基因的重组表达与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种干酪乳杆菌来源的磷脂酶4基 因的重组表达及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶A2，英文名为phospholipaseA2，简写为PLA2，它可催化磷脂甘油分子二位 酰基水解生成溶血卵磷脂和游离脂肪酸，而溶血卵磷脂在食品、化妆品及医药领域中有重 要应用，日本已将其作为天然食品添加剂。因此，它是工业生产中一种重要的酶。
[0003]磷脂酶A2广泛存在于各种生物体内。其最早是由生物组织中直接提取，但存在提 取率低、操作复杂等问题。一些哺乳类动物磷脂酶A2基因已经被尝试在大肠杆菌、曲霉等 宿主菌中进行重组表达，但存在形成包涵体、表达量低达不到工业化应用等问题，同时，利 用这些表达宿主表达一些复杂的哺乳动物磷脂酶A2基因会存在一些限制，如无法完成相应 重组蛋白的后加工，这些表达宿主菌的遗传背景会限制重组酶的相关应用等，另外，有研宄 发现重组表达磷脂酶A2会对大肠杆菌，酵母等表达宿主发生毒害作用，从而限制了相应的 重组表达及应用。而将微生物来源的磷脂酶A2基因在乳酸克鲁维酵母中进行重组表达，可 以有效改善上述问题。现在国内外没有关于将微生物来源磷脂酶A2基因在乳酸克鲁维酵 母中进行重组表达的报道。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种干酪乳杆菌磷脂酶a2基因的 重组表达与应用。本发明根据克隆到的干酪乳杆菌磷脂酶a2基因，构建真核表达载体，利 用酵母表达系统表达了干酪乳杆菌磷脂酶a2基因，并研宄了不同发酵条件对重组菌株生长 及产酶影响。
[0005]本发明的技术方案如下：
[0006]干酪乳杆菌磷脂酶a2基因的重组表达方法，依次包括基因信号肽预测、重组载体 的构建、转化与筛选、表达产物的检测，重组菌产酶发酵；
[0007] 所述表达载体的构建是：根据NCBI公布的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因序列， signalP进行基因信号肽预测，利用特异性引物在成熟肽两端引入限制性酶切位点，将其亚 克隆到载体PKLAC1中，得到表达载体pKLACl-pla2.;
[0008] 所述转化与筛选是：用构建好的表达载体转化乳酸克鲁维酵母，筛选重组乳酸克 鲁维酵母菌株实现重组磷脂酶4的表达；
[0009] 所述表达产物的检测是：收集重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液，卵黄平板初步检 测酶活；
[0010] 所述重组菌产酶发酵发酵是：对重组乳酸克鲁维酵母进行摇瓶发酵培养，发酵条 件是：葡萄糖为1% -3%、酵母粉为1% -2%、蛋白胨为1% -3%、KH2P04S0. 1% -0. 3%、 接种量为1%-4%以及装液量70-100ml。优化的发酵条件是：葡萄糖为3%、酵母粉为2%、 蛋白胨为3 %、KH2P04S0. 3 %、接种量为2 %以及装液量90ml。
[0011] 干酪乳杆菌磷脂酶4基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达为分泌表达。
[0012] 所述的特异性引物是：
[0013] 以干酪乳杆菌基因组为模板，pla2-F/pla2_R为引物，引物两端分别引入XhoI 和BglII酶切位点，并在基因上游同时引入Kex酶切位点基因序列，扩增出未包含信号肽 的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因，即所述引物；
[0014] 所述引物序列为：
[0015] pla2-F:5, -CCGCTCGAGAAAAGAACGACTAAGACTGAGTTTAATG-3,；
[0016] pla2-R:5' -GGAAGATCTTCAACCACCAAACAACTTATATG-3'。
[0017] 本重组磷脂酶A2应用于食品、化妆品及医药等领域。
[0018] 本发明有益的技术效果在于：
[0019] 本发明利用克隆到的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因构建真核表达载体，以提供磷脂 酶A2的重组表达与应用。重组磷脂酶A2可应用于食品、化妆品及医药等领域。本发明通 过DNA重组技术，将干酪乳杆菌磷脂酶A2基因扩增出来，构建重组表达载体，实现了干酪乳 杆菌磷脂酶A2基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达，并研宄了不同发酵条件对重组菌株 生长及产酶影响，为磷脂酶A2的工业化生产及应用奠定了基础。
[0020] 本发明在乳酸克鲁维酵母中表达了干酪乳杆菌来源磷脂酶A2,卵黄平板初步检测 酶活，酸碱滴定法测定酶活大小，SDS-PAGE显示重组蛋白条带，说明表达成功。另外，通过 摇瓶发酵优化，重组磷脂酶A2酶活达可达到6. 56U/ml，为磷脂酶A2的工业化生产奠定了基 础。
[0021] 本发明的表达产物可应用于食品、化妆品及医药等领域，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0022] 图1 :是干酪乳杆菌磷脂酶A2氨基酸序列信号肽预测图；
[0023] 图2 :是重组表达载体酶切验证图；
[0024] 图3 :是卵黄平板法检测重组菌发酵上清磷脂酶A2酶活性图；
[0025] 图4 :是重组菌发酵上清表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图；
[0026] 图5 :是重组菌GG799/pKLACl-pla2发酵生长及产酶曲线；
[0027] 图6 :是钙离子浓度对重组酶磷脂酶A2酶活影响图；
[0028] 图7 :是碳源对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图；
[0029] 图8 :是氮源对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图；
