专利名称：一株三乙胺降解假单胞菌株sya-1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境为生物技术领域，具体地，是涉及一株三乙胺降解假单胞菌株SYA-1及其应用。
背景技术：
有机胺产品广泛应用于农药、医药、橡胶、合成染料、石油、制革、洗涤剂以及有机合成、无机化工等行业中。有机胺产品种类比较多，每一种产品在生产过程中都会有残余的原料和中间产物进入废水中，这些物质大多高氮低碳，有毒有害，难于生物降解，从而给此类化工废水的处理带来了困难。三乙胺是有机溶剂和化工合成的重要原料，在合成树脂制造中作为聚碳酸醋光气法的催化剂，四氟乙烯的阻聚剂和橡胶硫化促进剂；也可用作食品防腐剂、乳化剂；同时还是制造染料、杀虫剂的原料。三乙胺(Triethylamine)是一种脂肪族胺,分子式(C2H5)3N,具有强烈的氨臭味、有刺激性、腐蚀性、易燃、易挥发。三乙胺广泛存在于有机合成、农药、染料等生产废水中，目前对于含三乙胺废水的处理多采用物理化学方法，其成本较高，且易造成二次污染；而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除三乙胺的有效菌种具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，利用微生物的方法来降解废水中的污染物，适用于现代废水处理工艺，使废水达标排放，同时降低生产和使用成本。本发明提供一种三乙胺降解菌株SYA-1,其菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌,于2013年4月9日保藏 于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC N0.7435，经鉴定，其序列为假单胞菌属sp.)。主要生物学特性为G_，对数生长期菌体为杆状，菌落在LB平板上呈薄膜状、圆形、浅黄色、不透明状，能液化明胶，不能水解淀粉，氧化酶反应阳性，甲基红反应阴性，V.P实验阴性，无芽孢，好氧生长。本发明提供了假单胞菌SYA-1在三乙胺降解中的应用。本发明还提供了所述菌株SYA-1制备的固定化小球。本发明还提供了一种菌株SYA-1制备成固定化小球的方法，包括下列步骤:
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液；
3)取Iml菌体液与20ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4°C备用。步骤I)中所述的LB培养基为=NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L, pH7.0。本发明还提供了所述固定化小球在三乙胺降解中的应用。所述固定化小球在三乙胺降解中的应用，具体为:先将固定化小球在废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温28±2°C，曝气量在1.2L/min，然后在温度为28±2°C、pH值为6.8-7.2的适宜条件下，在三乙胺进水浓度低于1000mg/L的情况下，每升三乙胺废水采取185ml的固定化小球来处理，同时，水力停留时间为32h，在这种情况下三乙胺的去除率在97%以上，有较好的去除效果。本发明所述的三乙胺降解菌株SYA-1能以三乙胺为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮。在实验室摇瓶条件下对100mg/L三乙胺的降解率达100%。本发明还提供了一种菌株SYA-1所制备的固定化小球，实验室生物降解实验结果表明，固定化小球对100mg/L三乙胺的降解率达到95.75%。该发明生产的降解菌SYA-1的固定化小球具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，可以降解废水中的三乙胺，适合在含有三乙胺的废水处理中推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。
图1为三乙胺降解菌株SYA-1菌落图片；
图2菌株SYA-1菌体结晶 紫染色照片(IOOOx)；
图3固定化小球对三乙胺降解去除率随时间变化的示意 图4为固定化小球对三乙胺不同进水浓度的降解去除率。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1三乙胺降解菌株SYA-1的分离和鉴定
取三乙胺富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的KT1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含100mg/L三乙胺的无机盐固体培养基上，其配方为:每升含 1.5 g K2HP04、0.5 g ΚΗ2Ρ04、0.2 g MgSO4X7H20、1.0 g NaCl、
