针对铜绿假单胞菌pcrv抗原的抗体的制作方法

专利名称：针对铜绿假单胞菌pcrv抗原的抗体的制作方法
针对铜绿假单胞菌PCRV抗原的抗体相关申请的交叉引用本申请要求于2007年11月30日提交的美国第60/991，679号临时申请的权益， 该申请通过引用的方式并入本文中。
背景技术：
铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是机会致病菌，其极少在健康人体内引起疾病，但 对于危重病人或免疫受损的个体却是个严重问题。在囊性纤维化(CF)的个体内，感染是主 要问题，其中，铜绿假单胞菌在由反复和慢性呼吸道细菌感染引起的肺功能进行性衰竭中 是致病因子。其他面临铜绿假单胞菌感染风险的人包括机械通气的患者、嗜中性粒细胞减 少的癌症患者和烧伤患者。铜绿假单胞菌通常对大多数抗生素具有抗药性，因此亟需新的 治疗方法。III型分泌系统是重要的毒力因子决定子，原因是它抑制宿主的防御体系。被激活 时，III型分泌器官将毒素转移到宿主细胞的细胞质内，导致细胞变圆、浮起，以及通过坏死 或凋亡的细胞死亡。PcrV是III型分泌器官的主要成分。阻断PcrV能够抑制毒素分泌物 通过III型分泌系统，由此允许自然清除机制消除细菌。在迄今检测的所有铜绿假单胞菌 品系试验中，PcrV是保守的。针对假单胞菌PcrV抗原的抗体为本领域所熟知。本发明提供了例如用于治疗铜 绿假单胞菌感染的改良的PcrV抗体。发明概述本发明涉及工程抗体，其以例如大约50nM或大约IOnM或更低的高亲和力，结合到 来自铜绿假单胞菌的PcrV抗原。这种抗体通常是III型分泌的功能拮抗剂，即为结合到 PcrV并抑制III型分泌系统的抗体。在某些实施方案中，本发明中的抗体可以结合到PcrV 并募集免疫系统的多种类型的细胞，以刺激巨噬细胞的吞噬作用、巨噬细胞或NK细胞的抗 体依赖性细胞毒性作用(ADCC)、补体级联的活化和/或嗜中性粒细胞氧化爆发的发生。本发明的抗体具有与人种系Vh和\序列高度一致性的可变区，并且在人体内 免疫原性较低。本发明的重链和轻链的CDR3序列包含一对来自单克隆抗-PcrV抗体 Mab 166 (Frank et al，J. Infections Dis. 186 :64_73，2002)的结合特异性决定子(BSD)。 本发明的抗体通常能够与Mabl66竞争对PcrV蛋白上的中和表位的结合。CDRH3中的BSD序列具有氨基酸序列NRGDIYYDFTY。CDRL3中的BSD是FWXTP (其 中的X可以是S或G)。完整的V区通过如下方式产生，即其中的BSD形成部分⑶R3，另外 的序列用于完成⑶R3和增加FR4序列。一般地，除去BSD的⑶R3部分和完整FR4由人种系 序列组成。优选地，除去BSD的CDR3-FR4序列与人种系序列(human germ-line sequence) 的差异在每链上不超过两个氨基酸。CDR3-FR4与V-节段连接，所述V-节段与人种系V-节 段具有高度一致性，例如至少80%、或至少90%或更多。在某些方面，本发明提供了抗-Pcrv抗体，其展示了对PcrV的高亲和力结合，例如 IOnM或更高，并且是III型分泌系统的拮抗剂。在许多实施例中，选择性地结合到PcrV的本发明的抗-PcrV抗体包含包含含有
6FffGTP的⑶R3的\区。在典型的实施例中，这种抗体具有与人类种系V节段至少80% — 致性的\区V节段。FR4区与人类种系J节段的FR4区通常具有至少90%的一致性。在某些实施方案中，本发明的抗-PcrV抗体包含含有FWGTP的⑶R3、FR4和V节段， 其中FR4包含与人JK2种系基因节段的FR4区至少90%的一致性或与JL2种系序列至少 90%的一致性；以及V节段包含与人种系Vk I或VK III序列至少80 %的一致性，或与人 种系Va序列至少80%的一致性。在某些实施方案中，\区⑶R3具有序列Q(Q/H)FWGTPYT。 在某些实施方案中，抗体进一步包含Vh区，所述的Vh区包含具有序列NRGDIYYDFTY的⑶R3、 FR4和V节段，其中FR4包含与人JH3或人JH6节段的FR4区至少90%的一致性，以及V节 段包含与人VH1-18亚类V节段或与人VH3-30. 3V节段至少80%的一致性。在某些实施方 案中，该Vh区包含具有序列NRGDIYYDFTYA(MziF)DX1的CDR3，其中X1是I、Q、Y或S。在另外的实施方案中，本发明提供了结合PcrV的抗-PcrV抗体，其包含Vh区，所 述Vh区包含⑶R3、FR4和V节段，所述⑶R3具有序列NRGDIYYDFTYAMDX:，其中X1是I、Q、Y 或S ；其中FR4包含与人种系JH3节段的FR4区或人种系JH6节段的FR4区至少90%的一 致性，以及V节段包含与人种系VH1-18亚类V节段或与人种系VH3-30. 3亚类V节段至少 80%的一致性，条件是当X1是Y时，FR4区不是WGQGTSVTVSS。在某些实施方案中，本发明提供了结合PcrV的抗-PcrV抗体，其包含Vh区和\区， 所述Vh区包含CDR3、FR4和V节段，所述CDR3具有序列NRGDIYYDFTYAMDX:，其中X1是I、 Q、Y或S，其中FR4包含与人种系JH3节段的FR4区或人种系JH6节段的FR4区至少90% 的一致性，以及V节段包含与人种系VH1-18亚类V节段或与人种系VH3-30. 3亚类V节段 至少80%的一致性，条件是当X1是Y时，FR4区不是WGQGTSVTVSS ；以及所述Vl区包含具有 Fff (S/G) TP的CDR3、FR4和V节段，其中FR4包含与人种系JK2基因节段的FR4区或人种系 几2节段的FR4区至少90%的一致性；以及V节段包含与人种系VKI L12序列至少80%的 一致性、或与Vk III序列至少80%的一致性、或与人种系Va2 2(3或￥；^331节段至少80% 的一致性。在某些实施方案中，本发明抗体的Vh区的FR4具有序列WGQGTX2VTVSS，其中X2是 T或M。在某些实施方案中，本发明的抗体具有含有序列Q(H/Q)FW(G/S)TPYT的轻链 CDR3。在某些实施方案中，Vl区的FR4具有序列TOQGTKLEIK或FGGGTKLTVL。本发明还提供了抗-PcrV抗体，其中Vh区V节段与人种系VH3-30. 3节段具有至少 80%的一致性。以及重链区CDRl包含序列X3X4X5X6H,其中X3是S、T或N ;X4是Y或A ；X5是 A、G 或 P ；以及 X6 是 Μ、I 或 L。以及重链区 CDR2 包含序列 X7IX8YX9GXltlX11X12X13Y (A/I) X14SVKG, 其中 X7 是 V、F 或 N ;X8 是 S 或 W ;X9 是 D 或 N ；X10 是 S、K、R 或 Y ；X11 是 N、S、D 或 E ；X12 是 K、I 或E ；X13是Y、S、D或W ；以及X14是D或S。在某些实施方案中，抗体与VH3-30. 3V节段具有 至少90%的一致性。在某些实施方案中，CDRl是1々61^、5丫61!1、5￥61^、5￥ 1^或附 ]\ 。在 某些实施方案中，CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、VISYDGSEKWYADSVKG、 VIWYDGRNKYYADSVKG、VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。在某些实施方案 中，CDRl 是 TAGMH、SYGIH、SYGMH、SYPLH 或 NYPMH ；以及 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG, FISYDGSEKYYASSVKG、VISYDGSEKWYADSVKG、VIWYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或NIWYDGSSESYIDSVKG。