一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法。本发明通过基因工程克隆?构建?重组获得了一株产壳聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115?LX菌株，由该菌株按照本发明的发酵培养方法进行发酵培养获得的发酵液壳聚糖酶酶活可达500～1000U/ml，酶活性很高，无需提纯，可直接用于壳聚糖的降解。在壳寡糖的工业化生产领域具有广阔的应用前景。CGMCC No.1066020150323
【专利说明】
一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法。属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是一种直线型的多糖，由0-(l，4)-D-氨基葡萄糖组成。在自然界中，这种聚 合物部分是乙酰化的。事实上，壳聚糖用来广泛的描述聚合物，这种聚合物由D-氨基葡萄糖 和N-乙酰-D氨基葡萄氨残基组成。
[0003] 壳聚糖大分子的分子量通常在几十万左右，因其分子中内外氢键的相互作用，只 能溶于少数的稀酸溶液中，而不能溶于水中。壳寡糖是利用壳聚糖为原料，通过生物工程技 术降解制备获得的2~10个氨基葡萄糖以0_(1，4)糖苷键连接而成的寡聚糖。由于壳寡糖分 子量小，水溶性好，易吸收，功能作用强，生物活性高等特点，在国外素有人体第六大生命要 素、软黄金之美誉，作为新世纪前瞻性生物技术产品，其在医药、功能性食品、日化、农业、饲 料添加等领域具备广泛的应用前景。
[0004]壳聚糖水解酶主要有壳聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非专一性水解酶等。壳聚 糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，能特异性将壳聚糖水解成聚合度为2~8的壳寡糖，是制备 壳寡糖的主要研究方向。
[0005] 目前制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法，采用化学法降解寡糖得率 低，产物分离困难，而且对环境污染严重。酶解法则具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成 环境污染等优点。所以如何获得高效的壳聚糖酶是目前行业的迫切需求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供了一株产壳聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-LX株(本发明简称重组菌GS115-LX株）；
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述巴斯德毕赤酵母GS115-LX株高效产酶的发酵培 养方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实施的：
[0009] 1.一株壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX株，该菌株 已于2015年03月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 10660。
[0010] 2.壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母GS115-LX株经发酵培养后发酵液酶活可达500 ~1000U/ml ;
[0011] 3.权利要求2所述的壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母GS115-LX株的发酵产酶的培 养方法如下：
[0012] (1)发酵过程中所用培养基配方：
[0013] 1)固体培养基:酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1 ? 8%，加水至100%，pH 自然，115 °C灭菌20min;
[0014] 2)摇瓶种子培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至 100%，pH自然，115°C灭菌20min;
[0015] 3)基础盐培养基:85%磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加 水至总体积为1L，121°C灭菌3 0m i n;
[0016] 4)补料培养基：甲醇。
[0017] (2)发酵培养方法：
[0018] 1)斜面培养
[0019] 将GS115-LX菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后置于恒温 培养箱中在温度28~30 °C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面培养物；
[0020] 2)种子培养
[0021] 使用接种环取一环步骤1)得到的斜面培养物接种到摇瓶种子培养基中，然后置于 恒温摇床中培养，在温度28~30°C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养物； [0022] 3)发酵培养
[0023 ]按照以发酵培养基(基础盐培养基)体积计1 %~2 %接种量，将步骤2)得到的种子 培养物转接至发酵罐的发酵培养基中，然后恒温28~30°C，控制转速300r/min，压力 0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，向发酵罐中补加甲醇，补加的总量约为初始发酵液 体积的25%~30%，再继续培养2~3天，发酵结束。发酵结束所得到的发酵液酶活可达500 ~1000U/ml 〇
