铜绿假单胞菌的psl胞外多糖的合成寡糖亚基及其用图

铜绿假单胞菌的psl胞外多糖的合成寡糖亚基及其用图
【专利摘要】本披露涉及假单胞菌胞外糖Psi的合成的寡糖亚基及其用途，例如用于抗Psl抗体的表位作图、用于抗Psl抗体的鉴定以及用作疫苗。在一个方面中提供了铜绿假单胞菌PsI寡糖的合成的寡糖亚基，该合成的寡糖亚基包括具有式I的三糖。
【专利说明】铜绿假单胞菌的PSL胞外多糖的合成寡糖亚基及其用途 背景 披露领域
[0001] 本披露涉及一种抗假单胞菌Psl结合分子及其用途，特别是在预防和治疗假单胞 菌感染中的用途。此外，本披露提供了用于预防和治疗假单胞菌感染的组合物和方法。 披露背景
[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)是导致受损个体的急性 和慢性感染两者的革兰氏阴性机会病原体（马（Ma)等人，《细菌学杂志》（Journal of Bacteriology) 189(22) :8353-8356(2007))。这部分是由于细菌对于临床使用的抗生素的 高先天抗性，并且部分是由于高度抗生素抗性生物膜的形成(德伦柯克(Drenkard E)，《微 生物与感染》(Microbes Infect)5:1213-1219(2003);汉柯克(Hancock)&斯伯特（Speert)， 《耐药性新资讯》(Drug Resist Update)3:247-255(2000))。
[0003] 铜绿假单胞菌是西方世界中的医院获得性感染的常见病因。它是烧伤受害者和免 疫受损个体的菌血症的常见致病因子(莱克扎克(Lyczak)等人，《微生物与感染》(Microbes Infect)2:1051-1060(2000))。它还是医院性革兰氏阴性肺炎尤其是在机械通气患者中的 最常见病因（克莱汶(Craven)等人，《呼吸道感染研讨会》(Semin Respir Infect)ll :32-53 (1996))，并且是患有囊性纤维化的个体的肺中的最普遍病原体(皮埃尔(Pier)等人，《美国 微生物学新闻杂志》(ASM News)6:339-347(1998))。严重铜绿假单胞菌感染可变成全身性 的，从而导致败血症。败血症的特征是严重全身性炎症，经常导致多器官功能衰竭和死亡。
[0004] 假单胞菌Psl胞外多糖据报告可锚定于铜绿假单胞菌的表面、并且被认为在促进 定殖于宿主组织和建立/维持生物膜形成方面是重要的（杰克逊(Jackson K.D.)等人，《细 菌学杂志》(J Bacteriol) 186,4466-4475(2004))。它的结构包括富含甘露糖的重复五糖 (伯德(Byrd M.S.)等人，《分子微生物学杂志》(Mol Microbiol)73,622-638(2009))。
[0005] 由于多药耐药性不断增加，在本领域中仍然需要开发用于鉴别新的假单胞菌特异 性预防和治疗剂的新颖策略。
[0006] 2012年6月8日提交的PCT/US 2012/041538(通过引用以其全文结合在此）描述了 特异性地结合至不依赖于血清型的Psl胞外多糖的单克隆抗体(mAb)。还参见迪贾恩多梅尼 戈（DiGiandomenico，Α·)等人，（2012)，《实验医学杂志》（J Exp Med)209:1273-87，通过引 用以其全文结合在此。基于竞争性结合测定，这些抗体被分为三组(I类、II类、和III类）。结 合I类和Π 类表位的抗体彼此是非竞争性的，而靶向III类表位的单独抗体，WapR-016，部分 地与靶向I类和II类表位的抗体竞争。结合至铜绿假单胞菌临床分离株的抗Psl mAb的调查 表明，从获得自确认的急性感染的分离株观察到，在85%的所有测试的分离株中（147/ 173)，Psl表达/可及性具有更大反应性(96%)。这些结果表明，在非粘液状和粘液状临床分 离株中，Psl是表面可接近的并且占优势的新颖的不依赖于血清型的保护性抗原。
[0007] 在本领域中对鉴定结合I类、II类和III类抗Psl Mab的Psl的区域以便产生并且筛 选新抗体、并且用于用作疫苗组分仍存在需要。 简要概述
[0008] 本披露提供了假单胞菌Psl寡糖的合成寡糖亚基。
[0009] 在一个方面中，提供了铜绿假单胞菌Psl寡糖的合成的寡糖亚基，包括具有式I的 三糖。
是-OX，其中X是氢、烷基基团、或芳基基团；接头，其中接头 COOH、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2) m-NH2、-0- (CH2) n-S (CH2) m-C00H、-0- (CH2) n-S (CH2) m-N3、-0- (CH2) n_S〇2 (CH2 )m-NH2、-0- (CH2) n_S〇2 (CH2 )m_C00H、或-0- (CH2) n_S〇2 (CH2 )m_N3，其中 n 和m是相同的或不同的，并且独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10;或经由辄合偶联至异源 部分的接头，其中该异源部分可以是蛋白质、脂质或聚合物。根据这一方面的寡糖亚基可以 由抗Psl单克隆抗体WapR-016、或其抗原结合片段特异性地结合。
[0010]在某些方面中，具有式I的寡糖亚基包括六糖：
[0011] 在某些方面，特异性地结合至具有式I的寡糖亚基的单克隆抗体WapR-016包括对 应地为SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的VH和VL氨基酸序列。
[0012] 在另一个方面中，提供了铜绿假单胞菌Psl寡糖的合成的寡糖亚基，包括具有式II 的四糖：
接头可以是-0- (CH2) n-NH2、-0- (CH2) η-⑶ OH、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2) m-NH2、-0-(CH2 ) n-S ( CH2 ) m_⑶OH、-Ο- ( CH2 ) n-S ( CH2 ) m_N3、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 ( CH2 ) m_NH2、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 (CH2)m-C00H、或-O-(CH2)n-SO 2(CH2)m-N3,其中n和m是相同的或不同的，并且独立地是0、I、2、 3、4、5、6、7、8、9、或10;或经由辄合偶联至异源部分的接头，其中该异源部分可以是蛋白质、 脂质或聚合物。根据这一方面的寡糖亚基可以由抗Psl单克隆抗体WapR-OOl、或其抗原结合 片段特异性地结合。
[0013] 在某些方面中，具有式II的寡糖亚基包括四糖：
[0015]在某些方面中，单克隆抗体WapR-016并不结合至以上示出的四糖或五糖。
[0016]在某些方面，特异性地结合至具有式II的寡糖亚基的单克隆抗体WapR-OOl包括对 应地为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的VH和VL氨基酸序列。
[0017] 在某些方面中，在此提供的任何寡糖亚基可以辄合至多肽、脂质、或聚合物。在某 些方面中，多肽可以是白蛋白，例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
[0018] 本披露进一步提供了评价抗铜绿假单胞菌Psl抗体或其抗原结合片段与铜绿假单 胞菌Ps 1表位的结合特征的方法。在某些方面中，该方法包括(a)在允许抗体结合寡糖亚基 的条件下，使抗体与如在此提供的寡糖亚基接触;并且(b)检测抗体和寡糖亚基的复合物的 存在。在某些方面中，通过免疫测定，例如ELISA测定检测该复合物。在某些方面中，该方法 可以进一步包括：（c)如果抗体结合上述四糖、五糖、六糖、和十糖中的每一个，则将该抗体 分类为结合至II类表位;和/或(d)如果抗体结合上述六糖或十糖，但是并不结合上述四糖 或五糖，则将该抗体分类为结合至III类表位。
[0019] 本披露进一步提供了筛选结合至铜绿假单胞菌Psl的抗体的方法。在某些方面中， 该方法包括(a)在允许Psl特异性抗体或其片段结合寡糖亚基的条件下，使抗体或抗体片段 文库与如在此提供的寡糖亚基接触；（b)检测抗体和寡糖亚基的复合物的存在;并且(c)选 择结合至寡糖亚基的抗体。在某些方面中，通过免疫测定，例如ELISA测定检测该复合物。
[0020] 本披露进一步提供了用于例如用作疫苗的包含寡糖亚基的组合物，如药物组合 物。 附图/图简要说明