本发明还提供了抗-PcrV抗体，其中Vh区V节段与人种系VH1-18亚类V节段具 有至少80%的一致性或至少90%的一致性，以及⑶Rl具有序列DHAIS，且⑶R2具有序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo本发明还提供了结合到PcrV的抗-PcrV抗体，包含具有⑶R3序列 NRGDIYYDFTYAFDI、CDRl 序列 DHAIS 和 CDR2 序列 WISPYSGNPNYAQSLQG 的 Vh 区。在某些实施方案中，Vh区包含选自 SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、26、27、29和35的氨基酸序列的V节段区。例如，Vh区能够包含选自SEQ ID NOs 1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列。本发明还提供了抗-PcrV，其中八区V节段包含与人种系Vk I 1^12或￥&111序列 至少80%或90%的一致性；或与人种系V λ 331或与V λ 22c序列至少80%或90%的一致 性。在某些实施方案中，\区V节段与人种系VKI L12节段具有至少80 %或90 %的一致性， 以及 CDRl 具有序列 RASX15X16X17X18X19X20X21A,其中 X15 是 Q 或 E ；X16 是 S 或 G ；X17 是 I 或 V ；X18 是S或D ；X19是S、R或T ；X20是W或Y ；X21是L或V ；以及CDR2具有序列X21ASX22LX23S,其中X21 是D或A ；X22是S、A或T ；X23是E、Q或K。在某些实施方案中，CDRl具有序列RASQGISTYLA、 RASQGI SSffLA, RASQSI SRffVA 或 RASEGVDRWLA ；或 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、 DASALQS 或 DASTLQS。在某些实施方案中，CDRl 具有序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、 RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；以及 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。本发明还提供了抗-PcrV抗体，其中八区V节段与人种系VKIIIL2序列具有 至少80 %或至少90 %的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列RASNSVGAYNLA或 RASQSVSSNLA ；或CDR2具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。在某些实施方案中，CDRl具有序列 RASNSVGAYNLA 或 RASQSVSSNLA ；以及 CDR2 具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。另外，本发明提供了抗-PcrV抗体，其中\区V节段与人种系V λ L331节段具有至 少80%或至少90%的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS ；或⑶R2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。在某些实施方案中，CDRl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS;以及 CDR2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。在某些实施方案中，本发明提供了抗-PcrV抗体，其中\区V节段与人种系 VXL22c节段具有至少80%或至少90%的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列 TGTSSDVGAYNYVS 或 TGTSSDYVS ；或 CDR2 具有序列(E/D)VT(K/N)RPS。在某些实施方案中， CDRl 具有序列 TGTSSDVGAYNYVS 或 TGTSSDYVS ；以及 CDR2 具有序列(E/D) VT (K/N) RPS。本发明的抗-PcrV抗体能够具有包含选自SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、28、30、32、34、36和37的氨基酸序列的V节段的区域。例如Vl区能够包含选自 SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列。本发明因此提供了抗-PcrV抗体，其包含具有选自SEQ ID N0sl、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列 区；以及具有选自 SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列的 Vl 区。因此， 在某些实施方案中，本发明的抗体包含SEQID N0:1&VH区和SEQ ID NO :2的Vl区；或SEQ ID NO 3 的 Vh 区和 SEQ ID NO 4 的 \ 区；或 SEQ ID NO 5 的 Vh 区和 SEQ ID NO 6 的 Vl 区；或 SEQ ID NO 7 的 Vh 区和 SEQ ID NO 8 的 \ 区；或 SEQ IDNO 11 的 Vh 区和 SEQ ID NO 12 的 Vl 区；或 SEQ ID NO 9 的 Vh 区和 SEQ ID NO 10 的 Vl 区；或 SEQ ID NO 13 的 Vh 区和 SEQ ID NO 10 的 Vl 区；或 SEQ ID NO 13 的 Vh 区和 SEQ ID NO 4 的 \ 区；或 SEQID NO 13 的 Vh 区和 SEQ ID NO 37 的 \ 区；或 SEQ ID NO 21 的 Vh 区和 SEQ ID NO 18 的 \ 区；或 SEQ ID NO 17 的 Vh 区和 SEQ IDNO 18 的 \ 区；或 SEQ ID NO 26 的 Vh 区和 SEQ ID NO 24 的 Vl 区；或 SEQ ID NO 25 的 Vh 区和 SEQ ID NO 24 的 \ 区；或 SEQ ID NO 23 的 Vh 区和 SEQ ID NO 24 的 \ 区；或 SEQ ID NO 35 的 Vh 区和 SEQID NO 36 的 \ 区；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 区和 SEQ ID NO 20 的 \ 区；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 区和 SEQ ID NO 28 的 \ 区；或 SEQ IDNO 29 的 Vh 区和 SEQ ID NO :30 的八区；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 区和 SEQ ID NO 34 的 \ 区；或 SEQ ID NO 3 的 Vh 区和 SEQ ID NO 32 的 Vl 区。