一种木糖还原酶基因及其编码的氨基酸序列的制作方法

专利名称：：一种木糖还原酶基因及其编码的氨基酸序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种还原酶基因及其编码的氨基酸序列。
背景技术：
：木糖是木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，天然半纤维素如木聚糖水解产物的85%90%是木糖。木糖经木质纤维素生物可以转化产生乙醇，在自然界中由木糖转化为乙醇的代谢途径有两条其中之一是木糖经木糖还原酶(xylosereductase,XR)催化生成木糖醇(某些丝状真菌中存在此种木糖还原酶)，再由木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase,XDH)作用生成木酮糖，木酮糖再经木酮糖激酶(xylulokinase,XK)磷酸化生成5-磷酸木酮糖，进而进入磷酸戊糖途径(pentosephosphatepathway,PPP，依次生成乙酰磷酸一乙酸一乙醛—乙醇)。由于目前所使用的木糖还原酶(XR)绝大多只能利用或偏向依赖于还原型辅酶II(NADPH)，导致还原型辅酶I(NADH)在工程菌宿主体内大量积累，从而引起辅酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇产量下降。
发明内容本发明的目的是为了解决目前所使用的木糖还原酶(XR)绝大多只能利用还原型辅酶II(NADPH)，导致还原型辅酶I(NADH)在工程菌宿主体内大量积累，从而引起辅酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇产量下降的问题，而提供的一种木糖还原酶基因及其编码的氨基酸序列。本发明木糖还原酶基因序列如SEQIDNO:l所示。本发明木糖还原酶基因序全长1061bp，其中A、G、C、T分别为335bp(31.57%)、219bp(20.64%)、180bp(16.97%)、327bp(30.82%);62bp处有起始密码子ATG，1013bp处有终止密码子TAG，有954bp完整的开放阅读框。本发明上述木糖还原酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明木糖还原酶基因编码的氨基酸序列有317个氨基酸，氨基酸序列的分子量为35.95KD，等电点pi为5.93。本发明木糖还原酶基因是以Owc^apara/^7a^TotalRNA为模板，使用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技术获得的一个具有表达功能的基因。通过GenBank序列比对分析，本发明木糖还原酶基因与已注册Caw/Waa/Wcara的木糖还原酶基因(XM_715658)的最高同源性为80%。将本发明木糖还原酶基因克隆入工程菌宿主巴斯德毕赤酵母，并对经过基因重组的工程菌进行酶活分析，在以NADH为辅酶的实验条件下本发明木糖还原酶基因所生成的木糖还原酶与木糖底物反应的酶活为3.25U，在以NADPH为辅酶的条件下本发明木糖还原酶基因所生成的木糖还原酶与木糖底物反应的酶活为0.54U，试验结果说明本发明木糖还原酶基所产生的木糖还原酶可同时利用还原型辅酶II(NADPH)和还原型辅酶I(NADH)，具有双辅酶依赖性，且NADH的依赖性远远大于NADPH的依赖性。本发明扩大木糖还原酶基因资源，为构建高产燃料乙醇的酿酒酵母工程菌奠定了物质基础。图i是具体实施方式四中提取的Cam/^^ara戸//0^TotalRNA凝胶电泳图；图2是具体实施方式四3②中aw^/a/7ara/w//a^cDNA凝胶电泳图；图3是具体实施方式四5④中PCR产物的凝胶电泳图；图4是具体实施方式四6③中PCR产物的凝胶电泳图；图5是根据木糖还原酶基因序列所构建的系统进化树；图6是重组载体的质粒图谱；图7是具体实施方式四中二.3中阳性克隆质粒的酶切产物凝胶电泳图；图8是具体实施方式四中三.4中木糖还原酶蛋白考马斯亮蓝染色及脱色后的凝胶电泳图；图9是具体实施方式四中四.2中PVDF膜扫描图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式木糖还原酶基因序列如下所示ATAGTAAATATAAAACGG。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是木糖还原酶基因序列62bp处有起始密码子ATG，1013bp处有终止密码子TAG。其它与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式木糖还原酶基因编码的氨基酸序列如下所不,alThrAsnGluThrAlaAlaAspGlnlleTyrAsnAlalleLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGlnAspTyrGlyAsnGluLysGluValGlyGluGlylleAsnArgAlalleAspGluGlyLeuValSerArLeuAsnLysThrLeuSerAspLeuAsnLeuGluTyrLeuAspLeuPheLeuIleHisPheProIleAlsTyrGluAsnValProLeuLeuAspThrTrpArgAlaLeuGluSerLeuValGlnLysGlyLysIleArgSerlleGlylleSerAsnPheAsnGlyGlyLeuIleTyrAspLeuValArgGlyAlaLysIleLysProAlaValLeuGlnlleGluHisHisProTyrLeuGlnGlnProArgLeuIleGluPheValGlnSerGlnGAspThrProThrLeuPheAspHisGluThrlleLysSerileAlaSerLysHisLysLysSerSerAlaGlnValLeuLeuArgTrpAlaThrGlnArgGlylleAlaVallleProLysSerAsnAsnProAspArgLeAspLysGlyLeuArgPheAsnAspProTrpAspTrpAspHisIleProIlePheVal。