大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于微生物检测领域，具体涉及大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：
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化妆品含有营养丰富的蛋白质、脂肪、维生素、无机盐等，极利于微生物的生长和繁殖。微生物生长繁殖可引起化妆品腐败变质，还可产生毒素或代谢产物。这些异物作为变应原或刺激原可能会对使用部位产生致敏或刺激作用，引起各类型化妆品皮肤病，例如接触性皮炎、痤疮、毛发损害、光感性皮炎和皮肤色素异常等，因此，《化妆品卫生规范》(2007年版)中规定，每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，其中大肠杆菌是粪大肠菌群中与人类生活密切相关的一种菌，为人和温血动物肠道中的正常寄生细菌，作为粪便污染的最佳指示菌，大肠杆菌检出的意义最大。

目前，检测化妆品中病原细菌的方法主要是细菌学培养，通常需经富集培养、形态观察、生理生化鉴定等过程，操作繁琐、耗时费力，而且一次只能检测一种病原细菌，难以满足快速检测的需求。而以PCR技术为代表的现代分子生物学方法，通过特异引物在热循环仪中对靶标基因片段进行指数倍增。信号放大，已成为病原菌快速检验的理想之选。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条目的DNA片段，采用这一技术可实现多种病原微生物的同时检测，该技术在食品、饮用水中已有应用，但在化妆品领域较少见，因此，迫切需要建立快速、高效、可同时检测多种病原微生物的化妆品微生物检测方法。

技术实现要素：
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本发明利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的特异性鉴别基因，分别设计了特异性引物，采用多重PCR技术对3种病原菌进行快速检测。通过对多重PCR检测体系的优化，开发了针对化妆品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的多重PCR检测试剂盒；同时，结合前处理技术，建立了检测准确，高效的检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对大肠杆菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'；针对铜绿假单胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'；针对金黄色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'。

本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒包含权利要求1所述的多重PCR检测引物。

所述的多重PCR检测试剂盒还包括含Mg²⁺的PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

本发明的第三个目的是提供上述的多重PCR检测引物或多重PCR检测试剂盒在检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)对待测的化妆品样品进行增菌培养，然后提取细菌的基因组DNA作为模板；b)利用权利要求1所述的多重PCR检测引物进行多重PCR扩增；c)检测多重PCR扩增产物，判断化妆品样品中是否存在大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

所述的步骤a)所述的对待测的化妆品样品进行增菌培养具体为将待测的化妆品样品接种到SCDLP增菌液中进行增菌培养，所述的SCDLP增菌液为：每升含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、NaCl 5g、K₂HPO₄ 2.5g、葡萄糖3g、组氨酸4g、硫乙醇酸钠1g、卵磷脂2g和吐温-80 10g，余量为蒸馏水，pH7.2～7.3。

所述的多重PCR扩增的反应体系为：DNA模板1pg～100ng、含Mg²⁺的10×缓冲溶液10mM、dNTP 0.2mM、Taq DNA聚合酶1.0U、上述的多重PCR检测引物phoA-F、phoA-R、oprL-F、oprL-R、nuc-F和nuc-R各0.5μM，加ddH₂O至总体积为25μL；所述的多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s、54℃退火40s、72℃延伸1min20s，进行30个循环；72℃延伸10min。

本发明的通过组合大肠杆菌碱性磷酸酶基因(phoA基因)、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因(oprL基因)和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc基因)序列分别设计特异性引物，利用该特异性引物按照本发明的方法对样品进行多重PCR检测，可一次实现对样品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的特异性检测，具有检测特异性强、灵敏度高、没有引物二聚体形成等优势，三对引物扩增DNA的灵敏度分别为1.59pg/μL、1.69pg/μL、1.34pg/μL。

本发明提供的针对化妆品中大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法还具备检测操作简单、灵敏度高、特异性强，检测时间短等特点，与传统检测方法相比可大大节省检测成本和时间，提高检测的效率和准确性，具有广泛的市场应用前景，同时本发明的检测方法中设置了阳性对照和空白对照，保证了结果的准确性。

附图说明：

图1是3种病原菌单重PCR扩增结果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板为大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538的总DNA，1的引物为phoA-F/phoA-R，2的引物为oprL-F/oprL-R，3的引物为nuc-F/nuc-R，4的引物为phoA-F/phoA-R和oprL-F/oprL-R，5的引物为phoA-F/phoA-R和nuc-F/nuc-R，6的引物为oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，7的引物为phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，8为空白对照。

图2是引物phoA-F/phoA-R的灵敏度和特异性的扩增结果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板为大肠杆菌ATCC8039基因组DNA，1～7的模板终浓度分别为159.15ng/μL、15.915ng/μL、1.59ng/μL、159.15pg/μL、15.915pg/μL、1.59pg/μL和0.159pg/μL，8代表铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，9代表金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，10代表恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，11代表荧光假单胞菌Pseudomonas Fluorescens，12代表洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia，13代表表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis，14代表腐生葡萄球菌Staphylococcus saprophytics，15代表嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia，16代表肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，17代表弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii，18代表粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，19代表地衣芽胞杆菌Bacillus lincheniformis，20代表枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

