一种干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用
【专利摘要】本发明公开了属于牧草饲料加工贮藏技术领域的一种干酪乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。所述的干酪乳杆菌的菌株为LC，分类命名为Lactobacillus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No.10472。所述的干酪乳杆菌从苜蓿青贮饲料中分离得到，是一株新的干酪乳杆菌。所述的干酪乳杆菌能明显提高苜蓿青贮的发酵品质，且具有发酵效率高、成本低廉等优点，可应用于我国优质苜蓿青贮饲料的生产中。CGMCC No. 1047220150130
【专利说明】
-种干酪乳杆菌及其在首着青胆中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于牧草饲料加工胆藏技术领域，特别设及一种干酪乳杆菌及其在首猜青 胆中的应用。
【背景技术】
[0002] 紫花首猜(Medicago sativa)是目前国内外栽培面积较大的牧草之一。紫花首猜 不仅产量高，且草质优良，富含维生素、矿物质等营养元素，平均蛋白含量可达20 %，各种畜 禽均喜食。然而在中国首猜的主要种植区，其第2、3巷首猜刈割期正值雨季，频繁降雨使首 猜水分散失缓慢，干草品质下降，甚至失去饲喂价值;相比之下，青胆便于机械化操作，受气 候条件影响较小。青胆首猜作为首猜产品的一种重要形式，不仅能解决我国首猜干草加工 及雨淋造成的损失，而且能增加首猜草产品的多样性，延长青绿多汁饲料的利用。
[0003] 紫花首猜由于可溶性碳水化合物(WSC)含量低，附着乳酸菌数量少等原因，常规青 胆难W成功。很多添加剂被用来促进首猜青胆的发酵过程，其中研究最广泛的就是乳酸菌 青胆添加剂。与传统的化学添加剂相比，乳酸菌剂具有生态安全、应用简易，成本低廉的特 点。添加乳酸菌剂可确保首猜青胆发酵初期充足的乳酸菌数，促进乳酸发酵，降低pH值，抑 制梭菌发酵，使首猜青胆快速达到稳定。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，其目的在于提供一株干酪乳杆菌及其在首猜青胆中 的应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0006] 一种干酪乳杆菌，所述的干酪乳杆菌菌株为LC，分类命名为Lactobaci Ilus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中屯、的保藏号为CGMCC No. 10472。
[0007] 所述的干酪乳杆菌的16S rDNA基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[000引所述的干酪乳杆菌的生物学特性为：菌株在MRS固体培养基上30°C培养4她，生长 良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落;菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆 状、无芽抱;氧化酶阴性，具有较强的生长及产酸性能;在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能 生长，在10°(：条件下呈现微弱生长，在15°(：-45°(：条件下生长状况良好，在不大于6.5%化(：1 的条件下生长状况良好。
[0009] 所述的干酪乳杆菌在制备首猜青胆饲料中应用。
[0010] 所述首猜青胆饲料的制备方法为:在首猜中接种干酪乳杆菌LC后，将其在15-25C 下固体厌氧发酵30-60d即可。
[0011] 所述的干酪乳杆菌LC的接种量为:每克首猜中接种IO5-IO6C化干酪乳杆菌LC。
[0012] 所述的干酪乳杆菌在制备首猜青胆饲料添加剂中的应用。
[0013] 所述的首猜青胆饲料添加剂为制备首猜青胆饲料中添加的菌剂。
[0014] 所述首猜青胆饲料添加剂的制备方法为:将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中， 在溫度为30-37°C的条件下，厌氧培养18-24h;
[001引所述的MRS液体培养基的成分为：10.Og L-嗜白腺、10.Og L-I牛肉膏、5.Og L-I酵 母膏、2.0gL-l巧樣酸氨二锭、20.0gL-l葡萄糖、1.0gL-l吐溫-80、5.0gL-l乙酸钢、2.0gL -1憐酸氨二钟、0.58g L-I硫酸儀和0.化g L-I硫酸儘；
[0016] 所述MRS液体培养基的初始抑值为6-7。
[0017] 本发明的有益效果为:与自然的首猜青胆饲料相比，每克首猜中接种IO6C化的干 酪乳杆菌LC后，首猜青胆饲料的抑明显降低，乳酸含量提高58.6%，氨态氮降低24.5%，大 肠菌数量明显降低，明显提高了首猜青胆的发酵品质；同时干酪乳杆菌LC具有发酵效率高、 成本低廉等优点，可应用于绿色环保生物饲料的生产中。
[0018] 生物材料保藏说明
