一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗体检测方法，具体涉及到一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测 方法。
【背景技术】
[0002] ELISA(Enzyme-1inkedImmunosorbentAssay)为酶联免疫吸附试验的缩写，该方 法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合 起来的一种敏感性很高的分析技术。其基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体 表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原 或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，被检样品(含有受检的抗体或抗原） 和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合。通过洗涤除去未结合的游离反应 物，最后，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底 物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，使用酶标仪 即可定性或定量分析。
[0003] 铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在 的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。铜绿假 单胞菌是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌;是引发麝出现化脓性疾病 的主要菌株。因此通过对麝血清中是否含有抗体进行检测，以进行科研是非常必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，以及使用抗体检测试剂 盒检测麝血清中抗体的方法。
[0005]为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂 盒，包括：
[0006] 酶标板，用于提供固相载体；
[0007]包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；
[0008] 阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标二抗以及终止液。
[0009] 进一步的，阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔血清，阴性血清为健康麝血清;洗 涤液为PBST溶液，显色液为TMB试剂;酶标二抗为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌 蛋白A;终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种铜绿假单胞菌抗体的检测方法，包括以下步骤：
[0011] 1)、将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，于37°c条件下作用0.5h~3h，反应完 毕后加入洗涤液静置3min~lOmin，然后洗涤；
[0012]2)、在酶标板中加入稀释后的酶标二抗HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌 蛋白A，于37°C条件下作用0.5h~3h;加入洗涤液静置3min~lOmin后再洗涤；
[0013] 3)、洗涤完毕后加入显色剂反应lOmin~20min，显色反应完毕后加入终止液终止； 并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。
[0014]进一步的，待检血清的加入量为50yL/孔~200yL/孔。
[0015] 进一步的，洗涤时间为3min~lOmin。
[0016] 进一步的，酶标二抗的加入量为50yL/孔~200yL/孔；酶标二抗的稀释度为1: 64000〇
[0017] 进一步的，显色剂的加入量为50yL/孔~200yL/孔，显示反应的温度为37°C。
[0018] 进一步的，终止液的加入量为50yL/孔~200yL/孔。
[0019] 进一步的，第一种洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2P〇4〇.27g，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-200.5mL。
[0020] 进一步的，第二种洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2P〇4〇.27g， Na2HP〇4.12H20 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-200.5mL，庆大霉素0.02g，硫酸铵 0 · 05g〇
[0021] 本发明的反应机理
[0022] 本研究采用间接ELISA方法检测血清标本中的铜绿假单胞菌抗体。以提取的铜绿 假单胞菌Sp-Ι株的外膜蛋白作为包被抗原，包被酶标板，制成固相抗原。往包被抗原的孔中 加入待检血清，如果血清中有该抗体，则与随后加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球 菌A蛋白（SPA)结合，形成抗原-抗体-HRP-SPA复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm和 630nm的双波长下测定吸光度(0D值）。
[0023]本发明的试剂盒以及检测方法，可以准确的检测麝血清中的抗体，高效迅速，不仅 具有良好的特异性，而且操作简单，成本低廉。
【具体实施方式】
[0024]免疫原的制备
[0025]将铜绿假单胞菌Sp-Ι菌株复壮培养后，挑取单个菌落接种于100mL普通肉汤培养 基，于37°C160r/min摇床振荡培养16h后作为种子液，此种子液按1%的体积比接种于新鲜 普通肉汤中进行增菌培养12~18h。
[0026]按培养基总体积加入终浓度为0.4%的甲醛灭活，37°C温箱培养24h，期间拿出摇 晃几次。将灭活后菌液6000r/min离心15min，弃上清，用灭菌的0.lmol/L、PH7.4的PBS洗涤3 次，调节菌含量至1.0X101()CFU/mL，备用。然后釆用注射器混匀法，取上述菌液和等量的弗 氏完全佐剂分别加入小瓶中，反复抽吸吹打注射器，直至形成油包水乳剂为止，滴在水中不 立即扩散，4°C保存情况下不分层即可，并以此作为首免抗原。另取上述部分灭活菌液加入 弗氏不完全佐剂制成后续免疫抗原。
[0027] 免疫程序
[0028]a.基础免疫:首次免疫用弗氏完全佐剂抗原在4只健康家兔的背部皮下多点注射， 2.5mL/只；第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐剂抗原，剂量同前，每次免疫间隔14d。 在第三次免疫前采取少量耳缘静脉血，检测血清抗体效价。
[0029]b.加强免疫:三次免疫后一周，每只家兔再用3mL未灭活的等量浓度菌液进行加强 免疫，一周后米血检验血清效价。
[0030] Sp-1株抗血清的分离
[0031] 采集的血液置37°Clh后转入4°C冰箱过夜，小心吸取析出的血清，经3000r/min离 心15min，分装于1.5mL的EP管，存于_80°C备用。
[0032 ]双向琼脂扩散试验测免疫血清效价
[0033]以提取的铜绿假单胞菌外膜蛋白作为抗原，将分离的Sp-Ι株抗血清以2倍比稀释， 采用双向琼脂扩散试验检测抗体效价，同时设阴性对照和生理盐水的空白对照。效价达到 1:8倍的可作为本试验中的阳性血清。
[0034]本发明提供一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：
[0035]酶标板，用于提供固相载体；
[0036]包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；
[0037]阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标二抗以及终止液。
[0038]其中，阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔血清，阴性血清为健康麝血清;洗涤液 为TOST溶液，显色液为TMB试剂;酶标二抗为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白 A;终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0039]铜绿假单胞菌抗体ELISA的检测方法
[0040] 1)、将待检血清加入到酶标板孔内，每孔100yL，于37°C条件下作用1.5h，反应完毕 后加入洗涤液静置5min，然后洗涤3次；
[0041 ] 2)、在酶标板中加入稀释后的酶标二抗HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌 蛋白A，酶标二抗的稀释度为1:64000，每孔100yL，于37°C条件下作用1.5h;加入洗涤液静置 5min后再洗涤；
[0042] 3)、洗涤完毕后加入显色剂在37°C下反应15min，每孔100yL，显色反应完毕后加入 终止液2mol/L的硫酸终止;并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。
[0043] 其中，洗涤液为？831'溶液，每升？831'溶液中含有1012?〇4〇.278，似 2耶〇4，12!120 3.58g，NaCl8.0g，KCl0.2g，吐温-200.5mL;庆大霉素0.02g，硫酸铵0.05g。
[0044]实施例1:检测条件的选择 [0045]抗原包被条件的优化
[0046]以确定的外膜蛋白浓度包被酶标板，将包被条件设为4°C条件下分别放12h、24h， 37°C条件下分别放此、211、311、411，共6组，每组做两个重复。以确定的最佳稀释倍数稀释血 清，HRP-SPA做1: 2000稀释，其余按常规间接ELISA程序进行试验。以P/N值最大的一组为抗 原最适包被条件。
[0047]从表1可以看出，37°C包被条件下的P/N值明显大于4°C包被条件下的P/N值。