[0021]图IA示出了铜绿假单胞菌的Psl寡糖的基本重复结构。图IB示出了用于Psl表位作 图的四个合成寡糖亚基;化合物1是十糖，化合物2是五糖，化合物3是四糖，并且化合物4是 六糖。
[0022]图2示出了用于合成图IB中示出的化合物的结构单元。在实例1中详细描述的合成 方案中提到了称为中间结构I -12的化合物编号。
[0023]图3A-D示出了结合至合成的Ps 1寡糖的抗PsI mAb。按照表明的碳水化合物浓度， 微量滴定板涂覆有四糖(3) -BSA辄合物(3A)、五糖(2) -BSA辄合物(3B)、六糖(4) -BSA辄合物 (3C)、和十糖（I)-BSA辄合物（3D)。测试了抗Psl mAb I类(Cam-003，·）、ΙΙ类(WapR-OOl， )、III类(WapR-016，▲)和R347(?) (5yg/mL)的与每一寡糖组分的反应性。光密度(OD)值 被报告为平均土SD。〗类(Cam-003)、11类(WapR-OOl)、和III类(WapR-016)抗Psl mAb都预先 示出结合至源自铜绿假单胞菌的Ps 1的三种独特表位。 详细说明 I.定义
[0024]应指出的是术语"一个"或"一种"实体是指一个或多个所述实体;例如，"一种特异 性结合至假单胞菌Psl的结合分子"应理解为代表特异性结合至假单胞菌Psl的一种或多种 结合分子。因此，术语"一个"（或"一种"）、"一个或多个（一种或多种)"、以及"至少一个" ("至少一种"）在此可互换地使用。
[0025]此外，在本文中使用"和/或"应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的 特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在此在措词如"A和/或B"中所使用的术语"和/ 或"旨在包括"A和B"、"A或B"、"A"（单独）、以及"B"（单独）。同样，如在措词如"A、B和/或C"中 所使用的术语"和/或"旨在涵盖以下方面中的每一者:A、B、和C;A、B、或C;A或C;A或B;B或C; A和C;A和B;B和C;A(单独）；B(单独）；以及C(单独）。
[0026]应当理解，当用语言"包含"来说明方面时，还提供了关于"由……组成"和/或"主 要由……组成"描述的其他类似方面。
[0027] 除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属 的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，《生物医学与分子生物学简明词典》(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo，Pei_Show，第二版，2002，CRC 出版社;《细胞与分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)， 第三版，1999,学术出版社（Academic Press);以及《生物化学与分子生物学牛津词典》 (Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000,牛津大 学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了在本披露中使用的许多术语的通 用词典。
[0028] 单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统（SI)接受形式表示。数值范围包括定 义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此 提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得 这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
[0029] 术语"寡糖"是指包含两个或更多个单糖的分子。单糖是任何碳水化合物的基本结 构单元。单糖具有基本分子式:CnH2nOn，但是通常具有取代。可以通过在此描述的方法，或通 过本领域普通技术人员已知的方法制造寡糖。术语"多糖"可以与术语"寡糖"可互换地使 用，但是通常是指单糖的相对更长的链。
[0030]术语"合成的寡糖"或"合成的寡糖亚基"是指寡糖例如天然存在的寡糖的多个部 分，已经通过体外化学合成产生了它们。如在此使用的，寡糖亚基是指寡糖，即包含两个或 更多个单糖的分子，它可以是更大的寡糖或多糖的一部分。例如，报告铜绿假单胞菌Psl寡 糖由包括五个单糖的重复亚基组成(参见图1A)。
[0031] 如在此使用的，术语"辄合物"是指已经通过接头共价地偶联至具有已知生物活性 的蛋白质或其他更大的分子(例如脂质或聚合物)的合成的寡糖或寡糖亚基。寡糖或寡糖亚 基可以例如通过糖苷间的氧或硫而辄合。
[0032] 如在此使用，术语"多肽"旨在涵盖单数"多肽"和复数"多肽"，并且是指由通过酰 胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语"多肽"是指具有两个或更多 个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、 "蛋白质"、"氨基酸链"或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语 包含在"多肽"的定义中，并且术语"多肽"可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换 使用。术语"多肽"还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸 化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨 基酸来进行的修饰。多肽可得自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个 指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
[0033]术语"抗体"和"免疫球蛋白"在此可互换地使用。如在此披露的抗体或其片段、变 体或衍生物包含至少重链的可变域和至少重链和轻链的可变域。脊椎动物系统的基本免疫 球蛋白结构已得到相对充分地认识。参见例如哈洛（Harlow)等人，抗体：实验室手册 (Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。
[0034]本领域技术人员将认同，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε( γ、μ、α、δ、ε)，它们之中有一 些子类(例如γ 1-丫4)。此链的性质是将抗体的"类别"分别确定为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。 免疫球蛋白亚类（同种型）例如]^1、]^2、]^3、]^4、]^1等被充分表征，并且已知可赋予功 能特化。这些类别和同种型中的每一个的修饰形式在考虑本披露的情况下对于本领域技术 人员来说是可容易地辨别的，并且因此在本披露的范围内。
[0035] 轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。总体上，轻链和重 链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞来产生时， 两个重链的"尾"部分通过共价二硫键或非共价键来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构 型的分叉端的N末端延伸至每个链底部的C末端。
[0036] 轻链与重链两者均划分到具有结构和功能同源性的区域之中。术语"恒定"和"可 变"是在功能上使用。在这方面，应理解轻(VL)与重(VH)链部分的可变域决定抗原识别和特 异性。相反地，轻链(CL)和重链(CHl、CH2或CH3)的恒定域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘 移动性(transplacental mobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号 随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N末端部分是可变区并且C末 端部分是恒定区;CH3和CL域实际上相应地包括重链和轻链的羧基末端。