本实施方式木糖还原酶基因编码的氨基酸序的分子量为35.95KD，等电点PI为5.93。具体实施方式四本实施方式按以下步骤获得木糖还原酶基因序列1、引物设计本实施方式以近平滑假丝酵母(还是近平滑念珠菌？大多数中文期刊都是翻译成近平滑假丝酵母)Om^fa;ara戸//0^TotalRNA为模板，采用软件PrimerPremier5.0设计3'RACE(RACE—RapidAmplificationofcDNAEnds)的上游简并引物XYL13sitesFl、下游引物XYL13sitesoligodT及接头引物XYL13sitesAdaptor,引物序列如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、Ow^(iaparapw7w^细胞培养及TotalRNA(总RNA)的提取将活化后的Ow^iaparapw7ow's(ACCC20221)细胞接种于含1%(质量)D-木糖的液体YPD培养基中，在200r/min的条件下培养14小时，然后取lmL培养液离心、并收集沉淀加入lmLTrizol和0.2g直径为0.2mm的玻璃珠，再置于漩涡振荡器中高速振荡2min，之后提取近平滑假丝酵母TotalRNA，提取步骤及参数参见上海生工生物工程有限公司Trizol使用说明书。本实施方式Camfefo;ara;^7ow;s细胞活化采用常规细胞活化技术。本实施方式提取出的TotalRNA经1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示，本实施方式电泳结果中未发现基因组DNA和蛋白质污染，26S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型清晰，无拖尾现象，两条带的亮度比基本上呈现2:1的关系，由此说明本实施方式提取的Ca"^/apara/wz7a^TotalRNA完整性好。3、木糖还原酶基因3'端序列①以XYL13sitesoligodT为RT-PCR引物、l|iLOm^V/apflra;w7o;^TotalRNA为模板，并加入l|iLTaKaRa公司AMV反转录酶进行RT-PCR。RT-PCR体系为20|iL，RT-PCR扩增程序72。C加热5min，然后立即放入冰中去除RNA的二级结构，再30。C10min，42。C30min，95。C5min;获得cDNA。②取上述3①中lpLcDNA作为模板、以XYL13sitesFl、XYL13sitesAdaptor为引物在50pL反应体系中进行PCR扩增，PCR反应条件如下；预变性94。C2min，94。C变性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循环30次，72。C延伸10min。取5pLPCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图2所示。③PCR产物克隆及测序上述3②中的PCR产物用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化，回收、纯化步骤参见试剂盒操作手册。将纯化的PCR产物与克隆载体pMD18-TVector连接(16'C环境中过夜)，并热转化至大肠杆菌感受态细胞T叩10中，取200jiL转化液涂布到含有O.lmg/mLAmp(氮节青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固体筛选平板上进行筛选，并以M13-47、RV-M引物对平板上的白色菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑选阳性克隆送交TaKaRa公司进行序列测定。4、5'RACE引物设计设计5，RACE引物XYL15sitesP1、XYL15sitesF1、XYL15sitesRl、XYL15sitesF2和XYL15sitesR2，引物序列如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本实施方式引物XYL15sitesPl的5'有磷酸化修饰。5、木糖还原酶基因5'端序列①以XYL15sitesPl为RT-PCR引物、Ow^Vfapara/wZ/ow's的TotalRNA为模板，并加入l|iLTaKaRa公司AMV反转录酶进行反转录获得cDNA。反转-PCR体系为20pL，反转-PCR扩增程序72。C加热5min，然后立即放入冰中去除RNA的二级结构，再30。C10min，42°C30min，95°C5min;获得cDNA。