一株副干酪乳杆菌及其应用
【专利摘要】一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，命名为副干酪乳杆菌AR-93，其保藏编号为CGMCC 9443。该副干酪乳杆菌AR-93可作为低脂酸奶发酵剂以及作为提取胞外多糖的原料。本发明的副干酪乳杆菌AR-93在发酵低脂酸奶过程中产酸较为缓慢，使得酸奶产品酸度柔和，风味饱满。发酵所得的低脂酸奶粘稠。本菌株产生的胞外多糖能够显著改善酸奶的组织状态等质构特性，减少乳清析出，使产品无需添加稳定剂，满足消费者对无添加低脂酸奶的需求。CGMCC No.944320140711
【专利说明】
一株副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物，特别涉及一株副干酪乳杆菌及其应用。 技术背景
[0002] 酸奶是一种利用特定的乳酸菌经发酵培养生产的凝乳制品，营养价值较高，风味 良好，而且酸奶可以改善肠道内微生态群落结构，增强机体的免疫力，具有多种活性功能。 目前，酸奶生产成为我国液态乳中除巴氏杀菌乳之外增产最快的乳制品之一。随着肥胖和 糖尿病等疾病的增多，消费者对健康饮食的意识也逐渐提高，而常规乳制品中脂肪的含量 已经引起人们较多的关注，人们更愿意倾向于低脂乳制品。
[0003] 乳脂肪对于形成乳制品特有的质构、风味和口感有重要作用。低脂酸奶由于脂肪 含量较低，常常出现粘稠度低、组织状态粗糙、乳清析出、口感差等不良现象。因此，单纯减 少配料中的乳脂含量会降低产品的可接受性。乳酸菌胞外多糖（EPS)是指乳酸菌在其生 长、代谢过程中分泌到胞外的荚膜多糖或粘液，其成分和结构复杂，可以作为增稠剂、稳定 剂、持水剂等应用于食品、制药等诸多领域。在乳制品中，胞外多糖生产菌及其产生的胞外 多糖具有的粘性、稳定性，可以有效地改善发酵乳的流变学特性和质构特性，避免乳清析 出；同时，可以改善润滑感和风味。高产胞外多糖乳酸菌可以有效地结合酸奶中多余的水 分，提高酸奶的粘度，并且降低机械加工过程对酸奶产品的质构损伤，减少产品的脱水收缩 缺陷。
[0004] 此外，高产胞外多糖菌株所产的胞外多糖还具有良好的生理功能，乳增强肠黏膜 吸附能力，调节免疫力、降低胆固醇和血压等。因此，开展高产胞外多糖乳酸菌的筛选工作， 对于改善乳制品的生产加工、开发特色的酸奶制品，具有非常重要的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，就是针对现有技术中缺乏高产胞外多糖的乳酸菌的不足，提供一 株能够高胞外多糖的副干酪乳杆菌及其应用，本发明的菌株在适宜条件下发酵低脂牛奶， 发酵后得到的酸奶酸度柔和，风味饱满，质构良好。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一株副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)，命名为副干酷乳杆菌AR-93,该菌株已于2014年7月11日 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号）保藏，其保藏编号为CGMCC 9443,其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 上述副干酪乳杆菌AR-93筛选自开菲尔颗粒。对开菲尔颗粒进行分离筛选，利用 梯度稀释法，将稀释后的样品液涂布于MRS平板，37°C恒温培养，挑选产粘性能好的菌落， 经过划线分离后对分离获得的高产粘菌株进行形态观察，结合发酵实验筛选确定高产胞外 多糖菌株。本发明所述菌株高产胞外多糖，其胞外多糖产量为206. 4mg/L。
[0008] 副干酪乳杆菌AR-93作为低脂酸奶发酵剂的应用。
[0009] 上述副干酪乳杆菌AR-93作为低脂酸奶发酵剂的应用，方法如下：
[0010] (1)将副干酪乳杆菌AR-93进行活化；
[0011] (2)将活化后的菌种按5-10%的接种量接种于含低脂牛乳的容器中，37°C静置发 酵至凝乳，4°C后发酵16h，得到低脂酸奶。
[0012] 步骤（1)中所述的活化是指：将保藏于脱脂牛乳培养基中的副干酪乳杆菌AR-93 按5%接种量接入灭菌脱脂乳培养基中，37°C静置培养48h进行活化。
[0013] 利用本发明筛选出的副干酪乳杆菌AR-93发酵低脂酸奶，酸度柔和，极少乳清析 出，低脂酸奶粘度为3060mPa*s，酸奶持水力为20. 9%，酸度为80° T。利用本发明的菌株 进行低脂酸奶发酵，可以有效地保持酸奶的质构，提高酸奶的稳定性。
[0014] 副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用。
[0015] 上述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，是将副干酪乳杆菌 AR-93的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯乙酸法沉淀除去沉淀蛋 白，然后用醇沉淀法沉淀，取沉淀溶解于水后再用水透析，得到胞外多糖。
[0016] 所述离心以除去菌体和凝结蛋白的离心条件是4°C、9000g、离心20min。
[0017] 所述的副干酪乳杆菌AR-93的发酵液是将副干酪乳杆菌AR-93以5% (v/v)的接 种量接种于脱脂乳粉在37°C条件下培养40h而得到的发酵液。
[0018] 所述三氯乙酸法是在上清液中添加三氯乙酸至终浓度4% (w/v)，静置过夜；4°C、 9000g、离心20min除去沉淀蛋白。
[0019] 所述醇沉淀法是加乙醇至终浓度75% (v/v)，4°C静置24h ;4°C、9000g、离心20min 取沉淀。
