一种头孢菌素c酰化酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种利用微生物生产头孢菌素C酰化酶的方 法。
【背景技术】
[0002] 由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对和0 _内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱广、疗 效好、毒性低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，近年来 已经成为抗感染最重要的有效药物。头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)是经化学法或是 酶法裂解得到7-ACA。
[0003]因为化学合成法过程长、步骤多、反应条件苛刻、产生大量的三废等弊端，目 前已被淘汰。目前主要使用两步酶法制备7-ACA。首先，头孢菌素C在含有氧气情况 下被D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase,DAA0)催化，产生具有酮基的中间体 (ketoadipyl7-aminocephalosporanicacid，ket〇-7_ACA)和H202。这个中间体较不稳 定，很容易被同时产生的H202氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烧酸（glutaryl 7-aminocephalosporanicacid,GL-7-ACA)，然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶（GL-7-ACA acylase)的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学 法相比要低，而且D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase,DAA0)催化反应难以控制。头 孢菌素C酰化酶（CPCacylase)可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA(不经过GL-7-ACA等 中间产物），利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法高转化率、高纯度 的优势，也具有两步酶法高经济性和环境保护的优势。
[0004] 现已报道的具有头孢菌素酰化酶活力菌株通常都从土壤或污水中筛选得到。随 着头孢菌素酰化酶在工业应用中价值的不断提高，如何提高酶活和产量成为研究者日益关 注的问题。目前，提高酶产量的方法主要包括发酵技术和细菌遗传技术。由于野生菌株培 养困难或酶活较低，而且往往存在导致底物及产物降解的0 _内酰胺酶和酯酶，因此人们 将酰化酶进行了克隆和表达。大肠杆菌作为第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，由于其遗 传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地 生产目的蛋白等优点，而被广泛应用于头孢菌素酰化酶的克隆和表达。利用基因工程发酵 生产具有周期短、成本低、过程易于控制等诸多优点，且由于发酵培养基组分简单、酰化酶 基因可受启动子基因调控，使其具备易纯化和可诱导高产的特点。作为酶法生产7-ACA过 程的关键酶，对头孢菌素酰化酶基因工程菌发酵方法的深入研究具有重要的理论意义和 重大的社会价值。
【发明内容】
[0005] 基于本领域的不足之处，本发明的目的是提出一种头孢菌素C酰化酶的制备方 法。
[0006] 实现本发明目的的技术方案为：
[0007] -种头孢菌素C酰化酶的制备方法，包括步骤：
[0008] 1)平板培养：将头孢菌素C酰化酶生产菌种大肠杆菌基因工程菌 CPCA2013(Escherichiacoli，CGMCCNo.9285)涂布于LB琼脂平板培养基培养；
[0009] 2)种子培养：从LB平板培养基上挑取单菌落接入种子培养基，进行种子培养；
[0010] 3)发酵培养：种子培养后的种子液按发酵培养基体积的3% -4%的接种量接入到 发酵培养基中进行培养。
[0011] 其中，制备头孢菌素C酰化酶的菌种为大肠杆菌基因工程菌CPCA2013,分类命名 为大肠埃希氏菌，保藏时间为2014年6月9日，保藏号CGMCCNo.9285,保存于中国普通微 生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。
[0012] 其中，所述步骤2)中，种子培养基的组成为：蛋白胨15-17g/L，甘油2-4g/L，酵母 浸粉9-12g/L，氯化钠4-6g/L，40-60ppm卡那霉素，氢氧化钠调至pH7. 0，用自来水配制。