②HybridRNA的分解向上述5①获得的cDNA中加入5pL的RNaseH，并在3(TC条件下反应lhour，然后加入灭菌水定容至100pL，再加入500^iL浓度为100%的乙醇放置于-80。C环境中15min，之后取出在4。C、12000r/min条件下离心10min，离心沉淀经浓度为70%的乙醇清洗后离心回收，并干燥处理获得单链的cDNA。(D单链cDNA环化在上述5②获得的单链cDNA中加入20pLRNA连接缓冲液和20^iL浓度为40%的PEG#6000，混合均匀后再加入lpLT4RNA连接酶，在16。C条件下反应812h。本实施方式RNA连接缓冲液购自于TaKaRa公司。以上述1(iL5③反应物为模板、以XYL15sitesFl、XYL15sitesRl为引物进行第一次PCR(PCR反应体系为20pL，PCR反应条件如下预变性94。C2min，94。C变性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循环30次，最后72。C延伸10min);然后取lpL第一次PCR产物作为模板、以XYL15sitesF2、XYL15sitesR2为引物进行巢式PCR(PCR反应体系为20pL，PCR反应条件如下预变性94。C2min，9(C变性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循环30次，最后72。C延伸10min);取5pLPCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图3所示。本实施方式可获得更加特异和丰富的目的基因。◎PCR产物克隆及测序上述5④中的PCR产物用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化，回收、纯化步骤参见试剂盒操作手册。将纯化的PCR产物与克隆载体pMD18-TVector连接(16。C环境中过夜)，并热转化至大肠杆菌感受态细胞T叩IO中，取200|iL转化液涂布到含有O.lmg/mLAmp(氨节青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固体筛选平板上进行筛选，并以M13-47、RV-M引物对平板上的白色菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑选阳性克隆送交TaKaRa公司进行序列测定。6、基因全序列的获得及克隆①基因全序列引物设计获得的木糖还原酶基因的3'端序列和5'端序列有一段相同的重复序列，使用Sequencher4.2软件将两段序列进行拼接，获得木糖还原酶基因的全长cDNA序列，并设计木糖还原酶基因全长cDNA序列引物XYL1Fl和XYL1Rl，引物序列如表3所示；而且在引物XYL1Fl上引入&oRI限制性酶切位点(划线部分)，在引物XYL1Rl上引入齒n限制性酶切位点(划线部分)，并分别加入保护碱基。表3XYL1Fl5'-GGAATTCATGAGCATTAAGTTAAATTC-3'XYL1Rl5'-ATAGTTTAGCGGCCGCGACAAAGATTGGAATGTGATC-3'②以Ca"c/Wfl;^ra戸Z/a^TotalRNA为模板，XYL1Rl为RT-PCR引物，并加入lpLTaKaRa公司AMV反转录酶进行RT-PCR。RT-PCR体系为20pL，RT-PCR扩增程序72'C加热5min，然后立即放入冰中去除RNA的二级结构，再30。C10min，42。C30min，95。C5min;获得cDNA。③取上述6②中lpLcDNA作为模板，以XYL1Fl、XYL1Rl为引物在50pL反应体系中进行PCR扩增，PCR反应条件如下预变性94。C2min，94。C变性30sec、55。C退火30sec、72。C延伸30sec、循环30次，72。C延伸10min。取5pLPCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图4所示。④PCR产物克隆及测序上述6③中的PCR产物用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化，回收、纯化步骤参见试剂盒操作手册。将纯化的PCR产物与克隆载体pMD18-TVector连接(16。C环境中过夜)，并热转化至大肠杆菌感受态细胞Top10中，取200mL转化液涂布到含有0.1mg/mLAmp(氨节青霉素)，0.024mg/mLIPTG，0.04mg/mLX-Gal的固体筛选平板上进行筛选，并以M13-47、RV-M引物对平板上的白色菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆，挑选阳性克隆送交TaKaRa公司进行序列测定，获得全长的木糖还原酶基因，如SEQIDNO:1所示。本实施方式对所获得的木糖还原酶基因进行比较分析和实验一、DNA序列比较分析和系统树构建将本实施方式获得的木糖还原酶基因序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch),以比较本实施方式获得的木糖还原酶基因与己知酵母菌相应序列的相似程度。用MEGA3.1软件搜索结果进行匹配排列(align),然后用Neighbor-Joining分析方法进行分子系统学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，并构建系统进化树，如图5所示。