[0019] 分类命名：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei);菌株编号：LCo
[0020] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0021] 保藏机构简称:CGMCC
[0022] 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0023] 保藏日期:2015年1月30日
[0024] 保藏中屯、登记入册编号:CGMCC No. 10472。
【附图说明】
[0025] 图1:干酪乳杆菌LC在MRS液体培养基中生长时MRS液体培养基pH值的变化曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，W下的实施例便于更好地理解本 发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所用的 材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 实施例1:干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC的分离与鉴定
[002引取北京地区首猜青胆20g，加入ISOmL蒸馈水，用震荡器震荡30min，l0-i-l0-6梯度 稀释。分别从各梯度稀释液中取ImL至培养皿中，加入IO-ISmL灭菌后的MRS固体培养基，摇 匀，待其冷却凝固，静置厌氧培养4她，挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度有明显差别的单 菌落，重复划线，直至得到纯菌落。
[0029] 对分离筛选得到的菌株进行鉴定，根据菌株的细胞形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列进行综合分析，鉴定菌株为干酪乳杆菌(XactobaciIlus casei)，命名为LC， 是一株新的干酪乳杆菌。
[0030] 菌株LC的生物学特性为:LC菌株在MRS固体培养基上培养2地，菌株生长良好，可形 成边缘整齐的乳白色菌落;菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽 抱;氧化酶阴性，具有较强的生长及产酸性能。
[0031] 将菌株LC接种于MRS液体培养基中37°C培养4她后，按1.5%的比例接种到灭菌后 的200mL MRS液体培养基中，置于37 °C培养箱中培养，每化取样测定MRS培养基的pH值，并在 600nm下测定其吸光度，结果如图1所示。从图中可知，菌株LC在MRS液体培养基中培养24h 后，MRS液体培养基的抑值低于4.0。
[0032] 根据GB4789.35-2010对菌株不同碳源的同化能力进行检测，其对碳源发酵的实验 结果如表1所示；16S rDNA基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0033] 主1
[0034]
[0035]
[0036] 注："+"为阳性；为阴性。
[0037] 实施例2:干酪乳杆菌化actobacillus casei)LC在不同抑、溫度及盐浓度环境条 件下的生长测定
[003引用Imol L-I的盐酸和Imol L-I的氨氧化钢将MRS培养基的起始抑值分别调至3.0、 3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,37°(：恒溫静置培养干酪乳杆菌1〔2地，培养过程中不调 酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结果显示，干酪乳杆菌LC能够在 起始P册.5-P册.0的条件下生长。
[0039] 将活化的干酪乳杆菌LC接种于MRS液体培养基，分别在溫度为10°C、15°C、20°C、30 °C、40°C和45°C的条件下培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结 果显示，干酪乳杆菌LC在溫度为10°C的环境下呈现微弱生长，在15°C-45°C条件下生长状况 良好。
[0040] 将活化的干酪乳杆菌LC分别接种于含3wt%和6.5wt%NaCl的MRS液体培养基中培 养2地，用分光光度计测定600nm处光吸收值，结果如表2所示。结果显示，干酪乳杆菌LC能够 在含3wt %和6.5wt % NaCl的条件下生长。
[0041] 表2:干酪乳杆菌LC在不同环境条件下的生长情况
[0042]
[0043]
[0044] 注：V'为阳性；"-"为阴性；V为弱阳性。
[0045] 实施例3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC制备首猜青胆饲料
[0046] 紫花首猜:为安徽蛛璋秋实草业基地种植的维斯顿紫花首猜，刈割时期为现蕾期。
[0047] 1、制备菌粉
[004引无菌条件下，取干酪乳杆菌LC接种于MRS液体培养基中，于37 °C下培养18-24h，得 到干酪乳杆菌LC菌悬液;离屯、得到干酪乳杆菌LC菌体后，加入灭菌的脱脂奶，混匀后冻干， 得到LC含量大于IX IOi2Cfu g-i的菌粉。
