絮凝包含真菌的发酵液的方法

专利名称：絮凝包含真菌的发酵液的方法
技术领域：
本发明涉及一种改进包含真菌的培养液的絮凝作用的方法。另外，本发明涉及一种改进下游加工能力的方法。
背景技术：
在产业中用真菌表达目的产物时，产率的最优化是一个关键因素。通过改进生产菌株的生产能力和/或改进目的产物的下游回收率能够改善这一点。低回收率可以被分为两类i)在初级分离和二级过滤期间通量低(lowflux)，和ii)滤液(filtrates)和制成品中出现沉淀物。主要问题是由于转鼓式过滤期间分离不彻底，培养液中微粒的存在，以及被继续带到下游处理步骤中的无机沉淀物的存在而引起的。通过絮凝作用可以改善下游加工步骤，但絮凝作用不是很适合真菌，尤其是丝状真菌，在丝状真菌中，生物质(biomass)由菌丝体形式的高度有组织的部分和难以用过滤除去的一定程度的胶状体组合组成。因此，仍需要研究出能改进真菌发酵期间所产生的目的终产品的下游回收率的步骤。
发明概述本发明通过在收获培养液以后，进行絮凝作用之前进行裂解(fragmentation)/碎裂步骤提供了这样一种改进下游回收率的方法，因此，我们要求一种从真菌发酵液中纯化细胞外目的产物的方法，包括a)对包含真菌的发酵液进行断裂/破裂步骤；b)絮凝发酵液；c)实施至少一个分离步骤。
发明详述在本发明中，通过在收获真菌发酵培养基以后，进行絮凝作用之前引入断裂/破裂步骤已经解决了上述的由于分离不彻底(poor separation)，例如转鼓过滤期间分离不彻底，以及转鼓滤液中微粒和被继续带到下游处理步骤中的无机沉淀物的存在而引起的问题。由于发酵液粒径差异大，因此很难对真菌发酵液只实施单独的絮凝步骤。
通常的尝试都集中在改进生产菌株的特性，从而改进它的絮凝性能上。
然而，在本发明中，在从发酵罐中收获发酵液之后，通过引入断裂/破裂步骤已经获得优良絮凝性能的真菌培养物。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种改进包含真菌的发酵液的絮凝作用的方法，其中，在絮凝之前实施断裂/破裂步骤。
若对真菌发酵液使用絮凝将使下游加工发生改进，因此将获得更优良的终产品产率和更高的初级分离能力。
本发明因此涉及一种从真菌发酵液中纯化细胞外目的产物的方法，包括a)对包含真菌的发酵液进行断裂/破裂步骤；b)絮凝得到的发酵液；和c)实施至少一个分离步骤。
分离步骤是常规分离步骤，包括不同种类的过滤和用于进一步浓缩的可能的蒸发。
碎裂/破碎作用参照本发明，真菌，尤其是其中生物质由菌丝体形式的高度有结构的部分和一定程度的胶状体组合组成的丝状真菌能够被裂解成在絮凝之后足以通过过滤除去的更小的片。
需要的裂解度取决于所选择的生产菌株的坚固性。在本发明的一个实施方案中，可以通过对发酵液施用剪切力来获得合适的裂解度。这种剪切力足以导致裂解，在一个实施方案中，通过混和，搅拌和/或抽吸来提供这种剪切力。
可以利用任何适合的混合器/搅拌器来提供混合和/或搅拌，其中可依照操作期间的流量来调整混合器/搅拌器的尺寸。对于象实验室发酵规模一样的小体积，可以使用手持混合器或者厨房搅拌器，对于生产规模中较大的发酵体积，象IKA Ultra TURRAXU混合器可能比较合适。泵也适合于给发酵液施加剪切力，而且也可如上所述，依照操作期间的流量来调节泵的功率。适于本发明的合适的泵的实例有高剪切泵(high shear pumps)和分散泵(dispersion pumps)，例如用于生产规模的IKA模型UTL-150和用于中试(pilot)规模的UTL-25。
依照本发明，可利用加热发酵液使真菌细胞壁破裂从而产生裂解，来提供其他的破碎方式。因此，在本发明的一个实施例中，通过加热来提供裂解/破碎。加热应至少超过34℃，更特别地超过39℃。由想得到的终产物来确定上限，选择将不会使产物被降解或丧失活性的温度作为上限。应当注意，为获得合适的裂解度，热处理通常需要一定的保持时间。