从进化关系看，本实施方式获得的木糖还原酶基因与Ow^Wafl/Wcara的醛糖还原酶(aldosereductaseXM715658)亲缘关系最近，在进化树的同一分枝上，与唯一己知的近平滑假丝酵母木糖还原酶基因^T丄7(AY193716)在不同的分支上，亲缘关系较远，因此说明本实施方式是一条新的木糖还原酶基因。二、选取巴斯德毕赤酵母表达载体pGAPZaA的&oRI、7VwI两个限制性酶切位点将本实施方式获得的木糖还原酶基因克隆到表达载体的a信号肽下，构建木糖还原酶的分泌表达载体，重组载体的质粒图谱如图6所示。二.l限制性酶切反应a)载体双酶切按表4比例配置50pL酶切限制性双酶切体系表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>37°。进行过夜酶切，反应结束后加入5piL6xLoadingBuffer,进行琼脂糖凝胶电泳并使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒进行切胶回收。(2)插入片段双酶切按表5比例配置50piL酶切限制性双酶切体系表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>淑I10xHBuffer5nL重蒸馏水upto50|jL37"酶切两小时，反应结束后加入5^L6xLoadingBuffer,进行琼脂糖凝胶电泳并使用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒进行切胶回收。二.2片段与载体连接在lOjiL连接反应体系中加入lpLpGAPZaA-五coRI/M/1作为载体，3^LpMD18-T-xyll-2-￡coRI/M^I为连接片段，加入无菌水ljxL，Ligationsolution5|iL,低温水浴中16'C连接4h。二.3大肠杆菌转化与阳性克隆筛选Zeocin抗生素在高盐和低PH条件下对大肠杆菌的毒性较低难以起到筛选的作用，因此大肠杆菌转化与阳性克隆的筛选均在LLB平板上进行，使用XYLlFl和XYLlRl两条引物进行阳性克隆筛选。提取阳性克隆质粒后按表6中的体系进行双酶切鉴定表6pGAPZaA-xyll五coRIluL淑IluL10xHBuffer2pL重蒸馏水upto20|oL37'C酶切1小时，取15(aL酶切产物进行进行1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。二.4巴斯德毕赤酵母转化(l)重组质粒线形化转化时将环状载体DNA切成线状，有助于携带本实施方式木糖还原酶基因的载体高效的与基因组染色体进行同源重组，使将整个载体连同外源基因(木糖还原酶基因)整合进入宿主染色体，达到外源基因随细胞染色体一起复制，稳定的存在于重组菌中的目的。本实施方式选取pGAPZaA载体pGAP启动子上的祝"I酶切位点，转入毕赤酵母GS115后木糖还原酶基因将整合在基因组的pGAP启动子上。重组质粒线形化酶切体系如表7所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>37。C进行过夜酶切，反应结束后加入IO^iL的3MNaOAC(pH值为5.2)，然后加入25(HiL的冰预冷的无水乙醇，在-2(TC的环境中放置3060分钟，再离心回收沉淀物，并用浓度为70%的冰预冷的乙醇洗涤沉淀物，真空干燥后加入IO^iL灭菌水溶解DNA。(2)毕赤酵母转化I、将80pL电转化酵母细胞和520昭线性(用说"I酶切成线性)的DNA(DNA溶于5~10|iLTEBuffer中)放入0°C、长度为0.2cm的电击槽中。II、将电击槽置于冰上5min。III、将电击槽装入预冷的冲击槽中调整电压至2.5KV电流脉冲。IV、立即加入lmL预冷的1M山梨醇，然后将电击槽中的细胞液转移至无菌的15mL转化管中。V、转化管在30。C培养箱中培养12hours(转化管不摇动)。VI、取200~600pL转化液涂于YPD-Zeocin平板(YPD-Zeocin平板包含100|ig/mLZeocin)。VII、将平板置于3(TC培养箱中培养直至单菌落出现。(培养23天单菌落出现)(3)毕赤酵母阳性克隆筛选由于酵母的细胞壁较厚，不能采用常规大肠杆菌阳性克隆的菌落PCR筛选方法，必须将细胞的基因组DNA释放出来。从YPD~Zeocin平板上挑取5个菌落放于5mL液体YPD培养基中在3CTC、200r/min的条件下培养812h，取lmL培养液进行离心收集沉淀物，用北京天根生公司酵母基因组提取试剂盒进行基因组DNA的提取，然后分别取lpL做为模板，以XYL1Fl和XYL1Rl为引物进行PCR鉴定。三、菌体的培养及重组蛋白表达三.l菌体培养挑取阳性克隆毕赤酵母菌落放入2mL液体YPD培养基中在3(TC、200r/min的条件下培养S12h，作为种子液。取种子培养液lOOpL加入10mL液体YPD培养基中在30。C、200r/min的条件下培养8~12h，然后在5000r/min的条件下离心lOmin收集沉淀物，取10mL新鲜液体YPD培养基重悬沉淀物，置于30°C、200r/min的条件下培养，分别在培养24小时、48小时、72小时、96小时和120小时取离心后上清液分析(每次取2mL的培养液，在12000r/min的条件下离心lOmin并收集上清液分析)。