗原稀释为0.25yg/mL，加入酶标板中，每孔10yL，4°C过夜。（2)封闭酶 标反应孔:将包被液弃去，用TOST洗板3次后，每孔加入200yL封闭液(5%脱脂奶粉），37 °C封 闭1.5h，弃去封闭液，用TOST满孔洗涤3遍，每遍3min。（3)建立标准曲线以及抗菌肽含量测 定:将抗体稀释5000倍，将抗原分别稀释为0.25，0.5，1，1.5，2，4yg/mL。抗体和不同浓度的 抗原各50yL加入酶标孔，以及抗体和不同的样品（培养基、干酪乳杆菌发酵的上清液以及 菌体抗菌肽提取液、其他菌种发酵的上清液)各50yL加入酶标孔，37 °C孵育1.5h。（ 4)加入酶 标抗体：用PBST洗板5次后，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，每孔100yL，加入酶标 板，37°C孵育此。（5)显色反应：用PBST洗板5次后，加入每孔100yL的TMB进行显色反应，37 °C暗处放置15min。（ 6)终止反应:每孔加入50yL2M浓硫酸终止反应。（7)结果判断:终止反应 后立即采用450nm波长检测。
[0009] 4.所需试剂： (1) 0·01Μ PBS缓冲液(ρΗ=7·4) NaCl 8g KC1 0.2g Na2HP04 1.42g KH2PO4 0 · 27g 加超纯水定容至lOOOmL (2) roST洗涤液 在上述roS缓冲液中加入0.5mL Tween-20 (3) 封闭液5%脱脂奶粉 脱脂奶粉 lg 超纯水 20mL (4) 抗原稀释液0.05M CBS(pH9.6) Na2C03 1.5g NaHC03 2.93g 超纯水 lOOOmL (5) 抗体稀释液 PBS缓冲液 (6) 显色液TMB购于SIGMA (7) 终止液2M的H2S〇4 本发明的优点在于建立了一种快速、灵敏、易行的检测干酪乳酸杆菌抗菌肽在生产过 程中以及终产物中量的方法，这对抗菌肽的大规模生产以及产品的使用和衍生产品的开发 具有重要的指导意义。
【附图说明】
[0010]图1抗菌肽检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0011] 1.标准曲线的建立、培养基背景测定、发酵液和菌体中抗菌肽含量测定、特异性实 验 按照配方配制MRS、玉米(pH6.0)、玉米(pH6.5)、豆柏（pH6.0)、豆柏（pH6.5)培养基，分 装后灭菌待用。将干酪乳杆菌按照百分之二的接种量接种于上述培养基中，放于28°C培养 48h后各取2mL离心取上清，放于4°C待测。取40mL离心弃上清，加入40mL PBS混匀，使用超声 破碎仪破碎至菌体裂解，离心后取上清，放于4° C待测。在玉米(pH6.0)培养基中分别按百分 之二的接种量，接种副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌BT-14、 大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。放入28° C培养箱培养48h后离心取上清，放入4° C待 测。
[0012] 1)包被过程：将抗原稀释为0.25yg/mL，每孔10yL加入酶标板中，置于4°C冰箱过 夜。
[0013] 2)封闭酶标反应孔:次日取出酶标板，将包被液弃去，用PBST每孔300yL洗板3次每 次3min，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，每孔加入200yL封闭液(5 %脱脂奶粉），37 °C封闭1.5h， 弃去封闭液用PBST每孔300yL洗板3次每次3min。
[0014] 3)建立标准曲线以及样品测定:将抗体稀释5000倍，将抗原分别稀释为0.25,0.5， 1，1.5，2,4yg/mL。将抗体和不同浓度的抗原各50yL，以及抗体和不同的样品（培养基、干酪 乳杆菌发酵的上清液、干酪乳杆菌菌体抗菌肽提取液、其他菌种发酵的上清液)各50yL加 入酶标孔37°C孵育1.5h。
[0015] 4)加入酶标抗体：用TOST洗板5次后，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，每 孔l〇〇yL，加入酶标板，37°C孵育lh。
[0016] 5)显色反应：用TOST洗板5次后，加入每孔100yL的TMB进行显色反应，37°C暗处放 置15min〇
[0017] 6)终止反应:每孔加入50yL2M浓硫酸终止反应。
