使用其中进行了调控使赖氨酰-tRNA合成酶被表达或不被表达的细胞或球状聚集的细胞 ...的制作方法
【专利说明】使用其中进行了调控使赖氨酿-tRNA合成酶被表达或不被 表达的细胞或球状聚集的细胞的培养筛选癌症转移抑制剂 的方法
[0001] 发明的背景
[0002] 1.技术领域
[0003] 本发明涉及一种用于通过对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中进行了调控使 赖氨酰-tRNA合成酶被表达或不被表达的细胞系或球状聚集的细胞系分析癌细胞中的细 胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质（ECM)粘附、细胞粘附信号传导的激活以及癌细胞播散来 筛选（screening)癌转移抑制剂的方法，以及涉及一种用于监测癌细胞的迀移、浸润和转 移的方法。
[0004] 2.相关技术的说明
[0005] 已知90%的癌症死亡是由于转移。当癌细胞通过血液流动和其他因素迀移进入特 定器官时转移开始。迀移的癌细胞在新地方通过相互作用再次生长。大部分癌症在形成器 官壁的上皮细胞中发展。上皮细胞表达参与细胞粘附和迀移的这类蛋白，如FAK、Src、粧蛋 白（paxillin)和ERK。当调控这类蛋白的激活和表达时，也可以调控各种相关的功能，诸 如细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质（ECM)粘附、迀移和浸润（Petrie和Yamada，2012 ; WehrleHaller，2012)。当细胞-细胞粘附播散时，所提及的蛋白参与上皮细胞转化为高度 能动性间充质细胞，引起对上皮-间充质转化（epithelialtomesenchymaltransition， EMT)的诱导（Bolos等，2010)。这种EMT不仅在胚胎发展中起到重要作用，而且可通过破坏 组织引起由纤维化和癌症代表的疾病。纤维化减少了负责正常功能的薄壁细胞，并引起胶 原蛋白的积累，导致组织功能丧失。推测所转化的细胞形态、骨架结构、胶原蛋白生成以及 迀移是纤维化的原因（Kalluri和Neilson，2003)。在癌症中也观察到这种EMT现象。通 过EMT从聚集的癌细胞播散高度能动性的癌细胞，经血流或淋巴系统行进到达癌细胞生长 以再次形成肿瘤的新目的地。即，特点是极化上皮细胞（polarizedepithelialcell)转 化为能动性细胞的EMT在癌分化和其恶性进展中起重要作用（Meng和Wu，2012)。同时，根 据关于循环肿瘤细胞（CTC)转移细胞的异质性的最近报道，已证实保留了远端转移位点处 上皮类型类特征的不完全EMT表型细胞的集落对于转移是有利的（Thiery和Lim，2013;Yu 等，2013)。
[0006] 各种组织细胞根据其独特的微环境保留其特征。因而，如果这种微环境失去了其 对细胞的控制，细胞将具有显示退化、异常分化、不可控增殖等故障，导致疾病如癌症的发 展（Sansone和Bromberg, 2011)。癌症患者中转移和治疗效果的差异原因，除癌细胞本身 外，还有包围肿瘤的微环境的影响。
[0007] 转移过程中，转移癌细胞的各种功能包括细胞迀移和浸润受到包围细胞的微环境 的影响。在微环境中，分泌各种生长因子或细胞因子如TGFi3 1和TNFa，为肿瘤细胞生长、 迀移和浸润制造了最佳环境。由于肿瘤微环境可以调控分化和各种功能，包括细胞增殖、存 活、迀移以及浸润，因而必须在将微环境应用于癌症研究或临床治疗之前充分了解这种微 环境（Friedl等，2012)。如今，抗癌剂主要集中于癌细胞本身的增殖或细胞信号传导的变 化，表明不可以用这些药物来调节由包围肿瘤细胞的微环境的变化而造成的癌症发展和进 展，这意味着不能从根本上控制癌症发展和转移。因此，可以经通过分析和研究癌细胞和周 围的细胞环境之间的有机网络公开细胞功能特别是粘附、EMT、迀移以及浸润的分子机制来 提供抑制转移的新抗癌策略（Friedl等，2012)。
[0008] 二维环境中的体外细胞培养指常规塑料瓶中或皿上的细胞培养，以观察扁平细 胞。为了复制体内环境，已试图用三维细胞培养来弥补显示人工细胞形态的二维培养的缺 点（Nyga等，2011)。与体外二维环境中的不同，在体内细胞常常显示略长形态。因而，体外 三维细胞培养可以是细胞培养中的良好替代，以研究真实细胞形态和功能以及进一步地， 细胞和微环境之间的相互作用（Aref等，2013)。必须证实与癌症转移相关的细胞功能，包 括粘附、EMT、迀移和浸润，是如何通过细胞和周围的三维微环境的相互作用来调控的，这将 有助于开发转移抑制剂。
[0009] 氨酰-tRNA合成酶将tRNA与细胞中对应的氨基酸结合，并将所得氨酰-tRNA转移 至用于蛋白合成的延伸因子（elongationfactor)核糖体中。氨酰-tRNA合成酶与氨基 酸和tRNA的结合特异性是对保留蛋白合成的准确性非常关键的因素。形成氨酰-tRNA合 成酶的组分之一赖氨酰-tRNA合成酶（KRS)形成作用为分子储库（molecularreservoir) 的巨分子复合物，以调控一些哺乳动物中组成氨酰-tRNA合成酶的蛋白质的各种功能。人 赖氨酰-tRNA合成酶含有参与RNA和其他蛋白质之间的相互作用的独特的N端延伸位点 (elongationsite)，并且可以促进结肠直肠癌细胞的转移功能，表明赖氨酰-tRNA合成酶 在转移中起重要作用（Kim等，2012,FASEBJ. 26 (10): 4142-59)。