在另一个实施方案中，通过酶处理或化学处理来提供的断裂/破裂。这种酶或者化学制剂的实例可以是溶菌酶。
可以通过研究已成碎片的和未成碎片的发酵液样品来确定裂解度，例如通过显微镜来确定。依照本发明，典型的情况是真菌菌丝的平均长度将被降低到小于原有长度的70％，尤其是小于原有长度的60％，优选的是小于原有长度的50％，更优选的是小于原有长度的40％，进一步优选的是小于原有长度的30％。
絮凝在实施断裂/破裂步骤之后，优选将发酵液稀释25-300％。稀释的目的是通过增加悬浮粒子之间的距离，从而让聚合物(絮凝剂)能够与胶状体接触而使絮凝作用更容易进行。然而，过高的稀释将导致胶状体和聚合物之间接触不良。
絮凝剂选自盐和聚合物。絮凝剂可以是阳离子，阴离子和/或非离子絮凝剂。首先通过添加，例如氯化钙或铝盐来中和通常带负电的生物质。由于氯化钙带有正电荷，因此可作为电荷中和剂。当生物质的净电荷达到中性时，生物质将通过疏水性相互作用形成团，这是絮凝过程的第一步。加入的氯化钙的最少量应为36％溶液的0-5％v/v。加入铝盐引起的效果与钙的效果相似，但铝盐也可作为颜色粘合剂起作用。铝盐也会产生作为附加滤色镜的晶格(lattice)，但是这种作用很弱。加入的铝盐可以是100％溶液的0-2％(v/v)。
用氯化钙或铝盐或两者中和生物质之后，生物质的净电荷接近中性。阳离子聚合物结合这些成团的物质形成后来变得带正电荷的更大的粒子。加入的阳离子聚合物可达20％溶液的0-6％v/v。最后用阴离子聚合物将这些与阳离子聚合物结合的带明显正电荷的大粒子絮凝成更大些的大粒子，依需要加入的阴离子聚合物的量典型地是0.13％溶液的6-8％v/v。
依照本发明，在一个实施方案中，絮凝剂包含GC850(Gulbrandsen，SC，USA)，A130(Cytec Industries，NJ，USA)，C521Cytec(Industries，NJ USA)和CaCl2。
在本发明进一步的实施例中，联合使用了GC850和C521。在更进一步的实施例中，联合使用了CaCl2和C521。在更进一步的实施例中，联合使用了CaCl2和C521，而且pH被调节至7。
当参照本发明选择可使用的絮凝剂时，必须考虑发酵液的pH，因为pH的变化将改变生物质和加入的化学制剂的净电荷。在较低的pH，净电荷变为带更多正电荷，然而在较高的pH，净电荷变为带更多的负电荷。因此，用于生产的化学制剂的有效性决定了是否需要改变pH。
在一个实施方案中，没有调整pH，因此pH就是发酵液的pH。例如，在絮凝作用中使用GC850和热凝的情形。在进一步的实施例中，调整了pH。例如，在絮凝作用中使用C521和CaCl2的情形。
因此，在另一个实施例中，pH被调节到pH为4到8的范围内，特别地被调节到pH为5.5到7.0的范围内。
本发明的方法适合于改进絮凝作用和纯化目的产物，例如纯化真菌中产生的蛋白质。在一个特别的实施例中，真菌包含丝状真菌。
真菌可以从本领域已知的任何真菌获得目的产物，特别地，可以从本领域已知的任何丝状真菌获得目的产物。
在一个优选实施例中，可以从丝状真菌菌株中获得目的产物，例如从枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、耐热子囊属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌株，特别地，可以从尖刺曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、Aspergillus