[0037] 如上所指示，可变区允许抗体选择性地识别并且特异性地结合抗原上的表位。即， 抗体的VL域和VH域或互补决定区（CDR)的子集组合以便形成限定三维抗原结合位点的可变 区。这种四级结构形成了存在于Y的每个臂的末端处的抗原结合位点。更确切地说，该抗原 结合位点是由在各VH和VL链上的三个CDR所限定的。
[0038] 抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、 人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab '和F (ab '）2、Fd、 Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH域的片段、由Fab表 达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5，892,019之 中。
[0039] "特异性地结合"一般是指结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物经由其抗 原结合域来结合至表位，并且这种结合需要抗原结合域与表位之间有某种互补性。根据此 定义，当与结合分子将结合至随机、不相关的表位相比，该结合分子更容易经由其抗原结合 域来结合至一个表位时，该结合分子被认为是"特异性地结合至"该表位。术语"特异性"在 此用于对某种结合分子结合至某种表位的相对亲和力进行定性。例如，与结合分子"B"相 比，结合分子"A"可被视为针对给定的表位具有较高特异性，或与结合分子"A"针对相关表 位"D"所具有的特异性相比，结合分子"A"可被认为以较高特异性地结合至表位Τ'。
[0040]抗体或其片段、变体或衍生物被认为竞争性抑制参考抗体或抗原结合片段与给定 表位的结合，如果它优先结合至所述表位至它在某种程度上阻断参考抗体或抗原结合片段 与该表位的结合的程度的话。竞争性地抑制可以通过在本领域中已知的任何方法、例如竞 争ELISA测定来确定。结合分子可被认为是竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定 表位的结合达至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、或至少50%。
[0041]如在此使用，术语"亲和力"是指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的 度量。参见例如哈洛（Harlow)等人，《抗体：实验室手册》（Antibodies : A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)， 第27-28页。如在此使用，术语"亲合力"是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合物的总体稳 定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度。参见例如哈洛(Harlow)，第29-34页。亲 合力与群体中的单独抗体分子与特定表位的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效 价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用 将是高亲合力的相互作用。
[0042] 如在此使用，术语"处理（treat)"或"治疗（treatment)"是指治疗性处理和预防 (prophylactic)或预防(preventative)措施，其中目标是预防或减缓(减轻)不希望的生理 变化、感染或病症。有益或所希望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病程度、疾病 病况稳定化（即不恶化）、清除或减少受试者体内的感染剂如铜绿假单胞菌、延迟或减缓疾 病进展、改善或缓和疾病病况、以及减轻(不论部分或完全），不论可检测到或不可检测到。 "治疗"还可意指如与未接受治疗时的预期存活相比，延长存活。需要治疗的那些包括已经 患有感染、病状或病症的那些，连同倾向于患有病状或病症的那些，或病状或病症有待预防 的那些，例如在易患铜绿假单胞菌感染的烧伤患者或免疫抑制患者中。
[0043] "受试者"或"个体"或"动物"或"患者"或"哺乳动物"，是指希望诊断、预后或治疗 的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、 体育或宠物动物如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。 II.假单胞菌Psl寡糖和抗Psl抗体
[0044]在体内，Psl促进铜绿假单胞菌至上皮细胞的附着，并且是形成和维持生物膜所必 需的（迪贾恩多梅尼戈(DiGiandomenico,A.)等人，《实验医学杂志》（J Exp Med)，2012， 209，1273-1287;海德伦(Hidron，A. L· )等人，《感染控制和医院流行病学》（Infect ·Control Hosp.Epidemiol)，2008,29,996-1011)。此外，Psl抑制有效的调理作用，导致降低的反应性 氧物质的嗜中性粒细胞生产和降低的由吞噬细胞的杀伤(米什拉(Mishra，M.)等人，《细胞 微生物学杂志》(J.Cell.Microbiol. )，2012,14,95-106。在铜绿假单胞菌的表面上的Psl的 凝集素染色和可视化表明它以螺旋形式被锚定在细胞表面上。这一组织被认为是为其他生 物膜初始化组分提供了支架，由此有助于细胞-细胞相互作用（伯德(Byrd M.S.)等人，《分 子微生物学杂志》（J.Mol.Microbiol.)，2009，73,622-638) Wsl是具有相对低的分子量 (6.5仰3)的多糖，并且由分支的五糖重复单元组成（图]^)(柯查若瓦(1(〇〇1^1'〇￥3)，1'1.4.，等 人，《生物化学杂志》（J.Biol .Chem. )1988，263,11291-11295)。
[0045]假单胞菌Psl靶标可以是铜绿假单胞菌Psl，或由其他细菌物种产生的Psl样寡糖， 这些细菌物种例如是荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、或产碱假单胞菌。
[0046]最近结合功能活性筛选，使用源自健康个体或患者供体的抗体噬菌体文库，鉴定 了特异性地结合至不依赖于血清型的Psl胞外多糖的单克隆抗体(mAb)。参见迪贾恩多梅尼 戈（DiGiandomenico，Α·)等人，《实验医学杂志》（J Exp Med)，2012,209,1273-1287,以及 2012年6月8日提交的PCT/US 2012/041538。功能上表征了这些抗Psl mAb，并且它们示出 (a)抑制铜绿假单胞菌至上皮细胞的附着，（b)促进、介导、或增强铜绿假单胞菌的调理吞噬 杀伤(OPK)，或(c)抑制铜绿假单胞菌至上皮细胞的附着，并且促进、介导、或增强铜绿假单 胞菌的OPK。
[0047]通过结合至三种不同的Psl表位的竞争性结合测定，这些抗体被分为I类、II类、和 III类(表1);结合I类和II类表位的抗体彼此是非竞争性的，而靶向III类表位的单独抗体， WapR-016,部分地与靶向I类和II类表位的抗体竞争。结合至铜绿假单胞菌临床分离株的抗 Psl mAb的调查表明，从获得自确认的急性感染的分离株观察到，在85%的所有测试的分离 株中（147/173)，Psl表达/可及性具有更大反应性(96%)。这些结果表明，在非粘液状和粘 液状临床分离株中，Psl是表面可接近的并且占优势的。 表1.抗Psl单克隆抗体的特性
[0048] I类抗体或其片段包括：与包括1&?1?-004丄3111-003工3111-004、或03111-005的重链可 变区（VH)和轻链可变区（VL)区域的抗体或其抗原结合片段一样，可以特异性地结合至相同 的假单胞菌Psl表位的，和/或可以竞争性抑制假单胞菌Psl与包括WapR-004、Cam-003、Cam-004、或Cam-005的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合的那些抗体或其抗原结合片段。 [0049] II类抗体或其片段包括：与包括WapR-OOl、WapR_002、或WapR-003的重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)区域的抗体或其抗原结合片段一样，可以特异性地结合至相同的假 单胞菌Psl表位的，和/或可以竞争性抑制假单胞菌Psl与包括WapR-OOl、WapR-002、或WapR-003 的 VH 和 VL 的抗体或其抗原结合片段的结合的那些抗体或其抗原结合片段。
