一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌检测试剂盒及 其应用。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)，又名绿脓杆菌，为专性需氧、非发酵型 革兰氏阴性杆菌。该菌广泛分布于水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等潮湿环境中，是 一种重要的机会致病菌，经常引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，甚至引发败 血症和菌血症，严重时可导致死亡。
[0003]鉴于其对人类健康的严重威胁，国内外对生活饮用水、天然矿泉水、化妆品等产品 中均对铜绿假单胞菌进行了严格的"不得检出"限量。2015年5月24日，我国实施了包装 饮用水新标准《GB19298~2014》，其中微生物指标中亦将铜绿假单胞菌纳入，限定取样5 个且每个样均要求250mL水中不得检出铜绿假单胞菌。自此，饮用水中铜绿假单胞菌的限 量不止于天然饮用矿泉水，而是囊括了所有可直接饮用的包装饮用水。
[0004]目前，对于铜绿假单胞菌的检测，国内外仍多沿用传统的培养、分离及生化鉴定 法，耗时长达3~5d、操作繁琐、准确度低，难以满足快速检测的需求。而以PCR技术为代表 的现代分子生物学方法，通过特异引物在热循环仪中对靶标基因片段进行指数倍增、信号 放大，已成为致病菌快速检验的理想之选。对于具有重要卫生学及病理学研究意义的铜绿 假单胞菌，国内外研究者多年来一直致力于其PCR鉴定的靶基因及引物序列的筛选，常用 的序列包括 16SrDNA、16S~23SrDNA113、<^1'1、<^1^、;1^1;[(]、85^13、6〇€乂等，但其可靠度 及重复性不理想，不同报道间说法不一，在实际操作中的存在一定的疑虑。因此，亟需设计、 筛选靶向于铜绿假单胞菌的高特异性引物及检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种铜绿假单胞菌检测试剂盒。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的应用方法。
[0007] 本发明的具体技术方案如下：
[0008]一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，包括包含SEQID01所示序列的上游引物、包含SEQID02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白 对照，该试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
[0009]
[0010] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL 的PCR反应体系中包括：
[0011]
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR反应的扩增温度程序如下：94~95°C 预变性5~5. 5min;94~95°C变性1~1. 5min、60~62°C退火30~35s、72~73°C延伸 15~20s，35~38个循环；72~73°C再延伸7~8min。
[0013] 进一步优选的，所述PCR反应的扩增温度程序如下：94°C预变性5min;94°C变性 111^11、60°(：退火3〇8、72°(：延伸158,35个循环；72°(：再延伸711^11。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择 性增菌液中含有胰蛋白胨10~12g、氯化钠10~12g、酵母提取物5~7g、十六烷三甲基溴 化铵0· 2~0· 4g和萘啶酮酸0· 015~0· 025g。
[0015] 进一步优选的，所述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰 蛋白胨l〇g、氯化钠l〇g、酵母提取物5g、十六烷三甲基溴化铵0. 2g和萘啶酮酸0. 015g。
[0016] 一种应用上述铜绿假单胞菌检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
[0017] (1)用所述选择性增菌液扩大培养待测样品，然后提取DNA作为待测模板；
[0018] (2)将待测模板、阳性对照、阴性对照和空白对照分别进行PCR扩增；
[0019] (3)将步骤（2)所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1)为：将待检样品用所述选择性 增菌液37°C培养12h，取出lmL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入lmL灭菌的生理盐 水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入100μL灭菌生理盐水，沸水浴lOmin，冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为待测模板。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、本发明的试剂盒中的特异性引物为针对铜绿假单胞菌的0~抗原乙酰化酶基 因所设计，可有效区分铜绿假单胞菌和其他常见致病菌（包括19种假单胞属的其他种），实 现铜绿假单胞菌的快速、高可信度检测；