在某些实施方案中，本发明的抗-PcrV抗体包含如图1中所示的重链和/或如图2 中所示的轻链；或具有至少一个，通常至少两个，以及在某些实施方案中至少三个分别来自 图1或图2中所示的重链或轻链之一的⑶Rs。在许多实施方案中，该⑶Rl和/或⑶R2序 列不是种系序列。在某些实施方案中，该抗体是Fab'片段。在某些实施方案中，本发明的抗体是Fab或Fab'，其具有大约IOnM或更低的亲 和力。在某些实施方案中，该抗体具有与Mab 166Fab或Fab'的亲和力相等或更佳的亲和 力。本发明的抗体例如Fab在抑制铜绿假单胞菌III型分泌系统的活性方面的效能与 Mab 166Fab通常是等价的(在基于细胞的检测中处于二倍活性之内)。在某些实施方案中， 本发明的抗体在阻止由铜绿假单胞菌引起的细胞毒性方面比Mab 166更有效。在某些实施方案中，该抗体包含铰链区。在其他实施方案中，该抗体是IgG或IgA。在某些实施方案中，该抗体是聚乙二醇化的。例如，该抗体可以是双-聚乙二醇化 的。在某些实施方案中，Vh区或\区，或者Vh区和\区两者的氨基酸序列在N末端包 含甲硫氨酸。另一方面，本发明提供了治疗感染铜绿假单胞菌的患者的方法，该方法包含给予 治疗有效量的此处所描述的抗体。在某些实施方案中，该抗体通过静脉内、皮下或通过吹入 法被给予。


图1显示了抗-PcrV抗体的Vh区的序列。⑶R序列用下划线标示。将VHl序列与 人种系序列VH1-18比对。将显示的VH3-亚类抗体与人种系序列VH3-30. 3比对。将J-节 段与人种系JH3或JH6比对。图1中描述的Vh-节段的序列对应于直达CDR3序列的序列相当。图2显示了抗-PcrV抗体的八区的序列。⑶R序列用下划线标示。V κ -亚类抗 体被展示与人种系序列VKI L12比对。J-节段与人种系JK2比对。νλ-亚类抗体被展示 与人种系序列V1331比对。J-节段与人种系几2比对。
图3显示了能够连接到Fab'重链和轻链的示例性恒定区序列。用于结合巯基反 应性马来酰亚胺衍生物的铰链区中的两个半胱氨酸残基用下划线标示。参与链间二硫键形 成的半胱氨酸残基用方框标示。图4显示了双-聚乙二醇化的Fab'结构的示意图，其中mPEG-马来酰亚胺的两个 分子通过硫醚键连接到Fab'蛋白的铰链区的半胱氨酸残基。示例性的抗体由人Fd'重链 和人κ轻链组成，该Fd'重链和κ轻链通过两条链间的由交叉棒(cross bar)表示的二 硫键连接。(Fab和PEG部分不按比例)图5提供的数据显示了在以致死剂量的PA103激发时用不同剂量的针对PcrV的 抗体治疗的小鼠的存活时程。Mabl66和Fab片段与1. 5x106细菌经由气管内径路被共 同滴入(每组5只小鼠，4只小鼠用于Mabl66Fab组)。对照是不结合PcrV或任何铜绿 假单胞菌蛋白的非特异性Fab。以下列抗体剂量治疗小鼠A)10yg，B)5yg, C)2.5yg, D) 1. 25 μ g，对于 Fab 1A8 对Mabl66Fab，*P = 0. ΟΙΕ) 0· 625 μ g，对于 1A8 对Mabl66Fab，*P = 0. 002F)0. 3125μ g，G)0. 16μ g，H)0. 08 μ g。用于表示治疗组间差异的P值通过Mantel-Cox 时序检验来测定。图6提供的数据显示了用抗-PcrV抗体治疗的小鼠的体温分析。显示了 48小时 或直至死亡的直肠温度。抗体剂量A) 10 μ g，Β)5μ g, C)2. 5μ g, D) 1. 25 μ g Ε)0. 625 yg F) 0. 3125 μ g, G) 0. 16 μ g, H) 0. 08 μ g。图7提供的数据显示了铜绿假单胞菌通过抗-PcrV从感染小鼠肺部的清除率。小 鼠用1.5xl06cfu PA 103感染，所述PA 103与所示剂量(以μ g表示)的Mab 166IgG，Mab 166Fab或人Fab 1A8共滴入。该图显示了从在48小时存活的个体小鼠分离的每肺的cfu。 在这一时间点的死亡小鼠的数目显示在该图上方。每组存活小鼠的中值cfu/肺用棒(bar) 表不。发明详述如本文所用的，“抗体”指蛋白，该蛋白在功能上被定义为结合蛋白，在结构上被定 义为包含的氨基酸序列被本领域技术人员公认为来自产生抗体的动物的免疫球蛋白编码 基因的框架区。抗体能够包含一个或多个基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段 编码的多肽。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε*μ恒定区基因，以及多 种免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为Y、μ、α、δ或ε，其依次分别 定义免疫球蛋白类型IgG，IgM, IgA, IgD和IgE0已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对完全相 同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N 末端确定了由大约100-110或更多的氨基酸构成的可变区，主要负责抗原识别。术语可变 轻链和可变重链(Vh)分别指这些轻链和重链。此处使用的术语“抗体”包括保留结合特异性的抗体片段。例如，有许多表征清楚 的抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键下游消化抗体，以产生F(ab) ! 2，Fab 的二聚体，该二聚体自身是通过二硫键连接到VH-CHl (Fd)的轻链。该F(ab)、能够在温和 条件下被还原，以破坏在铰链区的二硫键，从而将(Fab' )2 二聚体转化为Fab'单体。该 Fab'单体本质上是带有全部或部分铰链区的Fab (参见Fundamental Immunology (基础免 疫学)，1丄.？3111，6(1.，1^%11 Press, N. Y. (1993)，对于其他抗体片段的更具体的描述)。尽
10管根据完整抗体的消化定义了多种抗体片段，本领域技术人员会认识到能够以化学方式或 通过利用重组DNA方法学从头合成片段。因此，此处使用的术语抗体还包括通过完整抗体 的修饰产生的或利用重组DAN方法学合成的抗体片段。本发明的抗体包括诸如二聚体、Vh 二聚体或\ 二聚体的二聚体，包括单链抗 体(以单多肽链存在的抗体)，诸如单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链区和可变轻 链区连接在一起(直接地或通过肽连接子)以形成连续的多肽。单链Fv抗体是共价连接 的Vh-Vl异源二聚体，其从包括直接连接的或通过肽编码连接子连接的Vh-和编码序列 的核酸表达(例如，Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA, 85 :5879_5883，1988)。虽然 Vh 和\作为单多肽链相互连接，但Vh和\结构域的结合是非共价的。可选择地，该抗体可以 是另一片段，诸如二硫化物稳定的Fv(dsFv)。还可以包括利用重组技术产生其他片段。将 来自抗体V区的天然聚合但以化学方法分离的轻及重多肽链转化成折叠为三维结构的分 子的scFv抗体和许多其他结构是本领域技术人员已知的，所述三维结构基本上与抗原结 合位点的结构相似。(参见诸如 U. S. Patent Nos. 5，091，513，5，132，405，及 4，956，778)。 在某些实施方案中，抗体包括那些已经通过噬菌体展示的或通过利用载体的重组技术产生 的那些，所述载体中，链被分泌为例如SCFV、FV、Fab、(Fab' )2的可溶蛋白或通过利用其中 链被分泌为可溶蛋白的载体的重组技术产生。