铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac14的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及铜绿假单胞菌（PA)重组蛋白VaC14(i3-lactamase)疫苗的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、 正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、 中耳、角膜、尿道和呼吸道，也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，该菌目前已成为 全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20 %以上。
[0003] PA致病因素包括生物膜、内毒素、分泌的毒力因子和蛋白酶，群体感应系统等，自 然感染后能够诱导机体产生局部的粘膜免疫以及全身性的体液及细胞免疫应答，但这些应 答并不足以很好的清除细菌。目前在疫苗方面的研究很多，但尚无一种疫苗进入临床应用， 铜绿假单胞菌的β内酰胺酶(β-lactamase)属于C类β内酰胺酶，由铜绿假单胞菌染色体编 码，组成型表达，能够催化6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其Ν-酰基 衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的水解反应，由此灭活β内酰胺类的抗生素介导细菌的耐 药(McKinney，D.C等，2015)内酰胺酶的组成性表达是绿脓杆菌耐药的关键，同样也是基 因工程亚单位疫苗的候选抗原。
[0004] 申请人采用基因工程技术克隆将铜绿假单胞菌抗原分子的活性功能片段重组融 合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得获得铜绿假单胞菌(PA)疫苗重组蛋白Vac 14，所述重 组蛋白经动物试验证明，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作 用，有利于铜绿假单胞菌的预防、诊断和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白Vacl4纯化方法 的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的：提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vacl4疫苗 的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vacl4,该抗原的核酸序列如SEQ ID N0:1所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008] 铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vacl4的纯化方法，包括步骤:收 集制备的所述抗原Vac 14;按照高压破菌、离心;GST亲和纯化;SP HP层析纯化;G 25层析纯 化;Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
[0009] 上述纯化方法的具体步骤如下：
[0010] 1)高压破菌
[0011]将收集的￥&〇14菌体作为目标蛋白，用?!1为7.〇-7.5的1〇11^1^缓冲液混匀悬浮， 预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
[0012] 2)GST亲和纯化
[0013] GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱：
[0014] 3)SP HP层析纯化
[0015]经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱，B液（20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，1M NaCl，pH7 · 0-7 · 5)线性梯度洗脱；
[0016] 4)G 25层析纯化
[0017] 将经步骤3)纯化的目标蛋白，用G25层析柱纯化，C液平衡层析系统及层析柱，分离 纯化目标蛋白，置换缓冲液；
[0018] 5)Q HP层析纯化
[0019] 将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋 白，内毒素等杂质，分离纯化目标蛋白；
[0020] 其中4液为口田直7.〇-7.5的2〇111]\1他2冊〇4-似!12?〇4缓冲溶液，8液为口!17.〇-7.5的 20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，lM NaCl缓冲溶液，C液为ρΗ6·0的 10mM His，0.9%NaCl缓冲溶液。
[0021] 步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60_80MPa，高速离心获取破菌上清。
[0022] 步骤2)所述的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose 4B或 Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP〇
[0023] 步骤2)所述的Prescission Protease酶带有GST标签。
[0024] 步骤3)所述的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP Sepharose FF或 Capto SP〇
[0025] 步骤4)所述的G 25层析柱的填料为Sephadex G_25Coarse或Sephadex G_ 25Medium或Sephadex G_25Fine或Sephadex G_25Superfine〇
[0026] 步骤5)所述的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇
[0027] 上述纯化方法的抗原Vac 14采用以下方法制备：
[0028] 1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位 重组基因工程疫苗Vacl4蛋白片段的核苷酸序列；
[0029] 2)将步骤1)获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组 载体转化至宿主菌；
[0030] 3)诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
[0031]发明效果
[0032]采用本发明所述的纯化方法，从表达铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白 Vacl4的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98%，回收率大于50%的目的蛋白，通过氨基 酸序列预测本发明人构建获得的蛋白Vacl4分子质量约为40.3kD，等电点在pH 8.89左右。 [0033] 本发明所述的纯化方法主要有GST亲和纯化、SP HP层析、G25层析、Q HP层析，通过 上述方法纯化的蛋白用12%SDS-PAGE检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为40kD。 HPLC C3柱分析目的蛋白纯度99.2 %。纯化后的Vac 14与A1 (0H)3佐剂共同注射免疫BalB/C 小鼠，发现Vacl4加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组）（P〈0.01)I 明使用本发明人纯化方法获得的Vac 14可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用临床株 XN-1(CCTCC Μ 2015730)感染，发现Vacl4加免疫佐剂组感染率为20%，对照组(PBS组)感染 率为80%，计算得出Vacl4抗PA感染的保护率为75%。
【附图说明】
[0034]图1为Vacl4基因片段的PCR扩增结果；其中，泳道1 :核酸（DNA)分子量标准 (Marker)，从上到下大小分别为:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;;泳道2:目的基因 片段Vacl4(~llOObp);
[0035] 图2为重组质粒pGex-6P-2_Vacl4的双酶切鉴定结果;其中，泳道1:核酸(DNA)分子 量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2:重 组表达质粒pGEX-6p-2-Vacl4经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约 llOObp；
[0036] 图3为蛋白Vacl4诱导鉴定结果;其中，泳道1:蛋白分子量标准(Marker)，从上到下 大小分别为：170Kd、130Kd、1 OOKd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、1 OKd;泳道 2:结合诱 导表达的超声上清的GST填料;泳道3:经PP酶酶切后的上清；
[0037]图4为纯化后的蛋白Vac 14SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1 :蛋白分子量标准 (Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、 10Kd;泳道2:纯化的Vacl4蛋白；
[0038] 图5为GST亲和PP酶酶切及SP HP层析SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量 marker;泳道1:蛋白与GST亲和