[0010] 因此，本发明人分析了三维环境中培养的癌细胞中的赖氨酰-tRNA合成酶（KRS) 的功能，并因而试图开发一种用于筛选转移抑制剂的方法。在这种努力的过程中，发明人使 用结肠直肠癌细胞系HCT116制备了其中已进行调控使KRS被表达或不被表达的球状聚集 的细胞系。然后，发明人观察了细胞外基质涂覆的二维环境或由细胞外基质包围的三维细 胞培养环境或液态（含水的，aqueous)三维环境的培养条件中的细胞系。结果证实了KRS 表达被抑制的细胞系中诱导了不完全上皮-间充质转化表型（不完全ECM表型），并因此抑 制了细胞-ECM粘附和相关的信号传导活性。当在三维培养环境中培养球状聚集的细胞系 时，KRS表达的抑制抑制了播散，但诱导了间充质细胞，但未能达到对细胞-细胞粘附的分 解；抑制了细胞-ECM粘附和其相关的ERK激活；抑制了信号传导活性如粧蛋白表达和磷酸 化，导致对细胞播散进入微环境的抑制。本发明人还证实了这种KRS依赖型癌细胞播散与 癌症浸润边缘的KRS和ERK/粧蛋白分布/积累一致，如结肠直肠癌患者的染色癌组织中观 察到的，从而完成本发明。 发明概要
[0011] 本发明的一个目的是提供一种用于筛选转移抑制剂的方法。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种用于监测癌细胞从聚集的癌细胞的播散，癌细胞 的上皮-间充质转化、迀移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法。
[0013] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于筛选转移抑制剂的方法，该方法包括 以下步骤：
[0014] 1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨 酰-tRNA合成酶（KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
[0015] 2)用步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞处理样品；
[0016] 3)分析步骤2)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
[0017] 4)选择步骤3)中已确定能抑制KRS活性的样品。
[0018] 本发明还提供了一种用于监测癌细胞从聚集的癌细胞的播散、癌细胞的上皮-间 充质转化、迀移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法，该方法包括以 下步骤：
[0019] 1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨 酰-tRNA合成酶（KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
[0020] 2)分析步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
[0021] 3)基于步骤2)分析的KRS活性来分析癌细胞系或聚集的癌细胞的转移水平。
[0022] 有益效果
[0023] 本发明可以用作一种用于筛选转移抑制剂的方法或一种用于监测癌细胞从聚集 的细胞的播散、癌细胞的上皮-间充质转化、迀移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的 表达和活性的方法，上述方法通过分析三维环境中或由细胞外基质包围的环境中培养的癌 细胞系中的赖氨酰-tRNA合成酶（KRS)依赖型细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质（ECM) 粘附、细胞粘附信号传导活性以及细胞播散来进行。本发明也可以用作在药物开发要求的 临床前测试时能创造低成本、高效率附加值的筛选方法之一。
[0024]附图的简要说明
[0025] 参照附图最充分地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：
[0026] 图1A是说明三维环境中的细胞培养的示意图，其中在3D环境中培养通过悬滴培 养获得的球状聚集的细胞。
[0027]图1B是说明通过悬滴培养获得的培养的球状聚集的细胞与二维环境中培养的细 胞形态的比较的图。
[0028]图1C是说明通过悬滴培养方法培养的球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白 (E-cadherin)表达随时间增加的图。
[0029] 图1D是说明在光学显微镜下观察的3D胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细 胞的形态的图。