foetidus、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Fusariumbactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、镰刀菌谷虱螨(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、Fusariumnegundi、尖芽孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、网状镰刀菌(Fusariumreticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、Fusarium sarcochroum、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、类丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、Humicola lanuginosa、Mucor miehei、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株中获得目的产物。
在一个特别优选的实施方案中，可以从曲霉属，腐质霉属或木霉属，优选从米曲霉菌株，Humicola insolens菌株，或从瑞氏木霉(Trichodermareesei)菌株获得目的产物。
公众很容易从许多菌种保藏单位，例如美国典型微生物保藏中心(ATCC)，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和农业研究服务专利收藏，北方区域研究中心(NRRL)获得这些种的菌株。
对本发明来说，这里使用的与约定来源有关的术语″从...处获得″指通过该来源或已经插入了该来源的基因的细胞来产生有价值的化合物。
目的产物依照本发明，目的产物是细胞外产物。可以是抗菌素，例如青霉素或头孢菌素(cephalosporin)或红霉素(erythromycin)，或者是日用化学制剂，例如柠檬酸。有价值的化合物也可以是多肽，特别是治疗性蛋白质，例如胰岛素或酶(例如水解酶，转移酶，裂解酶，异构酶，或连接酶，特别是糖水解酶，纤维素酶，氧化还原酶，蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶或糖酶)。
在下面实施例中，更进一步地举例解释了本发明，但实施例决不是对本发明所要求的范围的限制。
实施例实施例1.絮凝方法的规程和工艺操作条件在分级分批培养丝状真菌黑曲霉(A.niger)生产淀粉葡萄糖苷酶时测试了本发明的絮凝方法。在收获以后，将采用絮凝作用的转鼓过滤机通量与未采用絮凝和/或热凝进行预处理的转鼓过滤机通量进行比较。
在预处理期间使用了下列参数稀释度(在调整水中)是150％，添加的GC850为20％溶液的0.5％(v/v)，加入的CaCl2的浓度为36％w/v溶液的1.5％(v/v)，加入的A130为0.13％w/v溶液的10％(v/v)。
在转鼓过滤机运行期间对介于6-12.2范围中间的NTU(比浊法浊度单位)值进行了测量。回收之前未进行絮凝作用的部分培养物的NTU值在15-32的范围中，但观察到的其他批次的NTU值在30-60的范围中。这表明混浊的降低是由絮凝作用引起的。进行了絮凝的部分培养物中的淀粉葡萄糖苷酶活性也改进了16.5％。
当施加絮凝时，在转鼓过滤期间观察到的通量与未施加絮凝时的通量相比有显著的改进。这相当于38-44％的改进。
产品参数的比较显示产品质量没有下降。
从施加和没有施加絮凝时实施的试验，可以设计出下表1中所示的絮凝条件总准则表1


以发酵液为基础表明以收获的培养液的体积为基础来计算百分比。
