一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33(化 Oprl)的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脈杆菌，广泛分布于自然界、 正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、 中耳、角膜、尿道和呼吸道，可引起屯、内膜炎、胃肠炎、脈胸甚至败血症，该菌目前已成为ICU 病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20 % W上。
[0003] 目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究，但普遍存在抗原类型单一、免疫保护效果 低下等问题，尚无一种疫苗进入临床应用。PcrV是铜绿假单胞菌ΙΠ 型分泌系统的重要组件 之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的"管道"，是铜绿 假单胞菌ΠΙ型分泌系统的关键组件(Teiji S.等，化itical化re 2014)，鉴于化rV在铜绿 假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要祀 标。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白（outer membrane lipoprotein)，其位于铜绿 假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。发明人构建了一种既能很 好去除PA运些蛋白对细胞的毒性，又能保持运些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程重组 蛋白化c33。目前，尚未见针对该重组双亚单位基因工程蛋白化c33疫苗纯化方法的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组双亚单位基因工程蛋白化c33疫 苗的纯化方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0006] 一种铜绿假单胞菌重组蛋白化c33的纯化方法，所述方法包括：
[0007] 1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白化C33的菌体；
[000引2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离屯、，收集上清；
[0009] 3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化;其中，在所述亲和层析中A 液洗脱使用Prescission Protease酶进行酶切；
[0010] 4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化;其中，使用A液平衡层析 系统及Q HP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；
[OCm] 5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析纯化;其中，采用C液平衡G25层 析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；
[001^ 6)将步骤5)纯化后的重组蛋白化c33进行Q HP层析纯化，加入0.1%Triton X-100 混匀，采用的夜平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质；
[0013]其中，A液为pH7.0-7.5的20mM 胞2册〇4-NaH2P〇4缓冲液，B液为pH7.0-7.5的含1M NaCl的20mM化出P〇4-NaH2P〇4缓冲液;C液为抑6.0的含1 OmM心组氨酸，0.9 %化C1的溶液;D 液为抑6.0的10mMレ组氨酸，0.9%NaCl，0.1%TritonX-100溶液。
[0014] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：
[0015] 将收集表达重组蛋白化c33的大肠杆菌菌体W抑7.0-7.5的lOmM的PBS缓冲液混匀 悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，10，000-15，OOOg的转速高速离屯、，收集上清。
[0016] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中W60~80MPa的高压破菌。
[0017] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料 选自Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP中的一种。
[0018] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述Prescission Protease酶带有 GST标签。
[0019] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)所述的Q肿层析柱的填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF或化pto Q中的一种。
[0020] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中洗脱流速为15ml/min，洗脱梯度为B液 从0到100 %。
[0021] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤5)所述的G 25层析柱的填料选自S邱hadex G-25Coarse、S邱hadex G-25Medium、S邱hadex G-25Fine或S邱hadex G-25Superfine中的 一种。
[0022] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤6)所述的Q肿层析柱的填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF或化pto Q中的一种。
[0023] 由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
[0024] 本发明的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收 率较好。
【附图说明】
[00巧]图1为重组质粒pGex-6P-2-Vac33的双酶切鉴定结果。其中，泳道1:核酸(DNA)分子 量标准(Marker)，从上到下大小分别为:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2:重 组表达质粒pGEX-6p-2-Vac33经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约 lOOObp。
[0026] 图2为GST亲和PP酶酶切及Q HP层析SDS-PAGE结果，图中，泳道Μ:蛋白分子量 marker;泳道1: ΡΡ酶酶切后洗脱样本;泳道2: Q HP洗脱样品。
[0027] 图3为Q HP层析图。
[002引图4为G 25层析图。
[0029] 图5为Q HP层析图。
[0030] 图6为Q HP层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker;泳道1:Q HP流 穿样品。
[0031] 图7为蛋白HPLC检测结果(其中，①为杂质峰，②为目的蛋白峰，③为系统峰）。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用w解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0033] 除非特别指明，本申请所使用的重组蛋白Vac33由铜绿假单胞菌ΙΠ 型分泌系统组 件蛋白（PcrV)的片段通过连接肤化inker)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白（OprI)的片段融合 而成，所述重组蛋白具有W下通式:PcrV片段-(Linker)n-化rl片段;其中，所述连接肤序列 选自 GGGGS、GGSGG、YAPVDV 中的一个，优选为 GGGGS; η为 1、2、3或 4。
[0034] 在本发明实施例中，所使用的重组蛋白Vac33的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示； 编码该重组蛋白的核巧酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[00巧]表达该重组蛋白化c33的选自大肠杆菌化1-blue、化21系列或丽S174系列。
[0036] 建议补充本发明所使用的各缓冲液、洗脱液的配制方法，W保证充分公开。
[0037] 菌株与各种试剂如下：
[0038] 1.铜绿假单胞菌菌株
[0039] 铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(ΛTCC返BAA-47?);
[0040] 2.试剂
[0041] 质粒pGEX-6p-2、Glutathione Sepharose 4B、Sephadex G-25Medium、Q S巧harose HP购自GE Healthcare Life Sciences公司，申请人保存；
[0042] 大肠杆菌菌株XL-化lue购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；
[0043] primeSTAR HS DNA 化lymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH 巧此coR I、蛋 白Marker为大连TakaRa公司产品；
[0044] 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
[0045] 化抽P〇4.12此0、化出P〇4.2此0、化C1、化0H、Tween-20、化肥〇3，化2C〇3购自国药集团 化学试剂有限公司；
[0046] PBS、HRP标记的羊抗小鼠 IgG、IgGl、IgG2a抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公 司；
[0047] Tryptone、Yeast extract均购自英国0X0ID公司；
[004引 Ampici 11 ine、0.9 %氯化钢注射液购自太极集团西南药业；
[0049] 1?了