[0030] 图1E是说明通过用由shRNA抑制赖氨酰-tRNA合成酶（KRS)转染的细胞系进行 悬滴培养获得的球状聚集的细胞中KRS的表达的图。
[0031] 空白（Mock):对照，以及
[0032] 0-3、2-1、2-2、5-3:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
[0033]图1F是说明通过悬滴培养培养的球状聚集的细胞中的上皮-间充质转化（EMT) 相关的标记mRNA的表达的图。
[0034]P:HCT116亲本细胞、对照、
[0035] 2-1、2-2、2-3、5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0036]KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0037]图1G是说明通过悬滴培养培养的球状聚集的细胞中的EMT相关的标记蛋白的表 达的图。
[0038] 空白（Mock):对照，以及
[0039]shKRS:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
[0040]图2A是说明在补充有血清的二维（2D)细胞培养条件中正常培养的细胞中的KRS依赖型EMT标记蛋白的表达的图。
[0041] P:对照，
[0042] 2-1、2-2、2-3、5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0043]WT:KRS过表达细胞系。
[0044]图2B是说明在补充有10%的血清的二维（2D)细胞培养条件中正常培养的细胞中 的EMT相关标记蛋白的表达的图，其未处理或用TNFa或TGFi3 1处理。
[0045] 亲本：对照，
[0046]shKRS2-1:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆2-1，以及
[0047]KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0048] 图2C是说明通过调控补充有10%血清的二维环境中正常培养的细胞中的KRS表 达来抑制E-钙粘蛋白和β-连环蛋白表达的图。
[0049] 亲本：对照，
[0050]shKRS:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆体，以及
[0051]KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0052] 图2D是说明在相差显微镜下观察的在贴附在补充有10%血清的正常二维（2D)环 境中的培养板上的集落中生长的细胞的形态的图。
[0053]KRS-阴性：其中KRS表达已被抑制的细胞系，以及
[0054]KRS-阳性：HCT116亲本细胞或KRS过表达细胞系。
[0055] 图3是说明具有2%血清的二维环境中层粘连蛋白涂覆的皿或盖玻片上细胞培养 的结果的图，该2%血清低于正常浓度，以使血清中生长因子的影响最小化。
[0056] 图3A是说明其中KRS表达被抑制的细胞系（shKRS2i、shKRS54)中，Src、ERK和粧 蛋白的细胞粘附介导的磷酸化显著降低，但FAK的磷酸化没有变化的图。
[0057] 图3B是说明表达KRS的亲本细胞和过表达KRS的细胞系中ERK的磷酸化水平高， 但其中KRS表达被抑制的那些细胞系中ERK的磷酸化水平显著低的图。
[0058] 图3C是说明表达KRS的亲本细胞系或过表达KRS的细胞系中粧蛋白的高磷酸化 水平和其中KRS表达被抑制的细胞系中粧蛋白的显著低的磷酸化水平的图。
[0059] 图3D是说明根据HCT116细胞中KRS的抑制，细胞形态或伸展（spreading)没有 太大差异的图。
[0060] 图3E是说明免疫荧光检测的结果的图，其中表达KRS的亲本细胞系中或过表达 KRS的细胞系中ERK的磷酸化水平高，但当用YH16899(KimDG等，NatChemBiol.2014Jan; 10(1) :29-34)即KRS抑制剂处理细胞系时，ERK的磷酸化水平显著降低。
[0061] 图3F是说明免疫荧光检测的结果的图，其中表达KRS的亲本细胞系中或过 表达KRS的细胞系中Tyrl18的磷酸化水平高，但当用YH16899(KimDG等，NatChem Biol. 2014Jan;10(1) :29-34)即KRS抑制剂处理细胞系时，磷酸化水平显著降低。
[0062] 图3G是说明与用YH16899处理的表达KRS的亲本细胞中或过表达KRS的细胞系 中的与FAKTyr397磷酸化有关的细胞形态或伸展没有大的差异的图。
[0063] 图4A是说明根据补充有10%血清的正常二维环境中培养的细胞中的KRS表达的 调控来抑制FAK和ERK磷酸化的图。
[0064] P :对照，
[0065] 2-U5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0066] myc-KRS WT :myc_KRS过表达细胞系。