[0023] 2、本发明的试剂盒的检测方法灵敏度高、特异性强、检测时间短的特点，适用于疾 控、质监、医院等部门用于饮用水、食品、化妆品及病理样本中铜绿假单胞菌的快速检测。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例2中引物特异性验证结果。其中Μ为lOObp Marker, 1~6 为铜绿假单胞菌标准菌株及经确诊的分离株，7~25为假单胞属的其他菌，26~33为其他 致病菌，34为空白对照（双蒸水为模板）具体菌株名称见实施例1 ;
[0025] 图2为本发明实施例3中10个瓶/桶装饮用水样PCR扩增结果。其中1~10为 10个供试样水，Μ为lOObp Marker, 11~13分别为阳性对照、阴性对照和空白对照。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0027] 实施例1
[0028] 一种铜绿假单胞菌检测试剂盒，包括如SEQID01所示序列的上游引物、如SEQID 02所示序列的下游引物、选择性增菌液、PCR反应试剂、阳性对照、阴性对照和空白对照，该 试剂盒的PCR反应体系中各组分的比例如下：25μL的PCR反应体系中包括：
[0029]
[0031] 上述PCR反应的扩增温度程序如下：94°C预变性5min;94°C变性lmin、60°C退火 30s、72°C延伸15s，35个循环；72°C再延伸7min。
[0032] 上述选择性增菌液的配方比例为：1L所述选择性增菌液中含有胰蛋白胨10g、氯 化钠l〇g、酵母提取物5g、十六烷三甲基溴化铵0. 2g和萘啶酮酸0. 015g。
[0033] 应用上述铜绿假单胞菌检测试剂盒进行检测的方法，具体包括如下步骤：
[0034] (1)用所述选择性增菌液扩大培养待测样品，然后提取DNA作为待测模板：将待检 样品用所述选择性增菌液37°C培养12h，取出lmL，12000rpm离心5min，弃去上清，加入lmL 灭菌的生理盐水，12000rpm离心5min，弃去上清，加入100μL灭菌生理盐水，沸水浴lOmin， 冰浴3min，12000rpm离心5min，取上清作为待测模板；
[0035] (2)将待测模板、阳性对照、阴性对照和空白对照分别进行PCR扩增；
[0036] (3)将步骤⑵所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：取PCR产物5μL，于 1%琼脂糖凝胶中120V电泳15min，而后利用凝胶成像系统观察、拍摄，所获得的特征性片 段的大小为268bp。
[0037] 实施例2 :本发明中检测引物的特异性验证。
[0038] 本实施例分别提取6株铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、 ATCC15442、ATCC9027、CGMCC1. 10274、CGMCC1. 10452、XMZJ~1(实验室分离，经 VITEK2Compact鉴定确证为铜绿假单胞菌）、19株假单胞属的其他细菌[产氮假单胞菌 (P.azotoformans)CGMCCl. 1792、霉味假单胞菌（P.mucidolens)CGMCCl. 1795、产碱假单胞 菌（P.alcaligenes)CGMCC1. 3361、恶臭假单胞菌（P.putida)CGMCC1.3301、类产碱假单 胞菌（P.pseudoalcaligenes)CGMCC1.2935、施氏假单胞菌（P.stutzeri)CGMCCl. 3340、 门多萨假单胞菌（?.1^11(100;[11&)06]\0^ 1.2965、铁角蔵假单胞菌（?.&8。1611；[;006]\0^ 1.4995、绿针假单胞菌（P.chlororaphis)CGMCC1.2887、菊苣假单胞菌（P.cichorii) CGMCC1.4934、变黄假单胞菌（P.flavescens)CGMCCl. 6138、香茅醇假单胞菌 (P.citronellolis)CGMCCl. 6143、杰氏假单胞菌（P.jessenii)CGMCCl. 8855、栖麦假单胞 菌（P.oryzihabitans)CGMCC1. 3158、丁香假单胞菌（P.syringae)CGMCC1. 3305、浅绿黄假 单胞菌（P.viridiflava)CGMCCl. 3180、腐臭假单胞菌（P.CGMCC1. 3356)CGMCC1. 3356、隆 德假单胞菌（P.lundensis)CGMCCl. 8731、荧光假单胞菌（P.fluorescens)CGMCCl. 6279]、 8株其他致病菌[金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)CMCC26112、阪崎克罗诺杆 菌（Cronobactermuytjensii)ATCC51329、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus) ATCC17802、单增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes)ATCC19115、甲型副伤寒沙门氏菌 (Salmonellaser.ParatyphiA)CMCC50001、嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus) ATCC19258、溶血性链球菌（Streptococcuspyogenes)CMCC32201、大肠埃希氏杆菌 (Escherichiacoli)CMCC44113]的DNA作为模板，同时以双蒸水替代细菌DNA作为空白对 照，进行PCR反应，验证本发明实施例1中引物的特异性。
[0039] 所使用的主要检测仪器：
[004