[0020] 本发明筛选出的副干酪乳杆菌AR-93在发酵低脂酸奶过程中产酸较为缓慢，使得 酸奶产品酸度柔和，风味饱满。发酵所得的低脂酸奶粘稠，本菌株产生的胞外多糖能够显著 改善酸奶的组织状态等质构特性，减少乳清析出，使产品无需添加稳定剂，满足消费者对无 添加低脂酸奶的需求。本发明提供的高产胞外多糖乳酸菌株及其低脂酸奶发酵过程简单， 可以实现大规模工业化应用。
【附图说明】
[0021] 图1为副干酪乳杆菌AR-93的菌落图；
[0022] 图2为副干酪乳杆菌AR93的生长曲线。
[0023] 具体实施方法
[0024] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材 料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选 择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0025] 下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、 试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K2HP042g/L，柠 檬酸二铵 2g/L，乙酸钠 5g/L，葡萄糖 20g/L，吐温 801mL，MgS04 ? 7H200. 58g/L，MnS04 ? 4H20 0? 25g/L，琼脂 20g/L，调节 pH 至 6. 4。
[0027] 脱脂牛乳培养基：脱脂乳粉100g/L，115°C灭菌15min。
[0028] 实施例1副干酪乳杆菌AR93的筛选与鉴定
[0029] 1. 1样品稀释液制备及菌株分离
[0030] 采集来自西藏牧区的开菲尔颗粒，碾碎，加入15mL无菌水，剧烈震荡20min。采用 浓度梯度稀释法（10-1-10-4)，取稀释液100uL涂布于MRS琼脂培养基平板上，37°C厌氧培 养48h，挑选菌落大、生长快、挑丝粘度大的菌株，进一步划线分离纯化。
[0031] 1.2菌株初筛
[0032] 将步骤1. 1中挑丝粘度大的菌株接种至MRS液体培养基中，37°C静置培养24h，制 备成种子液，按照5 %的接种量接入灭好菌的MRS液体培养基中，37°C静置培养48h，测定发 酵液中胞外多糖含量，实验结果如表1所示。
[0033] 表1初筛菌株胞外多糖含量
[0034]
[0035] 1. 3菌株复筛
[0036] 1. 3. 1凝乳实验
[0037] 将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌，按5%接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中， 37°C培养48h进行活化，活化后的菌株接种于含5mL低脂牛乳培养基试管中，37°C静置培 养至牛乳凝固，按8%的接种量接种于含150mL低脂牛乳三角瓶中，37°C静置培养至牛乳凝 固，观察并记录凝乳状态及时间。
[0038] 1.3. 2粘度的测定
[0039] 粘度的测定：采用流变仪（博力飞公司DV-III+型）。在4°C下测试粘度，转子型 号为RV5,分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样， 结果计算算术平均值。
[0040] 1. 3. 3感官评定
[0041] 如表2所示，通过感官评定，得到一株凝乳快、质地粘稠并且风味优良的菌株，编 号为AR-93。
[0042] 表2复筛菌株特性评价结果
[0045] 1. 4菌株鉴定
[0046] 将分离得到的一株菌命名AR93,菌落如图1所示，呈椭圆形或类圆形，边缘整齐， 菌落大小一般为2~3mm，乳白色。通过16SrDNA序列对比分析，结果显示该序列与NCBI 数据库中副干酪乳杆菌的同源性达99%，可以鉴定该菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)，命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)AR_93,该副干酪乳杆菌 AR-93菌株已于2014年7月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）保藏，其编号为CGMCC 9443。
[0047] 1. 5菌株生长特性
[0048] 将活化好的副干酪乳杆菌AR-93按1% (v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37°C 静置培养24h，每隔2h在600nm测定培养液的菌浓。以菌浓对时间作图得到菌株AR-93在 MRS中的生长曲线，其结果如图2所示。实验结果表明，副干酪乳杆菌AR-93在MRS培养基 中生长迅速，在2h左右进入对数期，10h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长 产酸，pH不断降低，进入稳定期。
[0049] 实施例2用副干酪乳杆菌AR-93制备低脂酸奶
[0050] 将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌AR-93,按5 %接种量接入灭菌脱脂牛乳培 养基中，37°C静置培养48h进行活化。活化后的菌株按5%的接种量接种于150mL低脂牛 乳三角瓶中，37°C静置培养至牛乳凝固，4°C保持16h，得到不需添加增稠剂的酸奶。所得酸 奶的酸度柔和，极少乳清析出，低脂酸奶粘度为1347mPa ? s，酸奶持水力为15. 7%，酸度为 77oT〇
[0051] 实施例3副干酪乳杆菌AR-93制备低脂酸奶