三.2蛋白质沉淀在上步收集的上清液中加入100%的TCA(三氯醋酸)溶液，使TCA终浓度为10%~20%，并且在冰浴中沉淀30分钟，然后以12000r/min离心IO分钟去除上清液，向沉淀中加入500)iL丙酮洗去残留的TCA，再冰浴30分钟，之后以12000r/min离心10分钟去除上清液，将沉淀置于室温条件下30分钟使丙酮挥发干净，再加入20nL的PBS缓冲液溶解蛋白。三.3SDS-PAGE电泳取10pL上述的溶解蛋白的PBS缓冲液再加入lO)iL2xSDS-PAGE上样缓冲液，置于99'C的环境中加热10分钟使蛋白变性，然后全量上样于浓度为10%的SDS-PAGE凝胶，以20mA恒流进行电泳，待溴酚兰指示带离胶板底部约lcm处停止电泳。三.4考马斯亮蓝染色及脱色使用考马斯亮蓝染色方法进行蛋白质染色，然后用去离子水冲洗凝胶一遍，再加入200mL的考马斯亮蓝R-250染色液，在摇床中缓慢摇动1小时；然后倒净染色液并用水清洗一次，加入300mL的脱色液摇床中缓慢摇动30分钟，更换脱色液重复脱色两次。扫描脱色后的凝胶，如图8所示。四、重组蛋白的Western印迹本实施方式重组木糖还原酶末端融合表达有6个His标签，可以与一抗His-TaqMab有效的结合，然后与二抗Anti-MouseIgG结合，二抗催化5-溴-4-氯-3-吲跺磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物显色，检测重组蛋白的表达水平。四.l半干式转移I、凝胶处理，电泳结束后切割胶条并转膜缓冲液平衡，5minx3次。II、膜处理，将与胶条大小相同的PVDF膜放入甲醇中浸泡15min，然后将膜及裁好的滤纸条浸入转膜缓冲液中15min。III、转膜，转膜装置从下至上依次按阳极板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、阴极板，其中滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步必须去除气泡。转膜电流为恒电流lmA/cm2，转移1.5h。转膜结束后将膜取出进行免疫印迹检测。四.2免疫反应I、转移后的PVDF膜用去离子水清洗一次，再加入10mL的封闭液缓冲液室温缓慢摇动30min。II、加入lOmL的洗膜缓冲液清洗PVDF膜，5minx3次。III、加入10mL的封闭液，再加入lpL的一抗His-TaqMab振荡lh，使一抗与木糖还原酶蛋白的组氨酸标签发生免疫反应结合。IV、加入10mL的洗膜缓冲液清洗，5minx3次。V、加入10mL的封闭液，再加入2pL的二抗Anti-MouseIgG振荡lh，使二抗与一抗充分结合。VI、加入10mL的洗膜缓冲液清洗，5minx3次。VH、超纯水清洗一次，再加入lmL1.5mLBCIP/NBT和5mL超纯水，避光轻摇，逐渐显色，显色后膜用超纯水洗涤2次，避光自然阴干，再进行扫描，扫描图像如图9所示。五、木糖还原酶活性的测定五.l酶液的制备将重组酵母pGAPZaA-xyl1-2-2于液体YPD培养基中在30°C、200r/min的条件下培养，培养第四天将发酵产物在12000r/min的条件下离心，取上清液作为粗酶液。五.2蛋白质含量测定采用上海华舜生物工程公司的BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质测定，发酵液中蛋白质含量经测定为1pg/mL。五.3NADH依赖性的测定木糖还原酶(XR)的酶活测定，参照Walfridsson等的方法，以lmL反应液0.1mol/LpH7.0磷酸钠缓冲液，0.2mol/L木糖，0.15mol/LNADH及500^iL的酶液，在3(TC条件下使用分光光度计在340nm下检测NADH被氧化的量。木糖还原酶的比活力定义为每mg木糖还原酶蛋白每分钟转化NADH的^imo1数。木糖作为底物时以NADH为辅酶木糖还原酶比活力为3.25U。五.4NADPH依赖性的测定木糖还原酶(XR)的酶活测定，参照Walfridsson等的方法，以lmL反应液0.1mol/LpH7.0磷酸钠缓冲液，0.2mol/L木糖，0.15mol/LNADPH及500pL的酶液，在30。C条件下使用分光光度计在340nm下检测NADPH被氧化的量。木糖还原酶的比活力定义为每mg木糖还原酶蛋白每分钟转化NADPH的pmol数。木糖作为底物时以NADPH为辅酶木糖还原酶活力为0.54U。从辅酶依赖性结果可以看出，本文重组表达的木糖还原酶具有双辅酶依赖性，且NADH的依赖性明显高于NADPH的依赖性，可以用于解决木糖代谢工程菌中辅酶不平衡的问题，在进一步的研究中将对燃料乙醇生产的木糖代谢工程菌的构建具有重要价值。序列表<110>哈尔滨工业大学<120>—种木糖还原酶基因及其编码的氨基酸序列<160>12<210>1<211>1061<212>DNA<213>近平滑假丝酵母(Ow(i/c/a/7arapw7a^)<220><221>CDS<222>(62)…(1015)〈400>1acgatttagtacgcggtgccaaattcgcacacagcgcaactacactactactactcccat60tatgagcattaagttaaatteaggacacgaaatgccaattgttggcttt109MetSerlieLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProlieValGlyPhe151015ggatgttggaaagtcaccaacgagactgetgccgaccaaatetacaat157GlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaAspGinlieTyrAsn202530gcaattaaagttggctac卿ttattcgatggtgetcaagattacggc205AlalieLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGinAspTyrGly354045aatgaaaaagaagttggtgaagga_ateaatcgtgetattgatgaagga253AsnGluLysGluValGlyGluGlylieAsnArgAlalieAspGluGly505560cttgttteacgtgatgaattatttgttgtatec認Uatgg獄aac301UuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsn65taccatTyrHisgatAspgatttgaatAspLeuAsngcattcAlaPhetgtggtCysGly130acttggThrTrp145attggtlieGlyLys115gatAsp卿ArgElttlieLeuGinGin195ggtGlycctProttgLeu100tttPheLys85gagGlugtcVal70AsntatTyrcccProggtgataaaGlyAspLysggtgccaagGlyAlaLysgetAlatecSerElttlie180ccaProttgLeueiatAsn165aaaLys卿ArgateactlieThr210agtaaaaagSerLysLys225aagtecattgettecgcaAlattgLeugttg333CtValGluThrGlu150ttcPhecctProttgLeucttLeuattlietttPhe135tecSergatAspg犯Glu120catHisttgLeuttaLeu105gagGlutatTyrgtgValaatggtgggAsnGlyGlytattctteaTyrSerSergetAlaattlietUPhe215aca_ThrgttValg肪Glu200ggaGlyttgLeu185UtPhecctProgcaAla90ttcPheaaaLysga^Gluc犯GinttgLeu170c犯Gin75ttaLeuttgLeutatTyr幼tAsn卿Lys1553ttlieliegttcaaValGincaateaGinSer80aacaagaccttgtct349AsnLysThrLeuSer95attcatttccccatt397lieHisPheProlie110ccacctggattttac445ProProGlyPheTyr125gttcctttgttggat493ValProLeuLeuAsp140ggaaaaateagatec541GlyLyslieArgSer160ttagtacgc589LeuValArg175catccatac637HisProTyr190ggaattgcc685GlylieAlagaattgga已733GluLeuGlugatacacc已actAspThrProThr230estsag犯attgLeutea18UtPhe235ctgtacgatTyrAspg犯C3CGluHistctcaaSerGin205tttttgPheLeu220gatcatAspHisgaaactate781GluThrlie240getcaagtgttgtta829LysSerlieAlaSerLysHisLysLysSerSerAlaGinVal245250caaagaggtattgccgtgGinArgGlylieAlaVal卿tggArgTrpgetAlacctgatProAsp犯agagLysGlu290aatgacAsnAsp305cgtArg275gatAspcctProactThr260ttgLeuttgLeutggTrpgcgAlagsgGlugatAspc朋GingcaAlatggTrp31033CAsnatelie295AspttgLeu280朋cAsnC8CHisgccAla265AsnaagLysattlieattlieccaaaaProLysgttValttgLeuccaProagtSergatAspatelie315teaSer270gagGluLeu255Asnteuaat877Asngatttcgagttgagt925AspPheGluLeuSer285gggLysGly300tttgtctagaggag1020PheValttgaggttt973LeuArgPhegagectatagtggttaaatagaaatagtaaatataaaacgg1061<210>2<211>317<212>PRT<213>近平滑假丝酵母(Omc^apara/^/a^)〈400〉2MetSerlieLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProlieValGlyPhe151015GlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaA印GinlieTyrAsn202530AlalieLysValGlyTyrArgUuPheAspGlyAlaGinAspTyrGly354045AsnGluLysGluValGlyGluGlylieAsnArgAlalieAspGluGly505560LeuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsn65707580TyrHisAspLeuAlaPheCysGly130ThrTrp145lieGlyAspProLysAsnValGluThrAlaLeuAsnLysThrLeuSer859095AsnLys115AspLeuGinlieThr210SerLys225LysSerArgTrpProAspLysGlu290AsnAsp305<210>3Gin195GlyLeu100PheGluTyrLeuAspValProlieGlyAspLysArgAlaLeulieSerGlyAlaLyslie180ProAsn165LysGlu150PhePhe135SerGlu120HisLeu105GluPheLeulieHisLysTyrProTyrGluAsnLeuValGinAsnGlyGlyProAlaValArgLeulieTyrSerSerLysAlaLeulieAlaAlaArg275AspThr260LeuSer245GinAsp230LysPhe215ThrGlu200GlyLeu185PheLeu170GinHisLysLysArgGlylieAlaGinAsnLeuGluAlaProTrpAspTrp310lie295AspLeu280AsnAla265AsnSer250ValLys155lieVal140GlyPro125ProlieGluHisValGinSerProGinSerProThrLeuPhe235SerPhe220AspGin205LeulieProLysValSerAspLysLeuAspHislieProlie315Lys300PhePhe110GlyLysTyrAspLeuHis190GlyAlaGinValPhe285GlyValSer270GluProliePheTyrLeuLeuAsplieArgVal175ProSer160TyrlieAlaGluLeuGluHisGluThrLeu255Asnlie240LeuAsnLeuSerLeuArgPhe<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据Ca"^/"/ara戸//0^TotalRNA设计的3'RACE的上游简并引物XYL13sitesFl。<220><221>misc—feature<222>(3,12,21)<223>r=g或a，w=a或t，y=t或c<400>3aaractttgtcwgatttgaayttgg25<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据Cam/Wa;ara;w//cw"Total脂A设计的3'RACE的下游引物XYL13sitesoligodT。<400>4gagcggataacaatttcacacaggtttttttttttttttt40<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据Om必iapara/w'/ow'sTotalRNA设计的3'RACE的接头引物XYLl3sitesAdaptor。<400>5gagcggataacaatttcacacagg24<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据C朋fife/aTotalRNA设计的5'RACE引物XYLl5sitesPI。<400>6tggcaccgcgtactaaatcgt21<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据Omc^cfapara/wz7cw/sTotalRNA设计的5，RACE引物XYLl5sitesFl。<400>7tgttggatacttgg卿gc19<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据C朋cMa戸ra;w70^TotalRNA设计的5'RACE引物XYLl5sitesRl。<400>8atttatcaccatcaccacagt21<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据am力V/a/7arapw7a^TotalRNA设计的5'RACE引物XYLl5sitesF2。<400>9gggaaaaatcagatccat18<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据OmoWa/araps"o;^TotalRNA设计的5，RACE引物XYLl5sitesR2。<400>10tgcaatggggaaatgaatcaag22<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据木糖还原酶基因全长cDNA序列设计的全长cDNA序列引物XYL1Fl。<400>11ggaattcatgagcattaagttaaattc27<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据木糖还原酶基因全长cDNA序列设计的全长cDNA序列引物XYL1Rl。