用于本发明的抗体还可以包括双抗体和微型 抗体。本发明的抗体还包括例如来自骆驼科动物抗体的重链二聚体。由于骆驼科动 物体内的重链二聚体IgG的Vh区不必与轻链之间形成疏水作用，因此，通常接触轻链的 重链中的该区在骆驼科动物体内被改变为亲水性氨基酸残基。重链二聚体IgGs的Vh结 构域被称为VHH结构域。本发明的抗体包括单域抗体(dAbs)和纳米抗体(参见例如 Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64 :2853_2857,2004)。如本文所用的，“V-区”指抗体可变区结构域，该结构域包含框架1、⑶R1、框架2、 ⑶R2和框架3，包括⑶R3和框架4节段，这些节段作为B细胞分化期间重链和轻链V基因 重排的结果被加到V-节段上。本文使用的“V-节段”指由V基因编码的V-区(重或轻链) 的区。重链可变区的V-节段编码FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。出于本发明的目的，轻链可 变区的V-节段被定义为通过FR3延伸直到⑶R3。如本文所用的，术语“J-节段”指编码的可变区的亚序列，其包含⑶R3和FR4的C 末端部分。内源性J-节段由免疫球蛋白J基因编码。如本文所用的，术语“互补性决定区(CDR) ”指每条链上的三个高变区，其中断由轻 和重链可变区确立的四个“框架”区。这些⑶R主要负责结合到抗原表位。每条链的⑶Rs 通常指从N末端开始顺序编号为⑶R1、⑶R2和⑶R3，以及通常被其中有特定⑶R的链所确 定。因此，例如，Vh⑶R3位于它被发现的抗体重链可变结构域；而Vl⑶Rl是来自它被发现 的抗体轻链可变结构域的CDRl。不同轻或重链的框架区的序列在同一物种内是相对保守的。抗体的框架区是组成 型轻和重链的组合框架区，用于在三维空间定位和排列⑶Rs。CDRs和框架区的氨基酸序列可以利用为本领域技术人员所熟知的不同的定义来 确定，例如Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如Johnson et al，supra;Chothia&Lesk，1987，Canonical structures for the hypervariable regionsof immunoglobulins (用于免疫球蛋白高变区的极限结构式).J. MoI. Biol. 196,901-917 ； Chothia C. et al. ,1989,Conformations of immunoglobulin hypervariableregions( jki 疫球蛋白高变区的构造).Nature 342，877-883 ；Chothia C. etal.，1992，structural repertoire of the human VH segments (人 VH 节段的结构集合)· J. MoI. Biol. 227， 799-817 ；Al-Lazikani et al, J. MolBiol 1997，273 (4))。抗原结合位点的定义还在下 列文章中被描述Ruiz et al.，IMGT，国际免疫遗传学数据库。Nucleic Acids Res. 28， 219-221(2000)；以及Lefranc，Μ. -P. IMGT,国际免疫遗传学数据库。核酸研究，Janl ； 29(1) 207-9 (2001) ；MacCalIum et al, Antibody-antigen interactions :Contact analysis and binding site topography (抗体-抗原相互作用接触分析及结合位点布 局)，J. Mol. Biol.，262 (5) ,732-745(1996)；以及Martin et al,Proc. Natl Acad. Sci. USA， 86,9268-9272(1989) ；Martin, etal, Methods Enzymol，203，12卜153，(1991) ；Pedersen et al, Immimomethods, 1,126, (1992)；以及 Rees et al, In Sternberg Μ. J. Ε. (ed.), Protein Structure Prediction (蛋白质结构予页测)· Oxford UniversityPress, Oxford, 141-1721996)。“表位”或“抗原决定簇”指抗体与其结合的抗原上的位点。表位可以通过连续的 氨基酸或经由蛋白三级折叠紧靠的非连续的氨基酸形成。暴露于变性剂时，通过连续的氨 基酸形成的表位通常保持，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性剂处理时消失。表位 在独特的空间构象中通常包括至少3个，以及更通常地至少5个或8-10个氨基酸。确定表 位空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology () Vol. 66，Glenn E. Morris, Ed(1996)。本发明上下文中使用的术语“结合特异性决定簇”或“BSD”指在CDR区内用于确 定抗体结合特异性所必需的最小的连续或非连续氨基酸序列。在本发明中，该最小结合特 异性决定簇位于抗体重链和轻链的⑶R3序列的部分或全长内。如本文所用的，术语“PcrV拮抗抗体”或“抗-PcrV抗体是铜绿假单胞菌III型 分泌系统的拮抗剂”可互相替换使用，指结合到PcrV并抑制III型分泌系统的抗体。与不 受抗体拮抗剂作用的分泌相比，当经由III型分泌系统的分泌减少至少约10%，例如减少 至少大约25%、50%、75%，或完全抑制时，则发生了抑制作用。除非另有陈述，否则术语 “抗-PcrV抗体”和“PcrV抗体”同义使用。术语“平衡解离常数(Kd) ”指除以结合速率常数(ka，时间-Ι,Μ—1)的解离速率常数 (kd，时间―1)。平衡解离常数可以利用本领域技术人员所熟知的任一方法测量。本发明的抗 体是高亲和力抗体。这种抗体具有优于500nM，通常优于50nM或IOnM的亲和力。因此，在 某些实施方案中，本发明的抗体具有范围为500nM-100pM，或者范围为50或25nM-100pM，或 者范围介于为50或25nM-50pM，或者范围为50nM或25nM_lpM的亲和力。如本文所用的，“人源化抗体(humanized antibody)，，指将来自供体抗体的CDRs 移植到人框架序列的的免疫球蛋白分子。人源化抗体还可以在框架序列中包含供体来源 的残基。人源化抗体还可以包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。人源化抗体还可以 包含既不是在受体抗体也不是在输入的CDR或框架序列中发现的残基。人源化能够利用 本领域所熟知的方法来实现(例如，Jones et al, Nature 321 522~525 ； 1986 ；Riechmannet al. , Nature 332 323-327,1988 ；Verhoeyen et al，Science 239:1534-1536,1988)； Presta,Curr. Op. Struct. Biol 2 :593_596，1992 ；U. S. Patent No. 4，816，567)，包括诸如〃 超人化(superhumanizing)“抗体(Tan et al, J. Immunol 169 1119，2002)和〃表面重 塑(resurfacing) 〃 (e.g.,Staelens et al,MoL Immunol 43 1243,2006 ；and Roguska et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 91 :969，1994)的技术。