[0049] 取0. 1000 g左右的菌粉，加入ImL灭菌后的生理盐水，逐级稀释，分别取 ImL稀释液至培养皿中，加入灭菌后的MRS固体培养基，混匀冷却，凝固后37 °C厌氧培养48h， 计数，W此计算出每克菌粉的活菌数。
[0050] 2、设两个处理(每个处理3次重复，结果W平均值形式表示）
[0051] 处理1 (首猜中接种干酪乳杆菌LC青胆）：取1000 g首猜，惊晒至含水量为55%左右， 然后按每克首猜接种IO6C化的干酪乳杆菌LC，取适量步骤1制备的LC菌粉，加5mL蒸馈水溶 解活化20-30min，均匀喷洒到首猜草上，混匀后取320g装入500ml青胆桶，密封后室溫存放。 [0化2] 处理2(首猜自然青胆）：取1000 g首猜，惊晒至含水量为55%左右，加入与处理1同 样体积的不含干酪乳杆菌LC的蒸馈水，均匀喷洒到首猜上，混匀后取320g装入500ml青胆 桶，压实密封后室溫存放。
[0053]密封6(W时开封，记录各处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产 物中的活菌数；同时测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成和氨态氮占总氮的百分比。 有机酸组成及含量测定条件为:采用色谱柱Column Type:化Odex RS化k KC-811，柱溫:50 。(：，流速：1.0ml min-i，流动相:3mmol 1-1肥1〇4，注入样品量:5yl，旋光性:非极性，UV检测器 210nm〇
[0化4] 3、实验结果
[0055] 测定结果如表3所示。结果表明：与自然青胆相比，接种干酪乳杆菌LC后首猜青胆 的抑明显降低，乳酸含量提高58.6%，氨态氮降低24.5%，大肠菌数量明显降低，明显提高 了首猜青胆的发酵品质。
[0056] 表3.自然青胆和接种干酪乳杆菌LC首猜青胆的干物质含量（％ )、pH值、有机酸(g kg-i〇M)、
[0057] 氨态氮（％总氮)及微生物含量(log Cfu g可M)结果
【主权项】
1. 一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌菌株为LC，分类命名为 Lactobacillus casei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC No. 10474。2. 根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌的16S rDNA 基因序列如SEQ ID No. 1所示。3. 根据权利要求1所述的一种干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌的生物学特 性为:菌株在固体培养基上30°C培养48h，生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落;菌株革 兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢;氧化酶阴性，具有较强的生长及 产酸性能;在起始pH值为3.5-8.0的培养基上能生长，在10 °C的条件下呈现微弱生长，在15 °C -45 °C条件下生长状况良好，在不大于6.5 % NaCl的条件下生长状况良好。4. 权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料的制备方法为:在苜蓿 中接种干酪乳杆菌LC后，将其在15-35 °C下固体厌氧发酵30-60d。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的干酪乳杆菌LC的接种量为:每克苜 蓿中接种IO5-IO 6Cfu的干酪乳杆菌IX。7. 权利要求1-3任一项所述的干酪乳杆菌在制备苜蓿青贮饲料添加剂中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的苜蓿青贮饲料添加剂为制备苜蓿青 贮饲料中添加的菌剂。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述苜蓿青贮饲料添加剂的制备方法为： 将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在温度为30-37°C的条件下，厌氧培养18-24h; 所述的MRS液体培养基的成分为：10.Og L-1蛋白胨、10.Og L-1牛肉膏、5.Og L-1酵母膏、 2.0g L-1梓檬酸氢二铵、20.0g L-1葡萄糖丄Og L-1吐温-80、5.0gL-1乙酸钠、2.0g L-1磷酸 氢二钾、0.58g IZ1硫酸镁和0.25g IZ1硫酸锰； 所述MRS液体培养基的初始pH值为6-7。
【文档编号】A23K30/18GK105925500SQ201610298630
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】玉柱, 张庆, 侯建建, 杨富裕
【申请人】中国农业大学