[0050] III类抗体或其片段包括:与包括WapR-016的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL) 的抗体或其抗原结合片段一样，可以特异性地结合至相同的假单胞菌Psl表位的，和/或可 以竞争性抑制假单胞菌Psl与包括WapR-016的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合的那 些抗体或其抗原结合片段。
[0051 ] 抗Psl Mab详细描述于2012年6月8日提交的PCT/US2012/041538中，将其通过引用 以其全文结合在此。在表2中提供了在表1中表征的示例性抗Psl Mab的VH和VL区的氨基酸 结构：
[0052] 表2:参考VH和VL氨基酸序列*
*VH和VL CDR1、CDR2以及CDR3氨基酸序列加下划线 II.合成的寡糖亚基
[0053]本披露提供了假单胞菌Psl寡糖例如铜绿假单胞菌Psl寡糖的合成的寡糖亚基。因 为关于Psl生物合成和这一复合糖是如何在铜绿假单胞菌的表面上组装的已知很少，因此 制备了化学合成的寡糖来准确地限定抗Psl mAb的结合要求。本披露提供了针对Psl的报告 的结构建模的一组寡糖的化学合成和表征（图1A)，并且限定了抗Psl mAb与每一化合物反 应的能力。目标化合物1 (图IB，化合物1)是由两个重复单元组成的十糖。此化合物包含重复 的Psl多糖的所有可能结构。目标化合物2(图1B，化合物2)是五糖，并且代表单个重复单元。 目标化合物3(图1B，化合物3)是包括具有另外的远端葡萄糖苷的重复单元的六糖。最后，目 标化合物4 (图IB，化合物4)是缺乏重复的五糖单元的分支甘露糖苷的四糖。如在以下实例 中描述，结合研究确认，靶向II类和III类表位的抗Psl mAb结合合成的Psl寡糖。有趣地，靶 向I类表位的抗Psl mAb，它产生针对铜绿假单胞菌的最具保护性的功能活性，不能与表明 对报告的Psl结构的另外的且有待阐明的修饰的合成化合物结合。
[0054]提供了限定铜绿假单胞菌Psl寡糖的III类表位的合成寡糖亚基，为包括具有式I 的三糖的合成寡糖亚基。
[0055]在某些方面中，R1可以是羟基(-OH)或根据下式的三糖亚基。
[0056]在某些方面中，R2可以是羟基(-OH)或根据下式的四糖亚基。
[0057]在某些方面中，R3可以是-0X，其中X是氢、烷基基团或芳基基团；接头，该接头包括 但不限于-0- (CH2) n-NH2、-0- (CH2) n-C00H、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2) m-NH2、-0- (CH2) η-S ( CH2 ) m-COOH、-Ο- ( CH2 ) n-S ( CH2 ) m_N3、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 ( CH2 ) m_NH2、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 ( CH2 ) m-COOH、 或-O-(CH2)n-SO2(CH 2)m-N3,其中n和m是相同的或不同的，并且独立地是0、I、2、3、4、5、6、7、 8、9、或10;或经由辄合偶联至异源部分的接头，其中该异源部分可以是，例如蛋白质、脂质 或聚合物，如以上所指出。其他适合的接头和辄合的部分、连同用于在异头碳上辄合寡糖的 方法是本领域普通技术人员所熟知的。参见例如希韦(Hevey)、兰特凌(Rand Ling)、C._C.， 2012,《未来医学化学》（Future Med.Chem)，4:545-584;莫雷利（Morelli，L.)，等人，2011， 《欧洲有机化学杂志》(Eur .J.Org.Chem.)29:5723-5777;以及科斯坦蒂诺(Costantino，Ρ·) 等人，2011，《关于药物发现的专家意见》(Exp.Opin.Drug.Disc. )6:1045-1066,将它们的每 一个都通过引用以其全文结合在此。
[0058]在某些方面中，限定了铜绿假单胞菌Psl寡糖的III类表位的合成寡糖亚基包括如 在图IB中的化合物4所示的六糖，或如在图IB中的化合物1所示的十糖。
[0059]如以上所述的合成寡糖亚基可以由III类抗Psl抗体、或其抗原结合片段特异性地 结合。例如，合成的寡糖亚基可以由抗Ps 1单克隆抗体WapR-016或其抗原结合片段特异性地 结合，该抗体或其抗原结合片段包括对应地为SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的VH和VL氨基 酸序列。如本领域普通技术人员将理解的，上述合成寡糖亚基还可以由结合至与WapR-016 所针对的相同的表位的抗Psl抗体结合。如在实例中更详细地描述，III类抗Psl抗体并不结 合至如图IB中的f 3所示的四糖或如图IB中化合物2所示的五糖。
[0060] 提供了限定铜绿假单胞菌Psl寡糖的III类表位的合成寡糖亚基，为包括具有式II 的四糖的合成寡糖亚基。
[0061] 在某些方面中，R4可以是羟基(-OH)或根据下式的单糖亚基。
[0063]在某些方面中，R3可以是-0X，其中X是氢、烷基基团或芳基基团；接头，该接头包括 但不限于-0- (CH2) n-NH2、-0- (CH2) n-C00H、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2) m-NH2、-0- (CH2) n-S ( CH2 ) m-COOH、-Ο- ( CH2 ) n-S ( CH2 ) m_N3、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 ( CH2 ) m_NH2、-Ο- ( CH2 ) n_S〇2 ( CH2 ) m-COOH、 或-O-(CH2)n-SO2(CH 2)m-N3,其中n和m是相同的或不同的，并且独立地是0、I、2、3、4、5、6、7、 8、9、或10;或经由辄合偶联至异源部分的接头，其中该异源部分可以是，例如蛋白质、脂质 或聚合物，如以上所指出。。
[0064]在某些方面中，限定了铜绿假单胞菌Psl寡糖的II类表位的合成寡糖亚基包括如 在图IB中的化合物4所示的六糖，或如在图IB中的化合物1所示的十糖，在图IB中的化合物3 所示的四糖，或在图IB中的化合物2所示的五糖。
[0065] 如以上所述的合成寡糖亚基可以由II类抗Psl抗体、或其抗原结合片段特异性地 结合。例如，合成寡糖亚基可以由包括对应地为SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的VH和VL氨基 酸序列的抗Psl单克隆抗体WapR-OOl、或其抗原结合片段，包括对应地为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的VH和VL氨基酸序列的抗Psl单克隆抗体WapR-002、或其抗原结合片段，或包括对 应地为SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10的VH和VL氨基酸序列的抗Psl单克隆抗体WapR-003、或 其抗原结合片段特异性地结合。如本领域普通技术人员将理解，上述合成寡糖亚基还可以 由结合至与WapR-001、WapR-002、和WapR-003所针对的相同的表位的抗Psl抗体结合。
[0066] 在某些方面中，本披露提供了上述合成寡糖亚基的合成中间体。在图2和实例2中 呈现了中间体的非限制性实例。 IV.寡糖辄合物
[0067]在某些方面中，如在此提供的合成寡糖亚基可以附接至异源分子，例如多肽、脂质 或聚合物。在某些方面中，寡糖亚基共价地附接至异源分子，例如辄合在其上。典型地，寡糖 通过接头，糖苷间的氧或硫而辄合至异源分子。
[0068]可以使用提供寡糖至载体的连接的常规化学技术，通过接头将如在此提供的寡糖 亚基附接至蛋白质载体。在接头和蛋白质载体及寡糖这二者间的有效共价键的方法是本领 域熟知的。非限制性实例可以涉及在不同的或相同的双官能交叉偶合试剂上的互补官能团 的使用。在某些方面中，相对于在用于结合的寡糖或蛋白质载体上可获得的或可以被引入 到用于结合的寡糖或载体上的官能团，选择互补官能团。例如，在适合的、熟知的活化剂的 存在下，在接头或蛋白质的羧酸与该蛋白质或接头的一级胺或二级胺之间的反应导致酰胺 键的形成;在该接头或蛋白质的胺基与蛋白质或接头的磺酰卤之间的反应导致磺酰胺键共 价地形成;并且在该接头或蛋白质载体的醇或酚基团与该载体或接头的烷基卤或芳基卤之 间的反应导致将载体共价地连接至接头的醚键的形成。类似地，这些互补反应可以发生在 接头与寡糖之间，以形成寡糖与接头之间的连接。