图3是引物oprL-F/oprL-R的灵敏度和特异性的扩增结果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板为铜绿假单胞菌ATCC9027基因组DNA，1～7的模板终浓度分别为169.34ng/μL、16.934ng/μL、1.69ng/μL、169.34pg/μL、16.934pg/μL、1.69pg/μL和0.169pg/μL，8代表大肠杆菌Escherichia coli，9～20代表的菌株同图2。

图4是引物nuc-F/nuc-R的灵敏度和特异性的扩增结果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板为金黄色葡萄球菌ATCC6538基因组DNA，1～7的模板终浓度分别为134.48ng/μL、13.448ng/μL、1.34ng/μL、134.48pg/μL、13.448pg/μL、1.34pg/μL和0.134pg/μL，8代表大肠杆菌Escherichia coli，9代表铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，10～20代表的菌株同图2。

图5是引物对phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R对大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538的总DNA的灵敏度扩增的结果，其中，M代表DNA marker，1～7的模板终浓度分别为151.23ng/μL、15.123ng/μL、1.51ng/μL、151.23pg/μL、15.123pg/μL、1.51pg/μL和0.151pg/μL，8代表空白对照。

图6是检测的化妆品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR扩增结果，其中，M代表DNA marker，1代表保湿乳，2代表化妆水，3代表面霜，4代表洁面膏，5代表爽肤水，6代表粉底液，7代表精华液，8代表阳性对照，9代表阴性对照。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：多重PCR检测引物的设计与筛选

1、引物设计

分别将大肠杆菌碱性磷酸酶基因(phoA基因)、铜绿假单胞菌外膜蛋白基因(oprL基因)和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc基因)作为特异性检测目标序列，进行引物设计，筛选出特异性高的3对引物如下所示：

针对大肠杆菌phoA基因：phoA-F：5'-GTTTCTACCGCAGAGTTG-3'(如SEQ ID NO.1所示)，phoA-R：5'-GACTATGACCAGCGTGTT-3'(如SEQ ID NO.2所示)，扩增的片段长度为663bp。

针对铜绿假单胞菌oprL基因：oprL-F：5'-GGCGTGCTGATGCTCGTA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，oprL-R：5'-CGCTGACCGCTGCCTTTC-3'(如SEQ ID NO.4所示)，扩增的片段长度为444bp。

针对金黄色葡萄球菌nuc基因：nuc-F：5'-ACATAAAGAACCTGCGAC-3'(如SEQ ID NO.5所示)，nuc-R：5'-CATTTTTCCATCAGCATA-3'(如SEQ ID NO.6所示)，扩增的片段长度为274bp。

2、单重PCR灵敏度和特异性实验

采用合成好的引物对phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R中的一对引物、两对引物和三对引物分别对大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538三株菌株等量混合后提取的总DNA进行PCR扩增，结果扩增出663bp、444bp和274bp的特异性片段，扩增片段大小与预期一致(图1)。

PCR扩增的反应体系为：浓度为10ng/μL的DNA模板1μL、含Mg²⁺的10×缓冲溶液10mM(终浓度)、dNTP 0.2mM(终浓度)、Taq DNA聚合酶1.0U、上下游引物各0.5μM(终浓度)，加ddH₂O至总体积为25μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s、54℃退火40s、72℃延伸1min20s，进行30个循环；72℃延伸10min。

2.1单重PCR灵敏度实验

以大肠杆菌ATCC8039基因组DNA作为DNA模板，按照终浓度分别为159.15ng/μL、15.915ng/μL、1.59ng/μL、159.15pg/μL、15.915pg/μL、1.59pg/μL和0.159pg/μL进行添加，利用引物对phoA-F/phoA-R按照上述的PCR扩增的反应体系和反应条件进行单重PCR扩增。

以铜绿假单胞菌ATCC9027基因组DNA作为DNA模板，按照终浓度分别为169.34ng/μL、16.934ng/μL、1.69ng/μL，169.34pg/μL、16.934pg/μL、1.69pg/μL和0.169pg/μL进行添加，利用引物对oprL-F/oprL-R按照上述的PCR扩增的反应体系和反应条件进行单重PCR扩增。

以金黄色葡萄球菌ATCC6538基因组DNA作为DNA模板，按照终浓度分别为34.48ng/μL、13.448ng/μL、1.34ng/μL、134.48pg/μL、13.448pg/μL、1.34pg/μL和0.134pg/μL进行添加，利用引物对nuc-F/nuc-R按照上述的PCR扩增的反应体系和反应条件进行单重PCR扩增。