[0052] 将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌AR-93,按5 %接种量接入灭菌脱脂牛乳培 养基中，37°C静置培养48h进行活化。活化后的菌株按8%的接种量接种于150mL低脂牛 乳三角瓶中，37°C静置培养至牛乳凝固，4°C保持16h，得到不需添加增稠剂的酸奶。所得酸 奶的酸度柔和，极少乳清析出，低脂酸奶粘度为3060mPa ? s，酸奶持水力为20. 9 %，酸度为 80oT〇
[0053] 实施例4副干酪乳杆菌AR-93制备低脂酸奶
[0054] 将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌AR-93,按5 %接种量接入灭菌脱脂牛乳培 养基中，37°C静置培养48h进行活化。活化后的菌株按10%的接种量接种于150mL低脂牛 乳三角瓶中，37°C静置培养至牛乳凝固，4°C保持16h，得到不需添加增稠剂的酸奶。所得酸 奶的酸度柔和，极少乳清析出，低脂酸奶粘度为2824mPa ? s，酸奶持水力为19. 5%，酸度为 84oT〇
[0055] 实施例5副干酪乳杆菌AR-93胞外多糖的提取
[0056] (1)菌种活化：将副干酪乳杆菌AR-93菌种接种于MRS液体培养基中，在37°C条件 下培养12-16h进行活化，连续活化两代。
[0057] (2)种子培养：副干酪乳杆菌AR-93经活化后，接种于脱脂乳中，115°C灭菌15min 后，在37°C条件下培养14-16h至凝乳，连续培养活化两代，用作母发酵液。
[0058] (3)发酵培养：将副干酪乳杆菌AR-93以5% (v/v)的接种量接种于脱脂乳中，在 37°C条件下培养40h。
[0059] (4)EPS的提取纯化：将上述制备的发酵液首先经过沸水浴lOmin，以失活可降解 多糖的酶，然后离心（20min，9000g，4°C )除去菌体和凝结蛋白，上清液浓缩至原体积的 1/3,添加80% (w/v)三氯乙酸至终浓度4% (w/v)，静置过夜，离心（20min，9000g，4°C) 除去沉淀蛋白，浓缩液加95% (v/v)乙醇至终浓度75% (v/v)，4°C静置24h，离心（20min， 9000g，4°C )，取沉淀去离子水溶解，离心（20min，9000g，4°C )去沉淀，上清液去离子水透析 72h，每8h换水一次，冷冻干燥得粗多糖样品。
[0060] 序列表 <110>丨?.海评丨:人学 <1:20> 一株副干酪乳杆菌及其应用 <160> 1 <170> Fatentln version <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213>副干骼乳杆菌AR"93: <400> 1
【主权项】
1. 一株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)，命名为副干酪乳杆菌AR-93,其保 藏编号为CGMCC 9443,其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 副干酪乳杆菌AR-93作为低脂酸奶发酵剂的应用。3. 根据权利要求2所述的副干酪乳杆菌AR-93作为低脂酸奶发酵剂的应用，其特征在 于： 应用方法如下： (1) 将副干酪乳杆菌AR-93进行活化； (2) 将活化后的菌种按5-10%的接种量接种于含低脂牛乳的容器中，37°C静置发酵至 凝乳，4°C后发酵16h，得到低脂酸奶。4. 根据权利要求3所述的副干酪乳杆菌AR-93作为低脂酸奶发酵剂的应用，其特征在 于：步骤⑴中所述的活化是指：将保藏于脱脂牛乳培养基中的副干酪乳杆菌AR-93按5% 接种量接入灭菌脱脂乳培养基中，37 °C静置培养48h进行活化。5. 副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用。6. 根据权利要求5所述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，其特征 在于：将副干酪乳杆菌AR-93的发酵液煮沸后离心以除去菌体和凝结蛋白，上清液用三氯 乙酸法沉淀除去沉淀蛋白，然后用醇沉淀法沉淀，取沉淀溶解于水后再用水透析，得到胞外 多糖。7. 根据权利要求6所述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，其特征 在于：所述离心以除去菌体和凝结蛋白的离心条件是4°C、9000g、离心20min。8. 根据权利要求6所述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，其特征 在于：所述的副干酪乳杆菌AR-93的发酵液是将副干酪乳杆菌AR-93以5% (v/v)的接种 量接种于脱脂乳粉在37°C条件下培养40h而得到的发酵液。9. 根据权利要求6所述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，其特 征在于：所述三氯乙酸法是在上清液中添加三氯乙酸至终浓度4% (w/v)，静置过夜；4°C、 9000g、离心20min除去沉淀蛋白。10. 根据权利要求6所述副干酪乳杆菌AR-93作为提取胞外多糖的原料的应用，其特 征在于：所述醇沉淀法是加乙醇至终浓度75% (v/v)，4°C静置24h ;4°C、9000g、离心20min 取沉淀。
【文档编号】C12R1/245GK105820968SQ201510005280
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月4日
【发明人】艾连中, 夏永军, 王光强, 任玮, 陈卫, 郭本恒
【申请人】上海理工大学