实施例2.大规模地测试本发明的方法分别利用下列B1，B2，B3，B4批次来对絮凝方法进行大规模地测试。使用的高剪切泵是由IKA-Machinenbau Janke & Knukel GmbH u.Co KGP79219 Staufen提供的ULTRA TURRAX型ULT-150NR95-1562。B1到B4的每一种培养物代表表达细胞外淀粉葡萄糖苷酶的黑曲霉培养物，以分级分批培养方式对培养物进行发酵。
在所有试验中都使用了下列安排方式进程图收获＝＞通过高剪切泵或分散泵分散＝＞预处理＝＞转鼓过滤＝＞抛光过滤(polish filtration)＝＞除菌过滤＝＞超滤＝＞蒸发＝＞保存和稳定化在上述进程图中，通过高剪切泵或分散泵分散代表本发明中破碎/碎裂步骤的一个实例。换句话说或作为补充处理方法，通过热凝或通过酶或化学处理也可以实现破碎。预处理步骤包含絮凝。
在收获期间没有添加CaCl2到发酵液中，并且在收获5-10小时后开始回收。在预处理期间，稀释度是200％，温度未调节，pH被磷酸或氢氧化钠调节到7.1。在预处理期间加入的CaCl2的浓度为36％溶液到2.1％(v/v)，加入的C521为18％溶液到1.8％(v/v)。在36m2的转鼓过滤机上实施转鼓过滤。用Perlite decalite 4208(Dicalite)作为转鼓过滤机和主体加料(body feed)的预涂层，在操作过程中加入的助滤剂为0-8％之间。将喷水量设置为2.0m3，转鼓过滤机转速设置20rpm。A130的量是0.13％(w/v)溶液的6.2％。用磷酸或氢氧化钠将转鼓内滤液的pH调节为4±0.2。在抛光过滤(polish filtration)期间，用Celite 512(World Minerals)作为预涂层和主体加料，过滤温度维持在35℃。用HS 200过滤器垫(Begerow)进行除菌过滤，过滤温度保持在5℃。在保持浓缩温度低于10℃的条件下，通过继续超滤对滤液进行浓缩，直到滤液折射指数达25(RI 25)，接下来在36℃的蒸发温度为下进行蒸发直到RI 47。在这些试验中生产的液体产物还没有熟化，因此所有批次都没有进行第二次过滤。在中试规模时会实施第二次过滤。
效率改善(up-scaling)方面在实验室试验中发现，预处理之前的一个关键参数就是裂解水平。在实验室试验期间，使用厨房搅拌器以确保发酵液的大小分布平均。在大规模试验期间，利用ULTRA TURRAX动力混合器来切割真菌的分支结构直至大小分布平均。在两种情况下，接下来的预处理和絮凝都完成得很好。在大规模实验期间，因为来源于泵，配管(piping)等的大量剪切力而实现了较好的搅拌混合，而且利用诸如用于生产规模的转鼓过滤机和用于实验室规模的滤纸可以实现较好的过滤。观察到滤液的NTU值比实验室试验中滤液的NTU值低已经说明这一点。
絮凝的坚固性是回收处理的一个关键方面。通过转鼓滤液的质量和获得的最大通量进行判断发现，在这些试验期间观察到的絮凝的坚固性似乎是精细的。
在实验室规模对絮凝后的发酵液进行了过滤测试，其中观察到高通量。尽管实验室试验到生产规模的设备总体布置存在差异，但在转鼓过滤期间也观察到全部批次的高通量。在转鼓过滤中对NTU进行了监控，并将其作为与实验室实验相比较时的过滤效率的评价指标。这表明这一方法的效果是可评估的。
在转鼓过滤期间观察到的最显著的差异是过滤期间絮凝作用除去微粒(fine particles)及其他生物质碎片的效率。没有进行絮凝的转鼓过滤显示涂层慢慢地被生物质碎片及其他微粒渗透。而这最终会使滤液的质量差，也会降低转鼓过滤机的利用度。
相反，当在试验期间施加絮凝作用时，没有观察到生物质碎片对涂层的渗透。因为预涂层的多孔结构保持开放，而且没有被生物质碎片污染，因此它对容量的影响是广泛的。高效除去生物质碎片及其他微粒确保了滤液的低NTU值，因此使下游的过滤更容易进行。