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明：引物对phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R的灵敏度分别为1.59pg/μL、1.69pg/μL、1.34pg/μL(图2～4)。

2.2单重PCR特异性实验

分别采用引物对phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R，按照上述的PCR扩增的反应体系和反应条件分别对从污染化妆品中分离出的11株污染菌株(恶臭假单胞菌，荧光假单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，嗜麦芽窄食单胞菌，肺炎克雷伯氏菌，弗氏柠檬酸杆菌，粘质沙雷氏菌，地衣芽胞杆菌，枯草芽孢杆菌)进行PCR扩增，结果均未扩增出条带(图2～4)，说明上述三对引物对大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538这3种病原菌有良好的检测特异性和准确性。

3、多重PCR检测灵敏度实验

将大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538三株菌株等量混合后提取总DNA作为DNA模板，按照终浓度分别为151.23ng/μL、15.123ng/μL、1.51ng/μL、151.23pg/μL、15.123pg/μL、1.51pg/μL和0.15pg/μL进行添加，同时采用三对引物phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R按照上述的PCR扩增的反应体系和反应条件(步骤2)进行多重PCR扩增。结果采用上述三对引物扩增的灵敏度均为1.51pg/μL(图5)。

实施例2：化妆品中3种致病菌的检测

(1)人工污染样品的制备：某公司送检的七个不同类型的化妆品样品，分别为保湿乳、化妆水、面霜、洁面膏、爽肤水、粉底液和精华液，采用《化妆品卫生规范》(2007版)中微生物检测方法进行检测，均未发现微生物污染，进行人工随机病原菌污染，保湿乳中加入大肠杆菌ATCC8039和铜绿假单胞菌ATCC9027，化妆水中加入铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538，面霜中加入大肠杆菌ATCC8039和金黄色葡萄球菌ATCC6538，洁面膏中加入大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538，爽肤水中加入恶臭假单胞菌和腐生葡萄球菌，粉底液中加入洋葱伯克霍尔德菌和表皮葡萄球菌，精华液中加入肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌，由此制备得到各化妆品的人工污染样品。

(2)样品的细菌增菌培养：分别取10g人工污染样品，加入90mL SCDLP增菌液中(菌悬液中各菌株的终浓度均为10²CFU/mL)，充分混匀后，置于37℃振荡培养箱中150rpm培养6h，阴性对照为100mL SCDLP增菌液，阳性对照为加入大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538的100mL SCDLP增菌液(菌悬液中3株菌株的终浓度均为10²CFU/mL)；SCDLP增菌液的配方为：每升含有蛋白胨20g，牛肉膏3g，NaCl 5g，K₂HPO₄2.5g、葡萄糖2.5g，组氨酸5g，硫乙醇酸钠1g，卵磷脂2g，吐温-80 10g，蒸馏水1000mL，调pH7.2～7.3，121℃高压灭菌20min。

(3)基因组DNA提取：取上述振荡培养后的增菌液各10mL，离心收集菌体，用生理盐水洗涤3次，采用Magen细菌DNA提取试剂盒分别提取七个化妆品的人工污染样品、阴性对照和阳性对照的细菌基因组DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度计测定浓度，于-20℃保存备用。

(4)多重PCR扩增：以步骤(3)提取的基因组DNA为模板，利用引物对phoA-F/phoA-R、oprL-F/oprL-R和nuc-F/nuc-R进行多重PCR扩增，多重PCR扩增的反应体系为：总体积为25μL，浓度为10ng/μL的DNA模板1μL，10×缓冲溶液(含Mg²⁺)10mM，dNTP 0.2mM，Taq DNA聚合酶1.0U，引物phoA-F、phoA-R、oprL-F、oprL-R、nuc-F和nuc-R各0.5μM，加ddH₂O补足至25μL；多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火40s，72℃延伸1min20s，进行30个循环，72℃延伸10min。

取PCR扩增产物5μL用1.0％琼脂糖凝胶(含染色剂Gold view)在120V电压下电泳30min，然后置于Bio-Red凝胶成像分析系统中观察结果(图6)。

PCR扩增产物的电泳结果表明，污染有大肠杆菌ATCC8039、铜绿假单胞菌ATCC9027和金黄色葡萄球菌ATCC6538这3种病原菌中的两种或三种的化妆品样品(保湿乳、化妆水、面霜、洁面膏)均能检出各基因相应条带，而没有污染这3种病原菌的化妆品样品(爽肤水、粉底液、精华液)未出现条带，说明本发明的多重PCR检测引物能快速、准确检测出污染化妆品中的大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测引物、试剂盒和检测方法

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttctaccg cagagttg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactatgacc agcgtgtt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcgtgctga tgctcgta 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctgaccgc tgcctttc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acataaagaa cctgcgac 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catttttcca tcagcata 18