本发明上下文中的“人工程化”抗体(“humaneered” antibody)指具有参照抗体 结合特异性的工程化人抗体。用于本发明的“人工程化”抗体具有包含从供体免疫球蛋白 衍生的最小序列的免疫球蛋白分子。通常地，抗体通过将编码来自参照抗体重链CDR3区 的结合特异性决定簇(BSD)的DNA序列连接到人Vh节段序列，以及将来自参照抗体轻链 ⑶R3BSD连接到人\节段序列被“人工程化”。“BSD”指介导结合特异性的⑶R3-FR4区，或 该区的一部分。因此，结合特异性决定簇可以是⑶R3-FR4、⑶R3、⑶R3的最小必需结合特异 性决定簇(其指当存在于抗体V区时赋予结合特异性的任一小于CDR3的区)、D节段(关 于重链区)，或赋予参照抗体结合特异性的CDR3-FR4的其他区。人工程化的方法在公布号 为20050255552的美国专利申请和公布号为20060134098的美国专利申请中被提供。当术语“杂种”被用于提及核酸或蛋白的部分时，表示该核酸或蛋白包含两个或多 个序列，这些序列通常不是在自然界发现的彼此有相同亲缘关系的序列。例如，该核酸通常 通过被排列来生产新的功能性核酸的无关联的基因以重组方式产生，其具有两个或多个序 列。近似地，杂种化蛋白指通常不是在自然界发现的彼此有相同亲缘关系的序列的两个或 多个序列。当术语“重组”被用于提及诸如细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白 或载体已经通过下列方式被修饰异源性核酸或蛋白的导入，或者天然核酸或蛋白的改造， 或者细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组的)形式的细 胞中没有发现的基因或表达天然基因，否则该天然基因会异常表达、低表达或完全不表达。 至于此处的术语“重组核酸”，指一般通过对核酸的处理，例如以自然界不常见的形式利用 聚合酶和内切核酸酶，最初在体外形成的核酸。通过这种方法，可以实现不同序列间的可操 作连接。由此，以线性形式存在的分离的核酸或通过连接正常不被连接的DNA分子在体外 形成的表达载体都被视为出于本发明目的的重组。可以理解，一旦重组核酸被形成并再导 入宿主细胞或生物体，它将以非重组形式复制，即利用宿主细胞的体内细胞机制，而不是通 过体内操纵。然而，这种核酸一旦以重组的形式生产，尽管此后以非重组形式复制，仍被视 为出于本发明目的的重组。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白，即通过如上所 述的重组核酸的表达。当指蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”到抗体或“与之发生特异性(或 选择性)免疫反应”指其中抗体结合到感兴趣蛋白的结合反应。在本发明的上下文中，抗体 通常结合PcrV的亲和力为500nM或更低，并对其他抗原具有5000nM或更高的亲和力。在两个或更多个多肽(或核酸)序列的情况下，术语“一致的”或“一致性”百分 比指相同的两个或更多个序列或亚序列，或者具有相同的氨基酸(或核苷酸)残基的特定 百分比的两个或更多个序列或亚序列(即，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对， 以得到最大相符时，在特定区域上大约60 % —致性，优选地70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 91 %，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高的一致)，如利用带有下述缺省参数的BLAST或BLAST 2. 0序列比较算法或通过人工比对和目视检测方法所测量的(参见 例如NCBI网站)。那么，这种序列被描述为“基本上一致的”。“基本上一致的”序列还包括 具有删除和/或添加的序列，以及具有取代以及天然存在的那些，例如多态性或等位变异 体和人造变异体。如下所述的，优选的算法能够将空位等考虑在内。优选地，蛋白序列一致 性存在于至少大约25个氨基酸长度的区，或更优选地存在于50-100个氨基酸长度的区，或 整个蛋白长度。如本文所用的，“比较窗”包括参照一般选自20-600、通常约50-约200、更通常约 100至约150个连续位置数的一个的节段，其中在将两序列最佳比对后，可以将序列与相同 连续位置数的参照序列比较。用于比较的序列的比对方法为本领域的技术人员所熟知。用 于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith & Waterman, Adv. App 1. Math. 2 =482(1981) 的局部同源性算法，通过Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol 48:443(1970)的同源性比对 算法，通过 Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci USA 85 2444(1988)的对相似性方 法的研究，通过这些算法的计算机实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP，BESTFIT, FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, WI)，或通过人工比对和 目视检测(参见例如Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学通用技术) (Au sub el et al.，eds. 1995supplement))进行。适于测定序列一致性百分比和序列相似性的优选的算法实例包括BLAST和BLAST 2.0 算法，这些算法在 Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 (1977)和 Altschul et al, J. Mol. Biol 215 :403_410 (1990)中被描述。具有本文所描述的参数的BLAST和 BLAST 2.0被用于测定本发明中的核酸和蛋白的序列一致性百分比。BLASTN程序(对于 核苷酸序列)使用的缺省值是字长(W)为11、期望值(E)为10、M = 5、N = -4以及进 行双链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是字长为3和期望值(E)为 10,以及 BL0SUM62 记分矩阵(参见 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 10915(1989))比对值(B)为50、期望值(E)为10、M = 5、N = -4以及进行双链的比较。术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指物质基本上或实质上没有通常如在其 天然状态中发现的伴随的组分。纯度和同质性通常利用诸如聚丙烯凝胶电泳和高效液相色 谱法的分析化学技术来测定。存在于制剂中的主要种类的蛋白是基本上纯化的。术语“纯 化的”在某些实施方案中表示在电泳凝胶中基本上产生一条带的蛋白。优选地，它表示蛋白 是至少85%纯的，更优选地至少95%纯的，以及最优选地至少99%纯的。