在全部的絮凝试验中，挑战了转鼓过滤机的容量和发酵液通量。将没有进行破碎和絮凝作用的转鼓过滤机通量与依照本发明获得的转鼓过滤机通量进行了比较。试验是在36m2的转鼓过滤机上进行的，通量逐渐增加。在正常回收(没有进行破碎和絮凝作用)时，平均发酵液通量在40-60L/(m2h)之间变化。在本发明的试验中，在转鼓过滤机上实现的最大发酵液通量是125L/(m2h)，并在转鼓管中保持稳定水平达1.5小时。在所有试验中，发酵液通量达到110(m2h)是可能的。这相当于通量改进至少90％。
虽然观察到容量改进和较高的滤液质量，但是过量的絮凝剂A130可以在某种程度上影响絮凝后的发酵液粘到转鼓预涂层上的能力。必须基于一个一个的实验(a case by case)来确定其适当用量。
利用在本发明的试验中观察到的通量计算出的平均处理时间(预处理和转鼓过滤)为14.90小时。与正常过程(没有絮凝作用)相比，利用平均值计算的预处理和初级分离时间缩短了最少10小时，这相当于缩短了40％。
随后在primus(空白过滤器)上进行的抛光过滤(polish filtration)和在HS 200过滤器垫上进行的除菌(germ)过滤都完成的比较好。通量通常都保持在10-20m3/h的较高范围。主要因为转鼓滤液的NTU值低，因此在试验的抛光或除菌过滤期间没有观察到任何问题。降低转鼓滤液的pH(从pH 7.1到pH 4.0)不会引发任何脂肪酸或无机盐沉淀。而且，在超滤或蒸发期间也没有遇到问题。在稳定化期间用稀释的磷酸再一次进行大的pH调整会引发胶状(jelly-like)的沉淀物，推测其可能为变性蛋白质。在批次B 3中观察到这一现象，但没有出现任何明显的产率损失。
在全部试验中，为了计算步产率(step yields)，以每单位操作方式对酶活性进行了测量。依照本发明的方法而改善的平均累积产率相当于产率改进大约10％。
转鼓过滤机中淤泥(sludge)的较少实质损失或超滤渗透活性下降能够解释观察到的产率增加。絮凝后的发酵液在转鼓过滤期间除去的淤泥更容易通过下水道排出，也就是说，絮凝后的发酵液的多孔结构似乎更开放。
表2中列出了所有步骤的节约(savings)情形。
表2估计的利用本发明的方法引入絮凝对生产淀粉葡萄糖苷酶(amyloglycosiloase)的可能的减少作用

权利要求
1.一种从真菌发酵液中纯化细胞外目的产物的方法，包括a)对包含真菌的发酵液进行断裂/破裂步骤；b)絮凝发酵液；c)实施至少一个分离步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中通过给发酵液施加剪切力来提供断裂。
3.权利要求1所述的方法，其中通过加热来提供断裂/碎裂。
4.权利要求1所述的方法，其中通过酶或化学处理来提供断裂/碎裂。
5.权利要求3所述的方法，其中发酵液被加热到34℃以上。
6.权利要求3所述的方法，其中发酵液被加热到39℃以上。
7.权利要求2所述的方法，其中通过搅拌，混和和/或抽吸来提供这种剪切力。
8.权利要求1所述的方法，其中通过加入絮凝剂来提供絮凝。
9.权利要求8所述的方法，其中絮凝剂选自盐和聚合物。
10.权利要求1所述的方法，其中发酵液的pH被调节到pH为5.5到7.0的范围内。
11.权利要求1所述的方法，其中真菌是丝状真菌。
12.权利要求11所述的方法，其中丝状真菌选自枝顶孢属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属和木霉属。
全文摘要
一种从真菌发酵液中纯化细胞外产物的方法，包括a)对包含真菌的发酵液进行断裂/破裂步骤；b)絮凝发酵液；c)实施至少一个分离步骤。
文档编号C12N1/16GK1902321SQ200480039604
公开日2007年1月24日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年10月31日
发明者本杰明·R·克努森, 普拉尚特·艾耶 申请人:诺维信公司