[0069] 可以辄合至如在此提供的寡糖亚基的蛋白质的非限制性实例包括白蛋白（例如人 血清白蛋白或牛血清白蛋白）、破伤风类毒素、免疫球蛋白Fc区、或钥孔虫戚血蓝蛋白。
[0070] 可以辄合至如在此提供的寡糖亚基的脂质的非限制性实例包括脂肪酸亲脂性链， 包括C6-C24脂肪酸，饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、和 二十四酸；以及不饱和脂肪酸，例如棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸。
[0071] 可以辄合至如在此提供的寡糖亚基的聚合物的非限制性实例包括聚亚烷基二醇 链，例如聚乙二醇。有用的聚乙二醇具有式H-(O-CH 2-CH2)nOH,其中n，即环氧乙烷单元的个 数，是从4至14。有用的聚乙二醇脂肪醇醚包括以下那些:其中环氧乙烷单元(η)是在1至8之 间，并且烷基基团是从C6至Cl8 〇 VII.抗Psl抗体的鉴定和表位作图
[0072] 在某些方面中，本披露提供了评价一种或多种抗铜绿假单胞菌Psl抗体或其抗原 结合片段与铜绿假单胞菌Psl表位的结合特征的方法。待评价的抗体或其片段可以包括已 经鉴定为结合至Psl的抗体、已经鉴定为结合至铜绿假单胞菌的抗体或其片段、乃至随机抗 体文库、或从曾经感染铜绿假单胞菌的渐渐复原的或恢复的个体制备的抗体文库。
[0073] 该方法可以包括(a)在允许抗体结合寡糖亚基的条件下，使一种或多种抗体或其 片段与在此提供的一种或多种寡糖亚基接触;并且(b)检测抗体或其片段和寡糖亚基的复 合物的存在。可以通过任何适合的免疫测定进行检测，这些测定中的很多是本领域普通技 术人员已知的。在某些方面中，免疫测定是ELISA测定。根据这一方法，可以将这一种或多种 抗体分类为结合至II类表位，如果它们结合至在此提供的四糖、五糖、六糖、和十糖Psl寡糖 亚基化合物，例如图IB中所示的化合物1、2、3、和4中的每一个的话。可替代地，可以将一种 或多种抗体分类为结合至III类表位，如果它们结合至在此提供的六糖和/或十糖Psl寡糖 亚基化合物，例如图IB中的化合物1和4，但是并不结合至在此提供的四糖或五糖Psl寡糖亚 基化合物，例如图IB中的化合物2和3。
[0074] 在某些方面中，这一方法可以用于选择改进的抗Psl抗体，这些改进的抗Psl抗体 例如展现出对Psl的更大亲和力或亲合力。
[0075] 在另一个方面中，该方法可以用于筛选结合至铜绿假单胞菌Psl的抗体。该方法可 以包括：（a)在允许Psl特异性抗体或其片段结合一种或多种寡糖亚基，同时对Psl非特异性 的抗体并不结合的条件下，使抗体或抗体片段文库与在此提供的一种或多种寡糖亚基接 触；（b)检测抗体或其片段和寡糖亚基的复合物的存在;并且(c)选择结合至寡糖亚基的抗 体。
[0076] 抗体文库，例如噬菌体展示文库，是本领域熟知的。具体的说，这种噬菌体可用于 展示从谱系或组合抗体文库(例如，人或鼠类)表达的抗原结合域。表达结合所感兴趣的抗 原的抗原结合域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获 于固体表面或珠粒上的抗原。这些方法中所使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，该噬菌体 包括从具有 scFv、Fab、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单独Fv区）的噬菌体表达的fd和M13结 合域或重组融合至噬菌体基因 III或基因 VIII蛋白的二硫化物稳定的Fv抗体域。示例性方 法阐明于例如EP 368684B1;美国专利5，969，108;胡根伯姆（Hoogenboom)H.R·和查恩斯 (Chames)，《当代免疫学》（Immunol .Today)21:371(2000);纳吉(Nagy)等人，《自然：医学》 (Nat.Med·)，8:801(2002);休伊（Huie)等人，《美国国家科学院院刊》 (Proc .Natl .Acad. Sci .USA) ,98:2682(2001);吕（Lui)等人，《分子生物学杂志》 (J.Mol.Biol.) ,315:1063(2002)，这些文献各自通过引用结合在此。一些出版物(例如迈克 斯(Marks)等人，《生物技术》(Bio/Technology) 10:779-783( 1992))已经描述高亲和力人抗 体通过链改组的产生，连同作为构建大噬菌体文库的策略的组合感染与体内重组。在另一 个实施例中，核糖体展示可以用于替换噬菌体作为展示平台（参见例如哈尼斯(Hanes)等 人，《自然:生物技术》(Nat .Biotechnol .)18:1287(2000);威尔逊(Wilson)等人，《美国国家 科学院院刊》9 8 : 3 7 5 0 ( 2 0 0 1 );或欧文（I r V i n g )等人，《免疫学方法杂志》 (J. Immunol.Methods)248:31(2001 ))。在又另一个实施例中，可将细胞表面文库针对抗体 加以筛选(博德(Boder)等人，《美国国家科学院院刊》97:10701(2000);多尔蒂(Daugherty) 等人，《免疫学方法杂志》243:211 (2000))。这类程序提供用于分离并且后续克隆单克隆抗 体的传统杂交瘤细胞的替代方案。 VIII.包括铜绿假单胞菌Psl的合成寡糖亚基的药物组合物 [0077]在某些方面，该Psl的合成寡糖亚基可以是用于诱导免疫应答的免疫原性组合物， 例如疫苗组合物。在某些方面，包括该合成寡糖亚基的蛋白质辄合物可以用作用于治疗假 单胞菌感染的疫苗。
[0078]如在此使用，术语"治疗"（"treatment"、"treating"）等是指获得所希望的药理学 和/或生理学效应。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效应可以是预防性的，和/或就 部分或完全治疗疾病和/或由于疾病造成的不良反应而言，该效应可以是治疗性的。如在此 使用，"治疗（treatment)"包括但不限于：（a)预防在可能易患该疾病或可能易受该疾病影 响但尚未被诊断为患有它(例如，其中该受试者易受由假单胞菌的感染但尚未被感染)的受 试者中假单胞菌相关的疾病或病症的发生，包括但不限于，降低由假单胞菌感染后的疾病 和/或死亡的风险；降低由假单胞菌感染后的疾病和/或死亡的发生率;降低由假单胞菌感 染的发生率或风险;并且降低由假单胞菌感染后疾病的程度；（b)抑制来源于假单胞菌感染 的疾病或症状，例如阻止其发展、减缓其进展;或(c)减轻来源于假单胞菌感染的疾病或症 状，例如引起疾病或症状的消退。
[0079]糖辄合物疫苗属于目前为止开发的最安全和最有效疫苗并且被广泛用于预防威 胁生命的细菌感染，例如脑膜炎和肺炎(科斯坦蒂诺(C〇stantin〇，P.)等人，《药物发现专家 评论》(Expert Opin.Drug Discov. )2011，6,1045-1066)。结合细菌多糖的独特表位并引发 不同的功能性活性的mAb的鉴定突出了合成化学在表位作图中的重要性并且对于未来的糖 辄合物疫苗的开发可以具有重要影响。具体而言，细菌多糖的碳水化合物表位的仔细选择 对于引发最优保护性应答是关键的。例如，WapR-016有力地反应于包含末端葡萄糖苷的六 糖但不佳地反应于具有相似嵌入式葡萄糖苷的化合物(参见以下实例2)的观察放大了用于 引发相关抗体的适当的合成疫苗设计的重要性。
[0080] 因此，在一个方面，本披露提供用于治疗受试者中的假单胞菌感染的方法，该方法 包括向对治疗有需要的受试者给予一种包括如在此所述的铜绿假单胞菌Psl的合成寡糖亚 基的组合物。在某些方面，该寡糖亚基辄合至载体，例如蛋白质（如人或牛血清白蛋白、破伤 风类毒素等）、脂质、或聚合物。有效量足以影响治疗，如以上所定义。具体的治疗性或预防 性治疗的给予有效量和方法可以基于个体患者和疾病的阶段连同本领域技术人员已知的 其他因素变化。