<400>12atagtttagcggccgcgacaa卿ttggaatgtgatc3权利要求1、一种木糖还原酶基因，其特征在于木糖还原酶基因序列如下所示ACGATTTAGTACGCGGTGCCAAATTCGCACACAGCGCAACTACACTACTACTACTCCCATTATGAGCATTAAGTTAAATTCAGGACACGAAATGCCAATTGTTGGCTTTGGATGTTGGAAAGTCACCAACGAGACTGCTGCCGACCAAATCTACAATGCAATTAAAGTTGGCTACAGATTATTCGATGGTGCTCAAGATTACGGCAATGAAAAAGAAGTTGGTGAAGGAATCAATCGTGCTATTGATGAAGGACTTGTTTCACGTGATGAATTATTTGTTGTATCCAAATTATGGAACAACTACCATGATCCTAAAAATGTTGAAACTGCATTAAACAAGACCTTGTCTGATTTGAATTTGGAGTATCTTGATTTATTCTTGATTCATTTCCCCATTGCATTCAAATTTGTCCCCATTGAAGAGAAATATCCACCTGGATTTTACTGTGGTGATGGTGATAAATTTCATTATGAAAATGTTCCTTTGTTGGATACTTGGAGAGCTTTGGAATCCTTGGTGCAAAAGGGAAAAATCAGATCCATTGGTATTTCCAATTTCAATGGTGGGTTGATTTACGATTTAGTACGCGGTGCCAAGATTAAACCTGCTGTTTTGCAAATTGAACACCATCCATACTTACAACAACCAAGATTGATTGAATTTGTTCAATCTCAAGGAATTGCCATCACTGGTTATTCTTCATTTGGACCTCAATCATTTTTGGAATTGGAAAGTAAAAAGGCATTGGATACACCAACTTTGTTTGATCATGAAACTATCAAGTCCATTGCTTCCAAACATAAGAAATCACTGGCTCAAGTGTTGTTAAGATGGGCTACTCAAAGAGGTATTGCCGTGATTCCAAAATCAAACAATCCTGATCGTTTGGCGCAAAACTTGAATGTTAGTGATTTCGAGTTGAGTAAAGAGGATTTGGAGGCAATCAACAAGTTGGATAAAGGGTTGAGGTTTAATGACCCTTGGGATTGGGATCACATTCCAATCTTTGTCTAGAGGAGGAGCCTATAGTGGTTAAATAGAAATAGTAAATATAAAACGG。2、根据权利要求l所述的一种木糖还原酶基因，其特征在于木糖还原酶基因序列62bp处有起始密码子ATG，1013bp处有终止密码子TAG。3、如权利要求1所述的木糖还原酶基因编码的氨基酸序列，其特征在于木糖还原酶基因编码的氨基酸序列如下所示MetSerlleLysLeuAsnSerGlyHisGluMetProIleValGlyPheGlyCysTrpLysValThrAsnGluThrAlaAlaAspGlnlleTyrAsnAlalleLysValGlyTyrArgLeuPheAspGlyAlaGlnAspTyrGlyAsnGluLysGluValGlyGluGlylleAsnArgAlalleAspGluGlyLeuValSerArgAspGluLeuPheValValSerLysLeuTrpAsnAsnTyrHisAspProLysAsnValGluThrAlaLeuAsnLysThrLeuSerAspLeuAsnLeuGluTyrLeuAspLeuPheLeuIleHisPheProIleAlaPheLysPheValProIleGluGluLysTyrProProGlyPheTyrCysGlyAspGlyAspLysPheHisTyrGluAsnValProLeuLeuAspThrTrpArgAlaLeuGluSerLeuValGlnLysGlyLysIleArgSerlleGlylleSerAsnPheAsnGlyGlyLeuIleTyrAspLeuValArgGlyAlaLysIleLysProAlaValLeuGlnlleGluHisHisProTyrLeuGlnGlnProArgLeuIleGluPheValGlnSerGlnGlyllalLeuLeuArgTrpAlaThrGlnArgGlylleAlaVallleProLysSerAsnAsnProAspArgLeuApLysGlyLeuArgPheAsnAspProTrpAspTrpAspHisIleProIlePheVal。4、根据权利要求3所述的木糖还原酶基因编码的氨基酸序列，其特征在于氨基酸序列的分子量为35.95KD，等电点PI为5.93。全文摘要一种木糖还原酶基因及其编码的氨基酸序列，它涉及一种还原酶基因及其编码的氨基酸序列。它解决了目前所使用的XR绝大多只能利用或偏向依赖于NADPH，导致NADH在工程菌宿主体内大量积累，从而引起辅酶不平衡，致使工程菌生理活性降低，乙醇产量下降的问题。本发明木糖还原酶基因序全长1061bp，其中A、G、C、T分别为335bp、219bp、180bp、327bp，有954bp完整的开放阅读框。本发明木糖还原酶基因编码的氨基酸序列有317个氨基酸，氨基酸序列的分子量为35.95KD，等电点PI为5.93。本发明木糖还原酶基所产生的木糖还原酶可同时利用NADPH和NADH，具有双辅酶依赖性。文档编号C12N15/53GK101173291SQ200710144440公开日2008年5月7日申请日期2007年10月15日优先权日2007年10月15日发明者冯玉杰,曲有鹏,李冬梅申请人:哈尔滨工业大学