[0018] 7)结果判断：终止反应后立即采用450nm波长检测，标准曲线测定结果见表一，标 准曲线见图1。培养基、干酪乳杆菌发酵的上清液以及菌体抗菌肽提取液测定结果见表二。 其他菌种发酵的上清液见表三。
[0019] 2.结果分析 1) 由图1可知，在0.25~4yg/mL的抗原浓度之间，所得数据线性关系良好，该方法准确性 尚。
2) 培养基的0D45Q值相当于空白对照，各培养基的0D45Q值差异不大，对于比较各培养基 抗菌肽的含量时没有较大影响，要使所测样品结果更准确则应减去空白对照对应的抗菌肽 含量。
[0021] 3)由表二干酪乳杆菌发酵的上清液测定结果，可知玉米培养基中抗菌肽含量较 多，特别是玉米(PH6.0)培养基中最多，豆柏培养基中抗菌肽含量比玉米少比MRS多。出现这 个结果可能是由于培养基对干酪乳杆菌产抗菌肽有一定影响，也可能是干酪乳杆菌在MRS 中生长量远低于玉米和豆柏培养基。
[0022] 4)干酪乳杆菌菌体内抗菌肽含量测定所得结果见表二。可见抗菌肽含量很少，所 测得0D值太大，超过了标准曲线范围，所以计算出的抗菌肽含量仅作参考，不能作为真正的 准确值。
[0023] 5)由表三可知，在玉米(pH6.0)培养基中副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢 杆菌、苏云金芽孢杆菌BT-14、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的发酵上清液0D45Q值都 很大，并且已超过标准曲线范围，可认为几乎检测不出该抗菌肽，而在同样的培养基中干酪 乳杆菌的发酵上清液中可检测出1.013yg/mL (若减去培养基的背景值则为0.755yg/mL)的 抗菌肽。由此结果可知，该检测方法的特异性强。
注:上清液中抗菌肽含量为微克每毫升发酵的上清液，菌体中抗菌肽含量为微克每毫 升 PBS。
[0025]
3.发酵前后菌体计数 1)菌种活化:将干酪乳杆菌按百分之二的接种量接种于MRS培养基中，放于28° C培养 36h后对干酪乳杆菌进行计数。
[0026] 2)菌体接种;将干酪乳杆菌按照百分之二的接种量接种于MRS、玉米(pH6.0)、玉米 (口册.5)、豆柏(？册.0)、豆柏(？册.5)培养基中，放于28°(：培养。
[0027] 3)发酵后菌体计数:将上述接种后的培养基放于28° C培养48h后对干酪乳杆菌进 行计数，计数结果见表二。
[0028] 4)结果分析：由表二可知，干酪乳杆菌在各培养基培养48h后，除了MRS中的菌体数 量较少，其他培养基菌体数量差异不大。
【主权项】
1. 本发明的目的是提供一种抗菌肽的快速检测方法，可用于发酵过程和终产物中抗菌 肽的测定，该抗菌肽，来源于干酪乳杆菌，抑菌谱广，抑菌效果明显，热稳定性和pH稳定性 强。2. 权利要求书1所述快速检测法的特征在于，其中包括该抗菌肽标准溶液和特异性抗 体，可用于干酪乳杆菌发酵过程和终产物中抗菌肽的生物量测定以及快速检测，并且具有 灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。3. 权利要求书2所述抗菌肽的特异性抗体为本人申请号：2015107183493,发明名称为 "一种干酪乳杆菌抗菌肽的合成和抗体制备"所制备的多克隆抗体。4. 本发明提供的一种抗菌肽快速检测方法的步骤为:将抗原稀释为0.25yg/mL，加入酶 标板中，每孔1〇μL，4°(：过夜，将包被液弃去，用PBST洗板3次后，每孔加入20(^封闭液(5%脱 脂奶粉），37°C封闭1.5h，弃去封闭液，用TOST满孔洗涤3遍，每遍3min，将抗体稀释5000倍， 将抗原分别稀释为0.25，0.5，1，1.5，2，4yg/mL，抗体和不同浓度的抗原各50yL加入酶标 孔，以及抗体和不同的样品（培养基、干酪乳杆菌发酵的上清液以及菌体抗菌肽提取液、其 他菌种发酵的上清液)各50此加入酶标孔，37 °C孵育1.5h，结束后用PBST洗板5次，加入辣根 过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，每孔l〇〇yL，加入酶标板，37 °C孵育lh，结束后用TOST洗板5 次后，加入每孔l〇〇yL的TMB进行显色反应，37°C暗处放置15min，结束后每孔加入50yL 2M浓 硫酸终止反应，终止反应后立即采用450nm波长检测。
【文档编号】G01N33/68GK106018823SQ201610332233
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】赵建, 彭静珊, 李宁浙, 吴道艳, 易思君, 曹玫
【申请人】四川大学