多聚谷氨酰化dnajc7的新应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测技术和医学诊断领域，特别是涉及一种多聚谷氨酰化DNAJC7 的新应用，即多聚谷氨酰化DNAJC7在制备肾细胞癌诊断试剂或诊断设备中的应用。
【背景技术】
[0002] 肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)的发病率居泌尿系统肿瘤第二位(仅次于 膀胱癌），目前RCC的诊断主要依靠影像学检测以及肾脏组织活检。
[0003]但是，一方面目前临床上一些偶发肾癌、小肾癌等病例的影像学特征并不典型，易 出现漏诊或良恶性肿瘤鉴别有误的现象;另一方面肾脏穿刺活检诊断RCC的创伤性大，需要 严格排除禁忌症。并且，常规方法诊断RCC的成本较高，且组织活检技术操作复杂，易产生副 作用。
[0004] DNAJC7(DnaJhomolog，subfamilyC,member7)属于热休克蛋白家族成员，由两 个N-末端重复结构域和C-末端的DnaJ结构域组成，作为分子伴侣以ATP依赖的方式连接热 休克蛋白70和热休克蛋白90,并调节其功能。有研究认为热休克蛋白是癌症发生发展过程 中的关键因素，可能作为抗癌药物的靶位点。热休克蛋白也可以参与P53负反馈调节通路， 从而增强P53蛋白的稳定性和转录活性，参与肿瘤抑制。但迄今为止，仍然没有关于热休克 蛋白及肾细胞癌之间相关性的报道。
【发明内容】
[0005]基于此，本发明提供一种多聚谷氨酰化DNAJC7的新应用，通过检测生物样本中的 多聚谷氨酰化DNAJC7含量，可以提示肾细胞癌的存在可能性。
[0006]实现上述目的的技术方案如下：
[0007]血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为诊断肾细胞癌分子标志物的应用。
[0008] 本发明还公开了一种多聚谷氨酰化DNAJC7的检测试剂盒，包括有检测血清中多聚 谷氨酰化DNAJC7的试剂。
[0009]在其中一个实施例中，该检测试剂盒包括：
[0010] 固定相体系:包括包被于固定相的DNAJC7抗体；
[0011] 标志物体系:包括直接或间接连接标记示踪物的GT335。
[0012]所述GT335为anti-PolyglutamylationModificationmAb，是一种特异的多聚谷 氨酸检测抗体，能够与所有的多聚谷氨酰化形式蛋白质结合。
[0013]在其中一个实施例中，所述标志物体系中，所述间接连接标记示踪物的GT335由生 物素标记的GT335，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成。
[0014]在其中一个实施例中，所述固定相体系为包被DNAJC7抗体的微孔板，所述标记示 踪物为辣根过氧化物酶。可以理解的，也可通过磁性微球等可在特定环境下固定，不被清洗 掉的固定相来作为DNAJC7抗体的载体，也可采用其它标记示踪物在化学发光免疫分析方法 中反应待测物的含量水平。
[0015]本发明还公开了血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为标志物在开发和/或制备具有诊 断肾细胞癌用途的产品中的应用。
[0016] 本发明还公开了检测血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的物质在制备肾细胞癌诊断试 剂或诊断设备中的应用。
[0017]本法明还公开了一种多聚谷氨酰化DNAJC7的检测方法，包括以下步骤
[0018] 将DNAJC7抗体作为底物包被微孔板，加入待测血清样本、直接或间接连接标记示 踪物的GT335,显色后检测各个孔的发光强度，根据发光强度计算得到多聚谷氨酰化DNAJC7 的含量。