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可以互相替换使用，用于指氨基酸残基的多聚 体。该术语适用于氨基酸多聚体，该氨基酸多聚体中的一个或多个氨基酸残基是与对应的 天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。此外，该术语还适用于天然存在的氨基酸多聚体、包 含修饰的残基的那些，以及非天然存在的氨基酸多聚体。术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，此外还指在功能上与天然存在的氨 基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些， 以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类 似物指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，例如与氢结合成键的α碳、 羧基、氨基、R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物可 以具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸一般化学结构不同的结构的化合物，但其功 能与天然存在的氨基酸类似。本文的氨基酸可以通过它们公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委 员会推荐的单字母符号被提及。同样地，核苷酸可以通过它们公认的单字母代码被提及。“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，保守 性修饰的变体指那些编码一致的或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或者如果核酸不编码 氨基酸序列，指基本上一致的或关联的，例如天然连续的序列。由于遗传密码的简并性，大 量的功能上一致的核酸编码大多数蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸 丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每一个位置，密码子可以被改变为另一个对应的所 述密码子，而被不改变被编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是一种保守性修饰的 变异。本文每一个编码多肽的核酸序列还描述了核酸的沉默变异。本领域的技术人员会认 识到，在特定背景下，核酸(除了 AUG，其通常是唯一的用于甲硫氨酸的密码子；以及TGG，其 通常是唯一的用于色氨酸的密码子)中的每个密码子都能够被修饰，以产生功能相同的分 子。因此，对于表达产物，而不是对于实际的探针序列，隐含了编码多肽的核酸的经常性沉 默变异。对于氨基酸序列，本领域的技术人员会认识到，对改变、添加或删除单个氨基酸或 编码序列中的小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别置换、删除或添加是“保 守性修饰的变体”，其中的改变产生了用化学上相似的氨基酸对氨基酸取代。诸如BLOSUM 的保守取代表和取代矩阵提供了功能上相似的氨基酸，这是为本领域所熟知的。这种保守 性修饰的变体还包括并不排除本发明中的多态变异体、种间同系物和等位基因。典型的相 互间保守取代包括1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺 (N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)， 缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8) 半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton, Proteins (1984))。I.简介本发明涉及以高亲和力结合到来自铜绿假单胞菌的PcrV抗原的抗体，并且通常 是III型分泌系统的功能性拮抗剂。该抗体包含与人种系Vh和\序列具有高度同源性 的可变区。重和轻链的⑶R3序列包含一对来自单克隆抗-PcrV抗体Mabl66的结合特异 性决定簇(BSD) (Frank et al.，J. Infectious Dis. 186 :64_73，2002 ；and U. S. Patent No6, 827，935)，并且本发明的抗体与Mab 166竞争对PcrV蛋白上的中和表位的结合(参见 例如 U. S. Patent No. 6，827，935)。⑶RH3中的BSD序列具有氨基酸序列NRGDIYYDFTY。在某些实施方案中，本发明的 抗体具有重链⑶R3序列NRGDIYYDFTYA (M/F) DX，其中的X是I、S或Q。⑶RL3中的BSD是FWXTP (其中X可以是S或G)。完整的V区通过如下方式产生 在其中，BSD形成部分⑶R3，另外的序列用于完成⑶R3和添加FR4序列。通常，⑶R3除BSD 之外的部分和整个FR4由人种系序列组成。在优选的实施方案中，除BSD之外的⑶R3-FR4 序列与人种系序列的区别在每条链上不超过2个氨基酸。人种系V节段的集合由51个重链V节段、40 κ轻链V节段和31 λ轻链V节段组 成，产生共计3，621个种系V区对。另外还有针对这些V节段的大多数的稳定等位变异体，
15但这些变异体对种系集合的结构多样性的贡献是有限的。所有人种系V节段基因的序列都 是已知的，并可以在由英国剑桥蛋白质工程中心(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom)(还参见 Chothia et al,1992, JMol Biol227 :776_798 ； Tomlinson et al，1995，EMBO J 14 4628-4638 ；Cook et al (1995)Immunol. Today 16: 237-242and Williams et al, 1996, J Mol Biol 264 :220_232)提供的基于V的数据库或国 际免疫遗传学数据库(the international ImMunoGeneTics database, IMGT)中获取。这 些序列可用作本发明抗体的人种系节段的参照来源。本文所描述的抗体或抗体片段能够在原核或真核微生物系统中、或者在诸如哺乳 动物细胞的更高级的真核生物细胞中表达。本发明中所用的抗体可以是任何形式。例如，在某些实施方案中，该抗体可以是 包含恒定区，例如人的恒定区的完整抗体，或者可以是完整抗体的片段或衍生物，例如Fab， Fab'，F (ab ‘ ) 2，scFv, Fv,或者是单域抗体，例如纳米抗体或骆驼科动物抗体。II.重链本发明的抗-PcrV抗体的重链包含具有下列元件的重链V区1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人重链V节段序列2)包含氨基酸序列NRGDIYYDFTY的CDRH3区3)由人种系J基因节段提供的FR4。图1中显示了支持结合到PcrV的V节段序列及前面所述的⑶R3-FR4节段及互 补的\区的实例。该V节段可以来自人的VHl或VH3亚类。在某些实施方案中，该V节段 是与种系节段VH3-30. 3具有高度氨基酸序列一致性的人Vh3亚类节段。例如该V节段与 VH3-30. 3的区别不超过15个残基，以及优选地不超过7个残基。