[0081] 包括在本披露中所使用的铜绿假单胞菌Psl的合成寡糖亚基的组合物可以包括本 领域普通技术人员所熟知的药学上可接受的载体。用于肠胃外给予的制剂包括无菌水性或 非水性溶液、混悬液以及乳液。如在此披露的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包 括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂 或吸入来给予。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、以 及惰性气体等。用于在此披露的治疗方法中使用的合适配制品被描述于《雷明登氏药学全 书》（Remington's Pharmaceutical Sciences)，Mack出版公司，第16版（1980)。 实例 实例1:合成用于表位作图的铜绿假单胞菌Psl的寡糖亚基
[0082] 试剂和通用程序。试剂从商业来源获得并且购买时使用。使用标准程序将二氯甲 烷(DCM)新鲜蒸馏。其他有机溶剂是购买无水的并且未经进一步纯化而使用。除非另外指 出，所有反应都在室温下在烘干的具有磁力搅拌的玻璃器皿中进行。将分子筛在使用之前 在高真空下进行火焰干燥。将有机溶液在减压下在浴温<40°C时进行浓缩。快速柱色谱法在 硅胶G60(Silicycle，60-200ym，60 A:)上进行。薄层色谱(TLC)在硅胶60F254(EMD化学公司） 上进行，检测是通过UV吸收(254nm)(当可适用时）、通过用乙醇中的20%硫酸喷雾、随后在 约150 °C下碳化或通过用(顺)6M〇7〇24 . H2O (25g/L)于乙醇中的10 %硫酸中的溶液喷雾、随后 在约150°C下碳化来进行。将1H和13C NMR光谱记录在配备有sun工作站的Varian Inova-300 (300/75MHz)、Varian Inova-500(500/125MHz)、Varian Inova-600(600/150MHz)、Varian Inova-800(800/200MHz)和Varian Inova-900(900/225MHz)光谱仪上。多重性被引述为单 峰(s)、宽单峰(br s)、双峰(d)、双二重峰(dd)、三重峰(t)或多重峰(m)。使用COSY和HSQC实 验指定光谱。用上标罗马数字I标记的信号是还原端，而II和III分别是自还原端和非还原 端的第二个糖。将所有化学位移以百万分率(ppm)引述在δ-标度上。将残留溶剂信号用作内 部参考。将反相HPLC在配备有自动进样器、级分收集器、UV探测器和eel ipse XDB-C18柱(5μ m，4.6 X 250mm或9 · 4 X 250mm)的安捷伦(Aglient) 1200系列系统上以I · 5mL/min的流速进 行。将质谱记录在应用生物系统(Applied Biosystems)5800MALDI-T0F蛋白质组学分析仪 上。使用的基质是2,5_二羟基苯甲酸(DHB)并且ultamark 1621是内标。
[0083]用于全面脱保护的通用程序.将新鲜制备的NaOMe(pH 10)添加至化合物26(方案 3)、19(方案1)、20(方案1)、或6(图2)于Me0H/DCM(2/l，v/v，以2μπι〇1寡糖/mL的浓度）中的溶 液里。将该反应混合物在室温下搅拌过夜，并且然后通过添加在MeOH中的10 % AcOH中和。将 该悬浮液用DCM洗涤。将该反应混合物用DCM稀释并且用饱和NaHCO3和盐水(30mL)洗涤。将 有机层干燥(MgSO 4),过滤，并且将该滤液在减压下浓缩。通过快速色谱法在硅胶（己烷/ EtOAC，l/2，V/V)上进行纯化给出脱酰基产物。将产生的部分地脱保护的化合物溶解在t-BuOH和水（I/1，v/v，以2μπιο 1糖/mL的浓度）的混合物中，并且添加 Pd(OH)2/C(20wt. %，德固 赛类型(Degussa Type))。将产生的混合物放置在氢气气氛（Ipsi)下。搅拌48h后，将该催化 剂滤出并且用水充分洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩并且将该粗产物通过Bio-Gel P2进 行纯化。
[0084] 寡糖合成.如图IB中所示的具有式1-4的寡糖亚基是使用图2中所示的结构单元、 使用如在以下方案1、2和3中所示的合成来制备的。由两个或更多个重复单元组成的寡糖的 组装是通过以下嵌段合成来进行:该合成中代表完全重复单元的常见糖部分被转化为所偶 合的糖基供体和受体，以给出一种目标化合物(博尔杰(Bolt je，T.J.)等人，《自然化学》 (Nat.Chem. )2009，1，611-622)。用于这些合成的结构单元显示在图2中。
[0085] 综合考虑。然而，在图IB中的化合物1的情况下，认为这种策略可能是有问题的，因 为由于在C-2处的邻近α-甘露糖苷和异头中心的β-异头构型，所以所需的甘露糖基受体的 C-3羟基是低反应性的，从而将C-1C-2、C-3取代基放置在拥挤的1，2，3-顺式构型中。因此， 使用一种可替代的策略，其中四糖供体5(图2)与六糖受体6(图2)偶合以给出十糖，将该十 糖全面脱保护后，将会提供目标化合物1 (图1Β)。此外，设想三糖15将会是用于制备四糖5和 六糖6的适当的前体，从而最小化合成步骤(方案1)的所需数目。
[0086] β-甘露糖苷的安装是制备关键结构单元5和6(图2)的挑战性方面。这些1，2_顺式 糖苷难以引入，是由于轴向的C-2取代基在空间上阻断了从β-面进入亲核物质和△-异头效 应，该A-异头效应提供α-异头物的额外稳定作用(格瑞德利(Gridley，J.J.)等人，《化学会 志柏金会报》（Chem.Soc.-Perkin Trans.)第1辑2000,2000，1471-1491;卡伊（Cai，F.)等 人，《碳水化合物化学和生物化学》(Adv · Carbohydr · Chem · Biochem.) 2009，62，251-309)。用 于甘露糖型连接的构建的方法是基于通过克里奇(Crich)和同事的工作并且涉及α-异头 三氟甲烷磺酸的原位形成，由于强的内异头效应，该α-异头三氟甲烷磺酸是选择性形成的， 其以Sn2样-方式可以由糖羟基替换以给出β-甘露糖苷（克里奇（Crich，D.)，和孙（Sun， S ·Χ·)，《美国化学学会杂志》(J. Am. Chem. Soc. )1997，119,11217-11223 ;克里奇(Crich， D.)，和孙(Sun,S.X·)，《四面体》(Tetrahedron) 1998，54,8321-8348)。0_甘露糖苷形成的前 提是该糖基供体受4,6-0_亚苄基缩醛的保护。已经提出，由于由这个中间体的半椅式或船 式构象引起的扭转应变，这个保护基团对抗氧杂碳鐵(oxacarbenium)形成(SnI糖基化）。此 外，该4,6-0_缩醛促使0-6取代基处于tg构象中，其将它的偶极放置为反向平行于在过渡态 中形成的缺电子异头中心，从而引起不稳定效应(延森(Jensen,H.H.)等人，《美国化学学会 杂志》（J. Am. Chem. Soc · )2004,126,9205-9213) 〇
[0087] 图2的结构单元的制备.设想单糖7-12将会非常适合于制备关键结构单元5和6(图 2)。将这些衍生物通过临时保护基叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)和2-甲基萘基(Nap)进行修 饰，这些临时保护基可以按有序的方式去除，从而允许正生长的寡糖链的延伸和分支部分 的安装。此外，4，6-0-亚苄基保护的由C-2甲硅烷基醚和C-3Nap醚修饰的甘露糖基供体提供 了最优的异头选择性（博尔杰(Boltje，T.J.)等人，《有机快报》（Org. Lett. )2010，12， 4636-4639)。因此，将甘露糖基供体7和8用于该β-甘露糖苷的安装。此外，甘露糖基供体9 (瓦斯奇科(Waschke，D.)等人，《有机快报》（Org.Lett. )2011，13,3628-3631 )，其在C-2t(在 糖基化过程中进行邻近基团参与）处由乙酰酯进行修饰，被预期理想地适合于制备分支α_ 甘露糖苷。鼠李糖基受体10(马里诺-阿尔伯纳斯(1&1'；[110-4]^61'1^8，]\1?.)等人，《碳水化合 物研究》(Carbohydr. Res.) 1993，245，245-257)具有C-3羟基，其在β-甘露糖基化后，将给出 具有异头烯丙基醚的产物，该产物可以去除并且转化为用于进一步糖基化的三氯乙酰亚胺 酯离去基团（施密特(Schmidt，R. R.)和金泽亚(Kinzy，W .)，《碳水化合物化学和生物化学进 展》(Adv.Carbohydr.Chem.Biochem. )1994，50,21-123;朱(Zhu,X·Μ·)，和施密特(Schmidt, R.R·)，《应用化学国际版》(Angew.Chem.，1的』(1.)2009,48，1900-1934)。最后，葡糖基供体 11是用于制备结构单元12的前体，将该结构单元通过叠氮丙基间隔子进行修饰，该叠氮丙 基间隔子提供用于辄合至载体蛋白质的机会。糖基供体11也被用于骨架β-葡萄糖苷的安 装。