[0013] 其中，所述种子培养条件为37°C下通风培养至0D550为9-11，然后进行下一步骤。
[0014] 其中，所述步骤3)中，发酵培养初始的培养基组成为：磷酸氢二钾5-7g/L，一水合 柠檬酸3-5g/L，一水合氯化钙0. 03-0. 05g/L，七水合硫酸镁l-3g/L，氯化锌0. 003-0. 005g/ L，二水合氯化铜 0. 003-0. 005g/L，硼酸 0. 005-0. 007g/L，四水合氯化锰 0. 002-0. 004g/L， 六水合氯化钴〇? 003-0. 005g/L，七水合硫酸亚铁0? 05-0. 07g/L，葡萄糖4_6g/L，40_60ppm 卡那霉素，氨水调至pH7. 0,用自来水配制。
[0015] 其中，所述步骤3)中，流加补糖方法为：当残葡萄糖浓度低于0.lg/L时开始补糖， 流加葡萄糖的质量浓度为50-60% (即含葡萄糖50-60%的水溶液），流加起始补糖速度为 3-4g/L每小时，最大补糖速度为5-6g/L每小时，补糖开始后3-4小时达到最大补糖速度，维 持葡萄糖浓度低于〇.lg/L。
[0016] 优选地，步骤3)发酵培养过程中，发酵培养基的pH为7. 0-8. 0,起始通风比为1 : (0. 1~0. 6)，通过调整通风的风量和搅拌发酵培养基维持发酵过程中溶氧在20-50%。
[0017] 例如，起始搅拌转速为200-300rpm，发酵过程中通过搅拌发酵培养基维持溶氧在 20-50 %〇
[0018]进一步地，所述步骤3)的发酵起始培养温度34-36°C，0D550至1-2. 5时开始降 温，降温至24-26°C时按发酵液体积加入乳糖4-6g/L诱导，并同时按发酵液体积加入二甲 亚砜（DMS0)4-10g/L，此时维持发酵温度在24°C-26°C。
[0019] 优选地，按发酵液体积加入二甲亚砜（DMSO) 4-6g/L。
[0020] 优选地，步骤3)发酵培养的时间为36-48小时。
[0021] 进一步地，步骤3)发酵结束后，还包括离心收集菌体，用0. 1MTris-HCl稀释后超 声破碎，离心去除不溶部分的步骤。
[0022] 本发明的有益效果为：
[0023] 本发明生产的头孢菌素C酰化酶，发酵液酶活为5000U/L左右，经成本核算后可以 进行大规模工业化生产。
[0024]本发明生产的头孢菌素C酰化酶，发酵液酶活比现有技术生产的发酵液酶活高出 0. 8 倍。
【具体实施方式】
[0025] 以下优选实施方式用于说明本发明，但不应理解为对本发明的范围的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。
[0026] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 实施例中，制备头孢菌素C酰化酶的菌种为大肠杆菌基因工程菌 CPCA2013(Escherichiacoli，CGMCCNo. 9285)。
[0028] LB琼脂平板培养基：Tryptone(胰蛋白胨）10g/L，YeastExtract(酵母提取 物）5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。
[0029] 实施例1
[0030] 先将生产头孢菌素C酰化酶菌种大肠杆菌基因工程菌涂布到LB琼脂平板上培养 至菌落直径达lmm〇
[0031] 将平板培养的头孢菌素C酰化酶生产菌种在无菌状态下用接种环接入一环到含 蛋白胨16g/L，甘油2. 5g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠5g/L，50ppm卡那霉素的种子培养基三 角瓶中，该种子培养基用自来水配制，用氢氧化钠l〇wt%的溶液调至pH7. 0。
[0032] 37°C下通风培养0D550至10。将培养成熟的种子按发酵培养基体积的3%的接种 量接入到发酵培养的培养基中。该培养基含磷酸氢二钾6. 5g/L，一水合梓檬酸3g/L，一水 合氯化钙0. 05g/L，七水合硫酸镁2. 5g/L，氯化锌0. 003g/L，二水合氯化铜0. 003g/L，硼酸 0. 005g/L，四水合氯化锰0. 002g/L，六水合氯化钴0. 003g/L，七水合硫酸亚铁0. 05g/L，葡 萄糖5g/L，50ppm卡那霉素，用自来水配制。
[0033] 在5升发酵罐内的发酵培养基中培养，接种前用氨水调发酵液pH值至7. 0。发酵 起始通风比为1 :〇. 4,起始搅拌转速为200,通过调整风量和转速维持溶氧在30 %左右，维 持发酵液PH7. 0。当葡萄糖浓度低于0.lg/L时开始补糖，流加葡萄糖浓度为55% (质量 比），流加起始补糖速度为3g/L每小时，最大补糖速度为6g/L每小时，补糖开始后3小时达 到最大补糖速度，维持葡萄糖浓度低于〇.lg/L。发酵起始培养温度35°C，0D550至1. 5时 开始降温，