1.0g (NH4)2SO4, 20g琼脂，pH 7.0，30°C培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5ml的LB液体培养基中培养24小时后，于8000r/min的条件下离心2min,倒去上清液，加入5ml的无菌水摇勻,仍于8000r/min的条件下离心2min,按此方法用无菌水洗两遍后，加入5ml无菌水悬浮该菌。吸取Iml该菌液加入IOOml三乙胺浓度为100mg/l的无机盐液体培养基中，其配方为:每升含1.5 g K2HP04、0.5 g ΚΗ2Ρ04、0.2 g MgSO4 X 7H20,
1.0g NaClU.0 g (NH4)2SO4, pH 7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养3天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。其菌落图片见图I，其菌体革兰氏染色照片(IOOOx)如图2所示,鉴定为假单胞菌属(Aewt/offlmas sp.);命名为:SYA-1。主要生物学特性为G_，对数生长期菌体为杆状，菌落在LB平板上呈薄膜状、圆形、浅黄色、不透明状能液化明胶，不能水解淀粉，氧化酶反应阳性，甲基红反应阴性，V.P实验阴性，无芽孢，好氧生长。能以三乙胺为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮。如图3所示，在实验室摇瓶条件下游离细菌对100mg/L三乙胺的降解率达100%。实施例2菌株SYA-1制备成固定化小球的方法
1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液。3)取Iml菌体液与20ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4°C备用。步骤I)中所述的LB培养基为=NaCl 10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L, pH7.0。实施例3固定化小球在三乙胺降解中的应用方法
先将固定化小球在废水中曝气12h进行活化，活化过程中水温28±2°C，曝气量在
1.2L/min，然后在温度为28±2°C、pH值为6.8-7.2的适宜条件下，在三乙胺进水浓度低于1000mg/L的情况下,每升三乙胺 废水采取185ml的实施例2所制备的固定化小球来处理，同时，水力停留时间为32h，如图3所示，在这种情况下三乙胺的去除率在97%以上，有较好的去除效果；而图4显示了对于不同进水浓度的三乙胺的去除情况，研究表明，三乙胺的去除率随着进水浓度的升高而降低，当进水的三乙胺浓度在低于1000mg/l的范围内时，三乙胺都有较高的去除率，可以达到97%以上。
权利要求
1.一株三乙胺降解假单胞菌麗was sp.)菌株SYA-1，其保藏编号为CGMCC N0.7435。
2.权利要求1所述假单胞菌SYA-1在三乙胺降解中的应用。
3.含有权利要求1所述的假单胞菌SYA-1的固定化小球。
4.权利要求3所述的固定化小球在三乙胺降解中的应用。
5.权利要求3所述的含假单胞菌SYA-1的固定化小球的制备方法，其特征在于，包括下列步骤: 1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于LB液体培养基中于30°C，160r/min条件下振荡培养至对数期； 2)将上述培养好的菌液于8000r/min的条件下离心2min,倒掉上清液,加入相同体积的无菌水，摇勻后8000r/min离心2min,如此洗两遍,用相同体积的无菌水悬浮,制成菌体液； 3)取Iml菌体液与20ml的4%海藻酸钠溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的3%CaCl2溶液，于4°C交联钙化6h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4°C备用。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述的LB培养基为=NaCl.10.0g/L,蛋白胨 10.0g/L，酵母粉 5.0g/L，pH7.0。
全文摘要
本发明提供了一种消除三乙胺污染的降解菌及其固定化小球，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌SYA-1，经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.)。主要生物学特性为G-，对数生长期菌体为杆状，菌落在LB平板上呈薄膜状、圆形、浅黄色、不透明状能液化明胶，不能水解淀粉，氧化酶反应阳性，甲基红反应阴性，V.P实验阴性，无芽孢，好氧生长。能以三乙胺为唯一碳源、氮源进行生长，并将其彻底矿化产生氨氮。在实验室摇瓶条件下该菌株对100mg/L三乙胺的降解率达100%，解决了废水处理中三乙胺难生物降解的问题。
文档编号C02F3/34GK103243057SQ20131020077
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者顾乔梅, 张金, 邱沪生, 蔡双梅 申请人:江苏南资环保科技有限公司