[0088]六糖亚基（图IB中的式4)的合成如方案1中所示的进行：
[0089]六糖6包含两个β-甘露糖苷并且具有拥挤的糖苷的1，2，3-顺式排列（方案1)。因 此，将具有1-苯亚磺酰基哌啶（BSP)和三氟甲磺酸酐（Tf2O)的硫代甘露糖基供体7(科迪 (Codee J.D.C.)等人，《有机快报》(Org.Lett. )2003,5,1519-1522)在-60°C下预活化，随后 添加受体10(马里诺-阿尔伯纳斯（Marino-Albernas，J . R.)等人，《碳水化合物研究》 (Carbohydr. Res.) 1993，245，245-257)，以75% 的优异产率提供了主要呈β-异头物(α/β = 1/12)的二糖13(方案1)。该少量的不想要的α-异头物可以通过硅胶柱色谱容易地去除。使 用过量的2,3_二氯-5，6_二氰基-1，4-苯醌(DDQ)氧化去除13的Nap醚（闪特(Gaunt，M.J·)等 人，《有机化学杂志》（J. Org. Chem. 1998，63,4172-4173;夏(Xia，J.)等人，《四面体快报》 (Tetrahedron Lett.)2000，41，169-173)，提供了相应的二糖受体14。将硫代甘露糖苷8用 对硝基苯基次磺酰氯(P-NO 2C6H4SCl)和三氟甲磺酸银(克里奇(Cr ich，D.)等人，《碳水化合 物研究》(Carbohydr. Res.) 2008，343，1858-1862)在DTBMP的存在下在-78 °C下预活化，随后 添加受体14不会提供所希望的产物。因此，BSP和Tf2O被用作活化剂系统，其以72 %的产率 给出主要呈异头物(α/β=1/10)的三糖15。接着，将15的异头烯丙基醚通过用PdCl2处理 而去除，以给出半缩醛16,但由于不期望的烯丙基醚至丙烯-2-酮醚的氧化而具有仅仅40% 的产率。（李(Li，Z.J.)等人，碳水化合物研究》(0 &洸〇1^办.1^8.)1999,317，191-192)。通过 两步法来避免这个问题，该两步法涉及使用威金森催化剂(Wilkinson's catalyst)和在正 回流的甲苯中的DIPEA异构化末端烯烃以给出中间体烯醇醚，将其通过用在丙酮/水中的氧 化汞（II)和氯化汞（II)处理来裂解，以经两步以80%的产率给出16。将乳醇16通过与三氯 乙腈在Cs 2CO3的存在下反应而转化为相应的三氯乙酰亚胺酯17,并且17与葡糖基受体12的 TMSOTf-催化的糖基化（（施密特(Schmidt，R. R.)和金泽亚(Kinzy，W .)，碳水化合物化学和 生物化学进展》（Adv·Carbohydr ·Chem.Biochem.) 1994,50，21-123;朱（Zhu,X·Μ·)，和施密 特（Schmidt ,R.R.)，《应用化学国际版》（Angew.Chem.，Int .Ed. )2009，48,1900-1934)以 70%的产率提供了仅仅呈α-异头物（由于C-2苯甲酸酯的邻近基团参与）的四糖18。将18的 TBS醚通过用过量的吡啶中的HF处理而去除得以顺利进展，而未影响任何其他保护基，以给 出糖基受体19 JMSOTf促进的甘露糖基供体9(瓦斯奇科(Waschke，D.)等人，《有机快报》 (Org.Lett. )2011，13,3628-3631)与DCM中的四糖受体的19的糖基化以82%的产率提供了 五糖20。更容易接近的供体苯基2,3,4,6_四-0-苄基-1-硫代-α-D-吡喃甘露糖苷与NIS/ TMSOTf组合作为在二乙醚(作为溶剂）中的活化剂的使用导致偶合产物的低产率。将20的 Nap醚使用标准条件去除，随后将产生的受体21与葡糖基供体11使用作为活化剂的NIS/ TMSOTf进行糖基化，以68 %的产率提供了六糖22。最后，将22的TBS醚进行HF-吡啶介导的去 除，以良好的产率给出了该目标六糖受体6。该TBS和Nap基团的正交性会已经使得首先安装 β-葡萄糖苷并且然后是α-甘露糖苷成为可能。然而，这种策略被预期为是更低效的，这是因 为它需要侧翼为1，2_顺式糖苷的C-2羟基的糖基化。最后，将六糖受体6经受如以上所述的 全面脱保护，以产生图IB中的式4。
[0090] 四糖亚基（图IB中的式3)的合成进行如下。将式19(方案1)经受如以上所述的全面 脱保护，以产生图IB中的式3。
[0091] 五糖亚基（图IB中的式2)的合成进行如下。将式20(方案1)经受如以上所述的全面 脱保护，以产生图IB中的式2。
[0092] 十糖亚基(图IB中的式4)的合成如方案2和3中所示的进行：
[0093] 四糖供体5是从常见的三糖15起始来制备的。因此，将15的TBS基团通过用HF吡啶 处理去除并且将产生的受体23与甘露糖基供体9偶合以提供四糖24。将后者化合物通过使 用两步程序去除异头烯丙基醚而转化为糖基供体5以给出25，随后将25用2，2，2-三氟-N-苯 基亚氨代乙酰氯在1，8_二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯的存在下进行处理。
[0094] 在(TC下，5与6在DCM中的TMSOTf的存在下进行偶合以70%的产率给出了仅仅呈β-异头物（由于糖基供体的C-2酯的邻近基团参与）的十糖26(方案3)。26的脱保护通过该两步 程序容易地完成，以提供十糖1，如上所述，并且涉及通过用甲醇中的甲醇钠处理去除该酯 保护基，随后经在tBuOH和H 2O的混合物中的Pd(0H)2/C进行氢化以去除该苄基和Nap醚并且 将该叠氮基转化为氨基基团。化合物1的异头信号的NMR数据(未显示)与报道的值一致。五 糖2、四糖3和六糖4可以通过分别去除20、19和6的保护基容易地制备。 实例2:使用合成的寡糖亚基进行的铜绿假单胞菌Psl的表位作图
[0095] 这个实例证实在实例1中产生的合成寡糖亚基的蛋白质辄合以及免疫学测定以确 定由抗P S1单克隆抗体结合的表位。
[0096] 用于氨基丙基间隔子的S-乙酰基硫代羟乙酰基酰胺基衍生化的通用程序图IB中 的化合物1至4的氨基丙基基团的S-乙酰基硫代羟乙酰基酰胺基衍生化进行如下。将寡糖3 (5.011^，7.07以111〇1)在干01^(50(^1^)中浆液化，并且添加3-乙酰基硫代乙醇酸五氟苯酯 (SAMA-OPfp) (3.2mg，10.60μπιο1)，随后逐滴添加 N，N-二异丙基乙基胺（DIPEA) (2.5yL， 14. Hymrnol)。在室温下搅拌2h后，将该混合物进行浓缩，用甲苯共蒸发两次，并且将该残余 物通过尺寸排阻色谱法(Biogel P2柱，用包含10%甲醇的H2O洗脱)进行纯化，以在冻干后 给出呈白色粉末的相应的硫代乙酸酯（5.211^，6.36以111〇1，90%)。以此方式，化合物1-4的这 些硫代乙酰胺基衍生物以85 % -90 %的产率制备。
[0097]用于S-脱乙酰作用的通用程序如以上所描述的制备的硫代乙酸酯衍生物的S-脱 乙酰作用进行如下。将在DMF溶液（300yL)中的7 %NH3 (g)添加至对应于四糖3 (1.2mg， 1.43mmol)的硫代乙酸酯衍生物于ddH20(40yL)中的溶液里，并且将该混合物在氩气氛下搅 拌。通过MALDI-T0F监测该反应，显示[Μ+Na]+的产物峰。Ih后，将溶剂在减压下蒸发。将硫醇 衍生的三糖进一步在高真空下干燥30min，并且然后未经进一步纯化立即用于辄合中。其他 三个寡糖亚基的脱乙酰作用类似地进行。
[0098]用于硫醇衍生的寡糖与BSA-马来酰亚胺的辄合的通用程序。将这些辄合按照由皮 尔斯远藤根有限公司（Pierce Endogen Inc.)说明的进行。简言之，将刚在如以上所述的辄 合之前脱保护的硫醇衍生物(2.5当量过量的以在该蛋白质上可获得MI-基团）溶解在ddH 20 (IOOyL)中，并且添加至该马来酰亚胺活化的蛋白质（2mg)于包含EDTA和叠氮化钠(200yL) 的辄合缓冲液磷酸钠 pH 7.2的溶液里。将该混合物在室温下孵育18h，并且然后通过用 IOkDa分子截留量的密理博（Mi Ilipore )离心过滤装置进行纯化。所有的离心在4 °C、 3000rpm下进行25min。将该反应混合物离心并且将该滤液用磷酸钠缓冲液pH 7.4(3X200μ L)洗涤。将该辄合物回收并且吸收在磷酸钠缓冲液ρΗ7.4、0.15Μ氯化钠（ImL)中。这给出具 有摩尔碳水化合物/BSA比率为7 :1 (针对四糖3)、8:1 (针对五糖2)、15:1 (针对六糖4)和5:1 (针对十糖1)的糖辄合物，如通过由HPAEC/PAD和劳里(Lowry)蛋白质浓度测定法的定量单 糖分析所确定的。