本发明的抗体的FR4序列由人的J节段提供。6个重链JH区编号为1-6。由此， 该FR4序列可以由JH1，JH2，JH3，JH4，JH5或JH6基因片段提供。通常地，本发明的抗体 的FR4区与提供FR4的人种系J片段的FR4区具有至少90 %，通常至少91 %，92 %，93 %， 94%,95% 96%，97%，98%，99%或 100%的一致性。在某些实施方案中，该FR4序列由人种系JH3节段提供，并具有序列WGQGTMVTVSS。 在其他的实施方案中，该FR4由人种系JH6节段提供，并具有序列WGQGTTVTVSS。⑶RH3还包含来自人的J节段的序列。通常地，除去BSD的⑶RH3-FR4序列人种 系J节段的区别不超过2个氨基酸。在典型的实施方案中，CDRH3中的J节段序列来自用 于FR4序列的同样的J节段。由此，在某些实施方案中，该CDRH3-FR4区包含BSD和完整的 人JH3种系基因片段。CDRH3和FR4序列的示例性组合如下所示，其中BSD用粗体、人种系 J片段残基用下划线表示。CDR3NRGDIYYDFTYAFDIffGQGTMVTVSS (FR4 = JH3)NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS (FR4 = JH3)NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTTVTVSS (FR4 = JH6)在某些实施方案中，本发明的抗体包含与种系节段VH330. 3或与种系VH1-18节段 具有至少 90% —致性，或至少 91%，92% 93%，94%，95%，965，97%，98%，99%或 100% — 致性的V节段，或者与图1所示的的一个V节段，诸如SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，26，27，29和35的V节段部分具有上述一致性在某些实施方案中，VH区的V节段具有如图1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 发明的抗体可以具有包含序列TAGMH、SYGIH、SYGMH、SYPLH或NYPMH的CDRl ；或包含序列 VIffYNGKEISYADSVKG,FISYDGSEKYYASSVKG 或 VISYDGSEKWYADSVKG 的 CDR2。在某些实施方案 中，VH区的CDR2具有带负电荷的氨基酸，该氨基酸位于CDR2的大致中间，例如第8或9位。在特定的实施方案中，抗体具有来自图1所示的节段的一个的CDRl 和 CDR2，以及包含 NRGDIYYDFTY 的 CDR3 如 NRGDIYYDFTYAFDI 或 NRGDIYYDFTYAMDI。由 此，本发明的抗-PcrV抗体可以例如，具有包含序列NRGDIYYDFTYAFDIWGQGTMVTVSS， NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS 或 NRGDIYYDFTYAMDIWGQGTTVTVSS 的 CDR3-FR4。在其他的实 施方案中，该抗体可以包含具有序列NRGDIYYDFTYA(M/F)D(Q/S)的⑶R3。III.轻链本发明的抗-PcrV抗体的轻链包含具有下列元件的轻链V区1)包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人轻链V节段序列2)包含序列FWXTP (其中X可以是S或G)的⑶RL3区3)由人种系J基因节段提供的FR4。八区包含V λ或VK V节段。图2中提供了支持结合的V λ和VK序列及互补的 Vh区的实例。Vk节段在人种系JK2节段的上游被克隆，V λ片段在种系JL2节段的上游被克隆。⑶RL3序列包含衍生自V节段和J节段的序列。在典型的实施方案中，⑶RL3中的 J节段序列来自用于FR4的同样的J节段。由此，与人κ种系V节段和J节段序列的差异 可以不超过2个氨基酸。在某些实施方案中，该⑶RL3-FR4区包含BSD和完整的人JK2种 系基因节段。用于κ链的示例性CDRL3-FR4组合如下所示，其中BSD用粗体、JK2序列用 下划线表示。CDR3QQFffSTPYTFGQGTKLEIK (JK2)QHFffGTPYTFGQGTKLEIK (JK2)用于λ链的优选的⑶R3-FR4如下所示，其中BSD用粗体、JL2序列用下划线表示。CDR3QHFffSTPYTFGGGTKLTVL (JL2)本发明的抗体的FR4序列由人的J节段提供。5个人Jk区节段标记为1_5，以及 4个JX区节段标记为1、2、3、7。由此，该FR4序列可以由这些种系序列中的任何一个提供。 通常地，本发明的抗体的FR4区与提供FR4的人种系J节段的FR4区具有至少90 %，通常至 少 91%，92%，93%，94%，95% 96%，97%，98%，99%或 100%的一致性。VK节段通常属于VKI或VKIII亚类。在某些实施方案中，该节段具有与人种系 VKI或VKIII亚类至少80%的序列一致性，例如与人种系VKI L12序列或与人种系VKIII L2或VKIII All序列至少80%的一致性。例如，Vk片段可以与VKI L12的区别不超过18 个残基，或与VKIII All或VKIII L2的区别不超过12个残基。在其他实施方案中，本发明 的抗体的八区V节段与人种系VKI L12或人种系VkIII L2序列或人种系VKIII All序列 或图 2 中所示的 Vl 区的 κ V 节段序列，例如 SEQ ID NOs. 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24或37的V节段序列，具有至少85 %的一致性，或至少90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %， 96%,97%,98%,99%^； 100% 的一致性。在某些实施方案中，八的V节段对应人种系V λ节段。因此，在某些实施方案中，V 节段与图2中的Vl区的V λ V节段，诸如SEQ IDNOs. 28，30，32或34的V节段序列具有至少 85 % 的一致性，或至少 90 %，91 %，92 %，93 %，94%，95 %，96 %，97 %，98 %，99 %或 100 %
的一致性。在某些实施方案中，八区的V节段具有如图2所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 发明的抗体可以具有 CDRl 序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRWVA、RASQGISTYLA 或 RASEGVDRffLA ；或 CDR2 序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。在其他的实 施方案中，该抗体可以具有CDRl序列QGDSLRSYYA、TGTSSDVGAYNYVS或TGTSSDYV ；或CDR2 序列 GKNNRPS、EVTKRPS 或 DVTNRPS。在特定的实施方案中，本发明的抗-PcrV抗体可以具有组合显示在图2中所示的 Vl区的一个V节段的⑶Rl和⑶R2，以及包含FWXTP的⑶R3序列，其中X为S或G，例如 CDR3可以是QQFWSTPYT、QHFffGTPYT或QHFWSTPYT。在某些实施方案中，这种抗-PcrV抗体 可以包含FR4区，该FR4区是reQGTKLEIK或FGGGTKLTVL。因此本发明的抗-PcrV抗体可以 包含例如，来自图2所示的一个\区的⑶Rl和⑶R2，以及⑶R3-FR4区，该⑶R3-FR4区是 QFWSTPYTFGQGTKLEIK、QHFffGTPYTFGQGTKLEIK 或 QHFWSTPYTFGGGTKLTVL。IV. PcrV抗体的制备本发明的抗体可以包含SEQ ID NOs. 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，26， 27，29 或 35 的 Vh 区的任一个及 SEQ ID NOs. 2,4,6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，28，30，