[0024]本发明【具体实施方式】
[0025] 1 ?菌种
[0026] 本发明获得该菌株的具体方法如下：
[0027] 对产壳聚糖酶假单胞菌L2菌株（自行采集)的壳聚糖酶编码基因choAl进行序列优 化后，构建重组表达质粒PPIC9K-LX并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia 口881:〇1^8)63115株 (由河北农业大学植物保护学院获赠）所得，该株菌命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)GS115-LX菌株，并已于2015年03月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No. 10660。巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同 源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，外源基因稳定性很好。
[0028] choA基因来源于假单胞菌L2菌株并通过PCR扩增得到，扩增引物分别为：
[0029] choAFl: 5' -CAGGCTACGACCCCCCAC-3'(序列 1)
[0030] choARl: 5' -TCACTGCCACGACATGTTCTTC-3'(序列2)，
[0031] 引物设计依据McchoA基因序列，PCR扩增使用FastPfu DNA聚合酶。PCR产物纯化后 加A，并克隆到pMD18_T载体上得到P18t_choA载体。测序后choA与GenBank中的序列比对。缺 失信号肽序列的choA基因序列，通过在线稀有密码子分析软件和毕赤酵母密码子丰度数据 库分析优化choA序列密码子，并在毕赤酵母中异源表达（http : //www. kazusa . or . jp/ codon/) mRNA的结构使用在线RNA二级结构软件进行预测(http: //www. genebee .msu. su/ services/rna2_reduced.html)。人工完成密码子丰度平衡、GC含量和RNA二级机构后，choA 序列优化完成。合成优化后的choA序列并可溶到pUC57载体上，得到载体pUC-choA-opt。优 化与未优化两个序列以合成的DNA或pl8T-choA质粒为模板通过PCR扩增得到，扩增所用引 物为：
[0036] 表达His标签的序列通过反向引物插入到PCR产物中。将得到的PCR产物克隆到毕 赤酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和AvrII位点之间，得到载体p9K-choA_opt和p9K-choA_un (未优化）；利用通用引物测序后(5 ' A0X1正向引物测序:5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 '（序 列7)，载体利用限制性内切酶SacI或Dral线性化并通过电转化转入到毕赤酵母GS115感受 态细胞中。通过SacI载体线性化后的载体转化后，得到Mut+的转化子，（甲醇利用型His+Mut + )在毕赤酵母基因组中插入到A0X1基因中：然而，Bgin线性化后的载体得到了Muts转化子 (慢性甲醇利用His+Mut s)，重组置换A0X1基因。转化后，在MD培养基上通过各种浓度的G418 筛选，30°C培养2天。
[0037] 菌株性状特征:菌落呈圆形，乳白色，表面光滑。
[0038] 该菌株表达的壳聚糖酶为胞外酶，存在于上清中，且纯度较高，杂蛋白较少，去菌 体留发酵液上清即可使用。
[0039]菌株保存方法:40 %甘油管-20 °C保藏6个月，40 %甘油管-80 °C保藏2年。
[0040] 2.本发明还涉及所述基因工程菌GS115-LX株高效产酶的发酵方法。
[00411 (1)该发酵方法涉及的培养基如下：
[0042] 1)固体培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至100%， 115°C 灭菌 20min;
[0043] 2)摇瓶种子培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至 100%，115°C灭菌20min;
[0044] 3)基础盐培养基:85 %磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加 水至总体积为1L，121°C灭菌3 0m i n;
[0045] 4)补料培养基：甲醇。
[0046] (2)该培养方法具体步骤如下：
[0047] 1)斜面培养
[0048] 将GS115-LX菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后置于恒温 培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面菌种；
[0049] 2)种子培养
[0050]使用接种环取一环步骤1)得到的斜面培养物接种到摇瓶种子培养基中，然后置于 恒温摇床中培养，在温度28~30°C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养物； [00511 3)发酵培养
[0052]按照以发酵培养基(基础盐培养基)体积计1 %~2 %接种量，将步骤2)得到的种子 培养物转接至发酵罐的发酵培养基中，然后恒温28~30°C，控制转速300r/min，压力 0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，向发酵罐中补加甲醇，补加的总量约为初始发酵液 体积的25%~30%，再继续培养2~3天，发酵结束。发酵结束所得到的发酵液酶活可达500 ~1000U/ml〇
[0053]本发明涉及的微生物资源信息