[0030] 图9 :是无机盐对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图；
[0031] 图10 :是接种量对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图；
[0032] 图11 :是初始pH对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图；
[0033] 图12 :是装液量对GG799/pKLACl-pla2生长及产酶的影响图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图，对本发明进行具体描述。其中重组磷脂酶A2购自江南大学中国高 校工业微生物资源和信息中心，乳酸克鲁维酵母购自纽英伦生物技术有限公司。
[0035] 利用Kluyveromyces lactis GG799表达系统表达重组磷脂酶A2。
[0036] (1)干酪乳杆菌磷脂酶A2基因信号肽的预测：
[0037] NCBI上查得干酪乳杆菌磷脂酶^基因序列及相应编码的氨基酸序列，SignalP 4. lserver(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)对氨基酸序列进行信号肽预测， 预测结果如图1所示。
[0038] (2)重组表达载体pKLACl_pla2的构建：
[0039] 根据信号肽的预测结果，以干酪乳杆菌基因组为模板，pla2-F/pla2_R为引物，弓丨 物两端分别引入Xho I和BglII酶切位点位点，并在基因上游同时引入Kex酶切位点基因 序列，扩增出未包含信号肽的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因。将载体pKLACl和目的基因用Xho I和BglII分别酶切，胶回收，于16°C过夜连接，转化E.coliJM109。然后，提取JM109/ pKLACl-pla2菌株质粒，XhoI和BglII酶切验证，验证结果如图2所示，筛选出JM109/pKLACl-pla2阳性菌株。
[0040] (3)线性化质粒pKLACl_pla2电转化Kluyveromyces lactis GG799以及转化子的 筛选：
[0041] 提取JM109/pKLACl-pla2阳性菌株质粒，经Sac II线性化后电转化 Kluyveromyces lactis GG799,涂布YCB平板，乙酰胺筛选，3-4天挑取单菌落。通过玻璃珠 法提取重组菌染色体基因组，利用整合引物（见表1)进行PCR验证，筛选出成功整合目的 基因的多拷贝重组菌。
[0042] 表1引物
[0043]
【主权项】
1. 干酪乳杆菌磷脂酶A2基因的重组表达方法，其特征在于：依次包括基因信号肽预 测、重组载体的构建、转化与筛选、表达产物的检测，重组菌产酶发酵； 所述表达载体的构建是：根据NCBI公布的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因序列，SignalP进 行基因信号肽预测，利用特异性引物在成熟肽两端引入限制性酶切位点，将其亚克隆到载 体pKLACl中，得到表达载体pKLACl_pla2 ; 所述转化与筛选是：用构建好的表达载体转化乳酸克鲁维酵母，筛选重组乳酸克鲁维 酵母菌株实现重组磷脂酶4的表达； 所述表达产物的检测是：收集重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液，卵黄平板初步检测酶 活； 所述重组菌产酶发酵发酵是：对重组乳酸克鲁维酵母进行摇瓶发酵培养，发酵条件是： 葡萄糖为1% -3%、酵母粉为1% _2%、蛋白胨为1% -3%、KH2P04S〇. 1% -0. 3%、接种量 为1% -4%以及装液量70-100ml。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：干酪乳杆菌磷脂酶A 2基因在乳酸克鲁维 酵母中的重组表达为分泌表达。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的特异性引物是： 以干酪乳杆菌基因组为模板，pla2-F/pla2-R为引物，引物两端分别引入Xho I和 Bgl II酶切位点，并在基因上游同时引入Kex酶切位点基因序列，扩增出未包含信号肽的干 酪乳杆菌磷脂酶A2基因，即所述引物； 所述引物序列为： pla2-F :5' -CCGCTCGAGAAAAGAACGACTAAGACTGAGTTTAATG-3' ； pla2-R :5' -GGAAGATCTTCAACCACCAAACAACTTATATG-3'。
4. 根据权利要求1所述的干酪乳杆菌磷脂酶A 2基因的重组表达方法，其特征在于： 所述重组菌产酶发酵的发酵条件是：葡萄糖为3%、酵母粉为2%、蛋白胨为3%、KH 2PO4S 0. 3%、接种量为2%以及装液量90ml。
5. 根据权利要求1所述的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因的重组表达方法，其特征在于：重 组磷脂酶A2应用于食品、化妆品及医药等领域。
【专利摘要】干酪乳杆菌磷脂酶A2基因的重组表达方法，依次包括基因信号肽预测、重组载体的构建﹑转化与筛选﹑表达产物的检测，重组菌产酶发酵；首先根据干酪乳杆菌磷脂酶A2基因序列，signalP进行基因信号肽预测，利用特异性引物在成熟肽两端引入限制性酶切位点，将其亚克隆到载体pKLAC1中，得到表达载体pKLAC1-pla2；然后筛选重组乳酸克鲁维酵母菌株实现重组磷脂酶A2的表达；接着收集发酵上清液，卵黄平板初步检测酶活；最后对酵母进行摇瓶发酵培养。本发明根据克隆到的干酪乳杆菌磷脂酶A2基因，构建真核表达载体，利用酵母表达系统表达了干酪乳杆菌磷脂酶A2基因，并研究了不同发酵条件对重组菌株生长及产酶影响。
【IPC分类】C12N15-81, C12N9-18, C12N15-66
【公开号】CN104651391
【申请号】CN201510078380
【发明人】张梁, 王辉, 李由然, 顾正华, 丁重阳, 石贵阳
【申请人】江南大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月13日