[0019] 本发明还公开了一种上述的多聚谷氨酰化DNAJC7的检测方法在制备肾细胞癌诊 断试剂或诊断设备中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] 本发明通过对大量肾细胞癌患者手术切除后的肾癌组织和癌旁组织，以及肾细胞 癌患者和健康对照组的血清样本的DNAJC7mRNA水平进行了qRT-PCR检测，结果显示没有太 大的差异。但是，在免疫沉淀分析中的结果显示肾细胞癌患者血清中多聚谷氨酰化DNAJC7 (polyglutamylated_DNAJC7)的含量明显高于健康对照组。本发明人进一步使用生物素标 记的GT335检测多聚谷氨酰化DNAJC7的水平后发现，肾癌细胞患者血清中有较强的信号，显 著高于对照组(P〈0.01)。证明肾癌细胞患者血清中存在P〇lyglutamylated-DNAJC7,而健康 人或者肾炎患者血清中几乎不存在，因此，多聚谷氨酰化DNAJC7可以单独作为肾细胞癌的 分子标志物，通过检测血清样本中的多聚谷氨酰化DNAJC7含量，能够准确地将肾细胞癌患 者与健康人群、慢性肾炎及肾结石患者鉴别开来。
[0022] 本发明为快速准确的诊断肾细胞癌，提供了一种客观、准确的评价标准，减少一些 影像学特征不典型案例误诊的可能，并且无需进行组织活检，具有操作简单，成本低，效率 高，无副作用的优点。这也对于临床诊断试剂盒的研制具有极大的应用价值。
【附图说明】
[0023]图1为本发明病例样本选择、分组和实验情况示意图。
【具体实施方式】
[0024]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用 化学试剂，均为市售产品。
[0025]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语"和/或"包括一个或多个相 关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0026]以下实施例所用的部分原料来源为：
[0027]DNAJC7抗体：购自SantaCruzBiotechnology，批号sc-100716〇
[0028]biotin-GT335:购自AdipoGen，SanDiego，California，USA，批号AG-20B-0020B〇
[0029] strepavidin-HRP:购自Beyotime，批号A0303 〇
[0030] 如图1所示，本发明人在临床工作中积累收集了肾细胞癌患者，慢性肾炎患者，肾 结石患者和健康人群的血清样本共1585例，经过初步筛查后排除50例样本，其中：21例为其 它尿路炎性疾病，17例有其他肿瘤病史，12例为重复入选病例。
[0031] 将剩余的1535例样本随机分为两部分，作为后续检测分析用。
[0032]第一部分包括92例样本，其中包括30例肾细胞癌患者，15例慢性肾炎患者，17例肾 结石患者和30例健康人群。用于建立诊断方法和评估标准，为检测人群。
[0033] 第二部分包括1443例样本，其中包括805例肾细胞癌患者，128例慢性肾炎患者， 125例肾结石患者和385例健康人群。用于验证诊断效果，为验证人群。
[0034] 实施例1
[0035]多聚谷氨酰化DNAJC7作为肾细胞癌标志物方法的建立。
[0036]将上述第一部分92例的人群中30例肾细胞癌患者手术切除后的肾癌组织和癌旁 组织，以及肾细胞癌患者和健康对照组的血清样本中的DNAJC7mRNA水平进行了qRT-PCR检 测，方法如下：
[0037] 使用RNAminiprepkit(LCSciences,Houston,TX,USA)提取组织和血清样本中的 总RNA，用M-MLV逆转录酶(？仰11^^3，]\&1(1丨8〇11，11，1]3)将1?熟逆转录为〇0嫩。
[0038] 进一步使用ABI7300qPCR系统对上述cDNA进行扩增。引物序列：β-actin forward:5'-GTCACCAACTGGGACGACAT-S'(SEQIDNO:1),reverse:5'-AGGGATA GCACAGCCTGGAT-3'（SEQIDN0:2)，200bp;CCP6forward:5'-CGCTTCCGAGTCTGGTTCAA-3' (SEQIDN0:3)，reverse:5'-CCATAGGGGCCATCCCATCT-3'（SEQIDN0:4)，157bp;DNAJC7 forward:5'-GGTAATCGAGCAGCCACCTT-3'(SEQIDNO:5 ) ,reverse: 5 '-CTCTCTGGAAGCTGCGACAT-3'（SEQIDN0:6)，169bp;mRNA水平的定量用β-actinmRNA水平进 行标