[0054] 本发明涉及一株产壳聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115-LX株，该菌株是对产壳聚糖酶假单胞细菌L2的壳聚糖酶编码基因choAl进行序列优 化后，构建重组表达质粒PPIC9K-LX并转化至巴斯德毕赤酵母GS115所得，该株菌被命名为 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX株，并已于2015年03月23日送交北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 10660。
[0055]产壳聚糖酶假单胞细菌L2
[0056]假单胞菌L2本发明人2012年由河北分离获得的一株产壳聚糖酶的菌株，该菌株最 适合的培养条件为28°C，pH6.8,可利用葡萄糖、麦芽糖、甘油等碳源，该菌株可以利用氨态 氮，不可以利用硝态氮和尿素，同时该菌株不产生纤维素酶和淀粉酶。巴斯德毕赤酵母 GS115株，该菌株为分子生物学领域所常用的宿主菌株，是由河北农业大学植物保护学院获 赠。
【附图说明】
[0057]图1本发明涉及的高效壳聚糖酶产生菌构建原理示意图。
[0058]本发明的积极意义
[0059] 本发明涉及一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法。本发明通过基因工程克隆-构建-重组获得了一株产壳聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母GS115-LX株，由该菌株按 照本发明的发酵培养方法进行发酵培养获得的发酵液壳聚糖酶酶活可达500~1000U/ml， 酶活性很高，无需提纯，可直接用于壳聚糖的降解。在壳寡糖的工业化生产领域具有广阔的 应用前景。 实施例
[0060] 下面，通过具体的实施例对本发明进行更具体的描述，但本发明的范围并不仅限 于此；
[0061] 在下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为业内人士所熟识的常规方 法。
[0062] 在下述实施例中所使用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径购 买得到。
[0063] 仪器说明：恒温培养箱:型号GHX-9080B金坛市瑞华仪器有限公司
[0064]恒温摇床:型号QHZ-98A太仓华美生化仪器厂
[0065]发酵罐系统一一镇江东方生物工程设备技术有限责任公司
[0066] 实施例1
[0067] --GS115-LX菌株的发酵培养(100L罐）
[0068]培养基成分：
[0069] 1)固体培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1 ? 8%，加水至100%， 115°C 灭菌 20min;
[0070] 2)摇瓶种子培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至 100%，115°C灭菌20min;
[0071] 3)基础盐培养基:85 %磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加 水至总体积为1L，121°C灭菌3 0m i n;
[0072] 4)补料培养基：甲醇。
[0073]在以后的实验中，培养基的配方不改变，均使用此培养基。
[0074] 首先，斜面培养，将GS115-LX菌株保藏的甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基 的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面菌 种；
[0075] 然后，使用接种环取一环GS115-LX菌株斜面菌种接种到摇瓶种子培养基中，然后 置于恒温摇床中培养，在温度28~30 °C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养 物；
[0076] 100L罐发酵培养，将发酵培养基(基础盐培养基)按罐体积40%的装液量进行称料 后灭菌，将制备好的种子液按发酵液体积的2%进行无菌接种，接种后设置培养条件，恒温 28~30°C，控制转速300r/min，压力0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，开始向发酵罐 中缓慢补加甲醇，本罐补加的总量为10.5L，再继续培养2天；
[0077] 酶活检测，取发酵液100ml，10000r/min离心5min，取上清液用常规的DNS法检测酶 活，经检测壳聚糖酶酶活达675U/ml，发酵结束。
[0078] 实施例2
[0079] --GS115-LX菌株的发酵培养(100L罐）
[0080]培养基成分：
[0081 ] 1)固体培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2 %，琼脂1.8 %，加水至100 %， 115°C 灭菌 20min;
[0082] 2)摇瓶种子培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至 100%，115°C灭菌20min;
[0083] 3)基础盐培养基:85 %磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加 水至总体积为1L，121°C灭菌3 Om i n;
[0084] 4)补料培养基：甲醇。
[0085] 在以后的实验中，培养基的配方不改变，均使用此培养基。
[0086] 首先，斜面培养，将GS115-LX菌株保藏的甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基 的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面菌 种；