[0099] ELI SA。将ELI SA板(Nunc Maxi Sorp)在4 °C下用3倍系列稀释的寡糖-BSA辄合物（相 对于辄合的寡糖的浓度)包被过夜，随后通过用补充有0.1 %吐温20 (PBS-T)的I3BS洗涤，并 且用补充有1 %牛血清白蛋白（PBS-B)的PBS进行封闭。将这些包被的ELISA板用抗Psl抗体 (PBS-B中，5yg/mL)在4°C下孵育lh。接着将这些板用PBS-T洗涤并且用HRP辄合的抗人二级 抗体处理Ih，随后如所描述地显色并且分析(迪干多梅里科(Digiandomenico，A.)等人，《实 验医学杂志》（J.Exp.Med. )2012，209,1273-1287)。
[0100] 免疫学研究。基于竞争测定将抗Psl单克隆抗体分类为三组表位，描述在迪干多梅 里科（Digiandomenico，Α·)等人，《实验医学杂志》（J.Exp.MecL )2012，209,1273-1287和于 2012年6月8日提交的PCT/US2012/041538中。这些分类显示在以上表1中。
[0101] 在确认合成的Psl寡糖的结构整体性后，将各种抗Psl mAb识别合成的寡糖的能力 进行如下检查。对于这些实验，将寡糖辄合至BSA以协助ELISA板的包被，随后测试与结合每 个表位类(I类-Cam-003; II类-WapR-OOI; III类-WapR-016)的代表性抗体的反应性。
[0102]如在图3A-D中所描绘的，该代表性II类mAb(WapR-OOl)与每个寡糖有力地反应，指 示这些II类抗Psl表位存在于四糖内并且不需要该Psl重复单元的分支甘露糖苷。因为Psl 是重复性杂聚物，所以每个Psl五糖亚基会充当该抗体的靶标。虽然不希望被理论所束缚， 但是这个特征很可能解释之前针对从铜绿假单胞菌纯化的内源Psl观察到的该II类抗体的 有力反应性。该III类抗体(WapR-016)未结合该四糖（3)或五糖（2);然而它的确与该六糖4 有力地反应并且与十糖1微弱地反应。这些结果表明末端葡萄糖苷(其是独特地包含在六糖 4中的）对于该III类抗体的最优结合是重要的。此外，这个观察表明该天然Psl重复单元终 止于分支葡萄糖苷中。
[0103] 代表性I类mAb(Cam-003)(其之前显示针对铜绿假单胞菌是最具功能活性的并且 具有保护性的Psl mAb)未结合任何合成寡糖，指示完整的I类Psl表位不存在于这些合成化 合物内。这些结果是不期望的，因为该十糖1被推测为包含该重复五糖的所有可能结构。这 个观察提出以下可能性:该I类mAb结合至构象表位或还有待阐明的亚化学计量的Psl同种 型。对于后者的可能性通过以下观察得到支持:在碳水化合物纯化过程中，柔和碱性的但非 彻底的蛋白酶处理消除了Cam-003反应性而维持了WapR-OOl和WapR-016反应性(数据未显 示)。 氺氺氺
[0104] 本披露在范围不受所描述的具体实施例的限制，这些实施例意欲作为本披露的单 独方面的简单说明，并且在功能上等效的任何组合物或方法均处于本披露的范围内。事实 上，除了在此示出并且描述的那些，本披露的各种改变从前述说明书和附图对于本领域技 术人员来说将变得清楚。这类改变旨在落入所附权利要求书的范围内。
[0105] 本说明书提到的所有公开和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个 单独公开或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。
【主权项】
1. 一种铜绿假单胞菌Psl寡糖的合成的寡糖亚基，包括具有式I的三糖：其中办是-011或其中此是-011或 ( , 其中R3是-0X，其中X是氢、烷基基团或芳基基团；接头，其中该接头可以是-。^^^)^ NH2、-0- (CH2) n-COOH、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2)m-NH2、-0- (CH2) n-S (CH2)m-COOH、-0-(CH2) n-S (CH2) m-N3、-0- (CH2) n-S〇2 (CH2) m-NH2、-0- ( CH2 ) n-S〇2 ( CH2 ) m-C00H、或-0- ( CH2 ) n-S〇2 (〇12)^吣，其中11和111是相同的或不同的并且独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 ;或经由 辄合偶联到异源部分的接头，其中该异源部分可以是蛋白质、脂质或聚合物;并且 其中该寡糖亚基可以被抗Psl单克隆抗体WapR-016或其抗原结合片段特异性地结合。2. 如权利要求1所述的寡糖亚基，包括六糖：3. 如权利要求1或权利要求2所述的寡糖亚基，其中单克隆抗体WapR-016包括对应地为 SEQIDN0:11和SEQIDN0:12的VH和VL氨基酸序列。4. 一种铜绿假单胞菌Psl寡糖的合成的寡糖亚基，包括具有式II的四糖：其中R4是-OH或其中Rs是-OH、其中R3是-0X，其中X是氢、烷基基团或芳基基团；接头，其中该接头可以是-。^^^)^ NH2、-0- ( CH2 ) n-COOH、-0- (CH2) n-N3、-0- (CH2) n-S (CH2) m-NH2、-0- (CH2) n-S ( CH2 ) m-COOH、-0-(CH2) n-S (CH2) m-N3、-0- ( CH2 ) n-S〇2 (CH2) m-NH2、-0- ( CH2 ) n-S〇2 ( CH2 ) m-COOH、或-0- ( CH2 ) n-S〇2 (〇12)^吣，其中11和111是相同的或不同的并且独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 ;或经由 辄合偶联到异源部分的接头，其中该异源部分可以是蛋白质、脂质或聚合物;并且 其中该寡糖亚基可以被抗Psl单克隆抗体WapR-001或其抗原结合片段特异性地结合。5. 如权利要求4所述的寡糖亚基，包括以下四糖：以下五糖：以下六糖：或以下十糖：6. 如权利要求4或权利要求5所述的寡糖亚基，其中单克隆抗体WapR-ΟΟΙ包括对应地为 SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的VH和VL氨基酸序列。7. 如权利要求1所述的寡糖亚基，其中抗Psl单克隆抗体WapR-016或其抗原结合片段不 能特异性地结合至如权利要求5所述的四糖或如权利要求5所述的五糖。8. 如权利要求1至7中任一项所述的寡糖亚基，该寡糖亚基辄合至多肽、脂质、或聚合 物。9. 如权利要求8所述的寡糖亚基，其中该多肽是白蛋白。10. 如权利要求9所述的寡糖亚基，其中该多肽是牛血清白蛋白。11. 一种评估抗铜绿假单胞菌Psl抗体或其抗原结合片段与铜绿假单胞菌Psl表位的结 合特征的方法，该方法包括 (a) 将该抗体与如权利要求1至10中任一项所述的寡糖亚基在允许该抗体结合该寡糖 亚基的条件下接触;并且 (b) 检测该抗体和该寡糖亚基的复合物的存在。12. 如权利要求11所述的方法，其中该复合物是通过ELISA测定来检测。13. 如权利要求11或权利要求12所述的方法，该方法进一步包括： (c) 如果该抗体结合至如权利要求5所述的四糖、五糖、六糖、和十糖中的每一个，则将 该抗体分类为结合至II类表位;并且 (d) 如果该抗体结合至如权利要求5所述的六糖或十糖，但不结合至如权利要求5所述 的四糖或五糖，则将该抗体分类为结合至III类表位。14. 一种筛选结合至铜绿假单胞菌Psl的抗体的方法，该方法包括： (a)将一种抗体或抗体片段文库与如权利要求1至10中任一项所述的寡糖亚基在允许 Psl-特异性抗体或其片段结合该寡糖亚基的条件下接触； (b) 检测该抗体和该寡糖亚基的复合物的存在;并且 (c) 选择结合至该寡糖亚基的抗体。15. 如权利要求14所述的方法，其中该复合物是通过ELISA测定来检测。16. -种组合物，包括如权利要求1至10中任一项所述的寡糖亚基。
【文档编号】C07K16/12GK105829342SQ201480022945
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年5月13日
【发明人】A·迪吉安多门尼克, Q·王, C·K·斯托弗, G-J·布恩斯, K-F·莫, H·李
【申请人】米迪缪尼有限公司, 佐治亚大学研究基金会股份有限公司