[0067] 图4B是说明根据补充有10%血清的正常二维环境中培养的细胞中的KRS表达的 调控来抑制s-Src和粧蛋白磷酸化的图。
[0068] P:对照，以及
[0069] 2-U5-4:其中KRS已被抑制表达的细胞系克隆。
[0070] 图4C是说明在二维环境中或在悬浮液中的纤连蛋白（纤维连接蛋白， fibronectin)涂覆的培养皿中培养2小时的细胞中的FAK和ERK的磷酸化的图，其中对KRS 的表达进行调控。
[0071] S:悬浮液，
[0072]FN:在纤连蛋白涂覆的培养皿中培养，
[0073] P :对照，
[0074] 2-U5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0075]myc-KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0076] 图4D是说明通过观察在二维环境的纤连蛋白涂覆的培养皿中培养2小时的其 中KRS表达被抑制的细胞系中酪氨酸397磷酸化FAK来确定的粘着斑（焦点粘连，focal adhesion)的抑制的图。
[0077]P:对照，
[0078] 2-U5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0079]myc-KRS WT :myc_KRS过表达细胞系。
[0080]图5是说明将其中已进行调控使KRS被表达或不被表达的球状聚集的细胞系在三 维胶原蛋白凝胶环境中培养3-24小时时观察到的细胞外基质（ECM)粘附相关的信号传导 活性的变化的图。
[0081] 亲本：对照，
[0082] 2-1、2-2、2-3、5-4:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0083]KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0084] 图6A是说明对在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的正常表达KRS的HCT116细胞中 和其中KRS表达被抑制的球状聚集的细胞系（shKRS2dshKRS5 4)中的p-ERK进行免疫染色 后在共聚焦显微镜下观察到的ERK磷酸化的图。
[0085] 图6B是说明对在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的正常表达KRS的HCT116细胞中 和其中KRS表达被抑制的球状聚集的细胞系（shKRS21)中的粧蛋白进行免疫染色后在共聚 焦显微镜下观察到的粧蛋白的图。
[0086] 图6C是说明对在用对照DMS0 (二甲亚砜）或YH16899即KRS抑制剂处理并在三 维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中KRS正常表达的球状聚集的细胞系（HCT116)中的p-ERK 进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的ERK的磷酸化水平的图。
[0087] 图6D是说明对在用对照DMS0(二甲亚砜）或U0126即MEK/ERK激酶的选择性 抑制剂处理并在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中KRS正常表达的球状聚集的细胞系 (HCT116)中的粧蛋白进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的粧蛋白的表达水平的图。
[0088] 图7A是说明根据ERK抑制剂对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的 HCT116亲本细胞的处理，细胞-ECM粘附相关的信号传导活性的变化的图。
[0089] U0126:ERK抑制剂。
[0090] 图7B是说明根据ERK抑制剂对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的HCT116亲本细胞的处理，细胞-细胞粘附相关的基因mRNA表达的变化的图。
[0091] U0126:ERK抑制剂。
[0092] 图8A是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中EMT相关的蛋 白的变化的图。
[0093] P:对照，
[0094] 2-U2-2 :其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
[0095] KRSWT:KRS过表达细胞系。
[0096] 图8B是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养5天的球状聚集的细胞中snaill表 达的变化的图。
[0097] 亲本：对照，以及
[0098] shKRS2pshKRS2 2:其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
[0099] 图8