[0087] 然后，使用接种环取一环GS115-LX菌株斜面菌种接种到摇瓶种子培养基中，然后 置于恒温摇床中培养，在温度28~30 °C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养 物；
[0088] 100L罐发酵培养，将发酵培养基(基础盐培养基)按罐体积40%的装液量进行称料 后灭菌，将制备好的种子液按发酵液体积的2%进行无菌接种，接种后设置培养条件，恒温 28~30°C，控制转速300r/min，压力0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，开始向发酵罐 中缓慢补加甲醇，本罐补加的总量为12L，再继续培养2天；
[0089] 酶活检测，取发酵液100ml，10000r/min离心5min，取上清液用常规的DNS法检测酶 活，经检测壳聚糖酶酶活达981U/ml，发酵结束。
[0090] 实施例3
[0091 ] --GS115-LX菌株的发酵培养(500L罐）
[0092]培养基成分：
[0093] 1)固体培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至100%， 115°C 灭菌 20min;
[0094] 2)摇瓶种子培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至 100%，115°C灭菌20min;
[0095] 3)基础盐培养基:85 %磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加 水至总体积为1L，121°C灭菌3 0m i n;
[0096] 4)补料培养基：甲醇。
[0097] 首先，斜面培养，将GS115-LX菌株保藏的甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基 的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面菌 种；
[0098] 然后，一级种子培养，使用接种环取一环斜面菌种接种到摇瓶种子培养基中，然后 置于恒温摇床中培养，在温度28~30 °C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养 物；
[00"] 100L罐中的二级种子培养，将种子培养基按照罐体积40%的装液量称量培养基后 灭菌，然后将一级种子液按罐液体积的2%进行无菌接种，接种后设置培养条件，温度28~ 30°C，转速300r/min，压力0 ? 05MPa，通风比0 ? 5vvm，培养1天后，转接至发酵罐；
[0100] 500L罐发酵培养，将基础盐培养基按罐体积的40%的装液量称量培养基后灭菌， 然后将培养好的二级种子液按罐液体积的2%进行无菌接种，接钟后设置培养条件，温度28 ~30°C，转速300r/min，压力0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，开始向发酵罐中缓慢 补加甲醇，本罐补加的总量为50L，再继续培养2天；
[0101] 酶活检测，取发酵液l〇〇ml，10000r/min离心5min，取上清液用常规的DNS法检测酶 活，经检测壳聚糖酶酶活达875U/ml，发酵结束。
【主权项】
1. 一株壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115_LX菌株，该菌株已 于2015年03月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 10660。2. 如权利要求1所述一株壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母GS115-LX株，其特征在于该 菌株经发酵培养后发酵液壳聚糖酶酶活可达500~1000U/ml。3. 如权利要求2所述的一株壳聚糖酶产生菌巴斯德毕赤酵母GS115-LX株的发酵产壳聚 糖酶的培养方法如下： (1) 发酵过程中所用培养基配方： 1) 固体培养基：酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2 %，琼脂1.8 %，加水至100 %，pH自 然，115 °C 灭菌 20min; 2) 摇瓶种子培养基:酵母浸粉1 %，蛋白胨1 %，葡萄糖2%，琼脂1.8%，加水至100 %，pH 自然，115 °C灭菌20min; 3) 基础盐培养基:85 %磷酸10ml，硫酸钙3g，硫酸钾3g，七水硫酸镁5g，甘油20g，加水至 总体积为1L，121°C灭菌3 0m i η; 4) 补料培养基：甲醇； (2) 发酵培养方法： 1) 斜面培养将GS115-LX菌株甘油管菌种接种于试管斜面固体培养基的斜面上，然后 置于恒温培养箱中在温度28~30°C的条件下斜面培养2~3d，得到斜面培养物； 2) 种子培养使用接种环取一环以上的斜面培养物接种到摇瓶种子培养基中，然后置 于恒温摇床中培养，在温度28~30°C与转速180r/min的条件下培养1~2d，得到种子培养 物； 3) 发酵培养按照以发酵培养基(基础盐培养基)体积计1%~2%接种量，将以上得到 的种子培养物转接至发酵罐的发酵培养基中，然后恒温28~30°C，控制转速300r/min，压力 0.05MPa，通风比0.5vvm，培养1~2天后，向发酵罐中补加甲醇，补加的总量约为初始发酵液 体积的25%~30%，再继续培养2~3天，发酵结束。发酵结束所得到的发酵液酶活可达500 ~1000U/ml〇
【文档编号】C12N9/42GK105820966SQ201510906780
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年12月10日
【发明人】苏海榆, 孙杉杉, 徐志文
【申请人】领先生物农业股份有限公司