32，34，36或37的Vl区的任一个。抗体可经测试，以确定该抗体保留拮抗III型分泌系统的活性。拮抗剂活性能够 利用多种指标确定，包括细胞毒性测定。示例性的测定在例如美国第6，827，935号专利中 被描述。被给予治疗铜绿假单胞菌感染的抗体优选地保留至少75%，优选地80%，90%， 95%或100%的Mabl66的III型分泌通路拮抗剂活性(美国第6，827，935号专利)。可以利用熟知的测定来鉴定高亲和力抗体，以确定结合活性和亲和力。这种技术 包括ELISA测定，以及利用表面等离子共振或干涉测量技术测定的结合测定。例如，亲和力 可以通过利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物传感器的生物膜层干涉测量技术测 定。本发明的抗体通常与Mabl66竞争对PcrV的结合。Mabl66结合到的PcrV的区已 经被识别(美国专利No. 6，827，935)。结合Mabl66的PcrV或其片段可被用于竞争性结合 测定。本文所描述的抗体阻断Mabl66或与Mabl66竞争对PcrV的结合的能力表明，该抗体 与Mabl66结合相同的表位，或结合到与Mabl66结合的表位接近的表位，例如与Mabl66结 合的表位交叠的表位。在其他的实施方案中，本文所述的抗体，例如表1中所示的包含Vh* 八区组合的抗体，可以被用作参照抗体，以评价是否有另一抗体竞争对PcrV的结合。在测试 抗体存在的情况下，如果参照抗体对抗原的结合减少至少30%，通常至少大约40%、50%、 60%或75%，以及经常至少约90%，则测试抗体被视为竞争性地抑制参照抗体的结合。在某些实施方案中，抗PcrV抗体不需要拮抗III型分泌序列。例如，结合到PcrV 的本发明的抗体能够募集免疫系统多种类型的细胞，以刺激巨噬细胞的吞噬作用、巨噬细胞或NK细胞的抗体导向性细胞毒性(ADCC)、补体级联的激活和/或中性粒细胞氧化爆发 的生成，从而导致细菌，例如铜绿假单胞菌的死亡。此外，所有的抗体可变区都能够催化来 自由活化的中性粒细胞提供的单态氧的氧化还原反应，导致直接损伤细菌的多种高效力的 氧化剂生成(参见例如 Wentworth et al. , Proc. Natl Acad. Sci USA 97 10930-10935, 2000)，包括臭氧，一种也能够刺激炎症应答的有效的抗菌剂(参见例如Babior et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100 :3031_3034，2003)。实际上，由补体激活和臭氧生成引起的 炎症具有募集免疫系统的其他成分，以进一步促进免疫的潜能。这种抗体通常具有50nM或 更低的亲和力，通常低于约ΙΟηΜ。与抗生素结合使用的非中和及中和抗PcrV抗体提供了强治疗效应。先前已经描述了带有与人种系序列接近的V区序列的抗体的分离方法(美国专利 申请20050255552和20060134098)。抗体库可以在适合的宿主细胞中表达，包括哺乳动物 细胞、酵母细胞或原核细胞。为了在某些细胞体系中表达，可以在N-末端引入信号肽，以将 分泌导向细胞外介质。有或无信号肽的抗体可以从诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞分 泌。在美国专利申请20070020685中描述了抗体片段从大肠杆菌的无信号分泌。为了生成PcrV-结合抗体，本发明的一个Vh区与本发明的一个八区结合，并 在适合的表达系统中以许多形式中的任一种表达。由此，该抗体可以表达为ScFV、Fab、 Fab'(包含免疫球蛋白铰链序列)、F(ab' )2(通过两个Fab'分子铰链序列间形成二硫键 结构而形成)、完整的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，或在原核或真核宿主细胞中，无论 是在宿主细胞内还是通过分泌方式，表达为融合蛋白。甲硫氨酸残基可以任选地存在于多 肽的N末端，所述多肽例如产生在无信号表达系统中的多肽。本文描述的每一个Vh区都可 以与每一个\区成对，以生成抗-PcrV抗体。例如VH3 1080-2F被从库中识别与两条不同 的 λ 轻链成对(1080-2F 和 1080-11Ε)。κ 链 1069-3F 被识别与 VH3 1069-3F 和 VH31100-3 成对。表1中展示了示例性的重链和轻链的组合。表1-示例性的抗体重链和轻链的组合 在许多实施方案中，本发明的抗体拮抗铜绿假单胞菌III型分泌系统，并通常显 示结合到PcrV的高亲和力。如果抗体的亲和力低于500或ΙΟΟηΜ，例如低于50nM或低于 25nM，或低于ΙΟηΜ，或低于InM，例如低于大约ΙΟΟρΜ，则抗体与抗原之间存在高亲和力。当 使用诸如ELISA、表面等离子共振测定或干涉测量技术被检测为Fabs时，本发明的抗体通 常具有50nM或更低，经常IOnM或更低的亲和力。在某些实施方案中，本发明的抗体在细胞毒性检测方面比Mabl66更有效。可以利用多种表达系统，包括原核的和真核的表达系统来生产抗体。许多这种系 统可以从供应商处广泛获取。在抗体包含Vh和\区两者的实施方案中，该Vh和\区可以 利用单一载体来表达，例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子控制下。在其他的实施 方案中，该区可以利用分别的载体来表达。本发明的抗体可以在N末端具有或不具 有甲硫氨酸的情况下被表达。因此，本文所描述的Vh或\区可以在N末端任选地包含甲硫 氨酸。本发明的抗体可以通过多种形式来生产，包括作为Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv或 dAB。本发明的抗体还能够包括人的恒定区。轻链的恒定区可以是人的κ或λ恒定区。重 链恒定区通常是 链恒定区，例如Y-l、Y-2, γ-3或Y-4恒定区。在其他的实施方案
20中，该抗体可以是IgA。在某些实施方案中，抗体给予人时是“非免疫原性”的。本文所使用的术语“非免 疫原性”指当给予人时，本发明的PcrV抗体不激发针对抗-PcrV抗体的抗体生成。可以利 用已知的检测方法测定抗体的免疫原性，例如实施例5中所描述的电化学发光免疫测定。 这种测定检测存在于患者体内，例如来自患者血清样本的抗体水平，该抗体与给予患者的 抗-PcrV抗体发生反应。当样本中不存在针对抗-PcrV抗体的可检测的抗体时，例如通过与 来自没有给予该抗体的个体的对照样本相比较，测定被视为表明该抗体是非免疫原性的。V.抗体的聚乙二醇化在某些实施方案中，例如其中抗体是片段，该抗体能够被结合到另一分子，例如聚 乙二醇(聚乙二醇化)或血清蛋白，以在体内提供延长的半衰期。抗体片段聚乙二醇化的实 例在Knight et al. Plateletsl5 :409，2004(用于阿昔单抗)；Pedley et al. ,Br. J. Cancer 70 :1126，1994(用于抗-CEA 抗体)；Chapman et al, Nature Biotech. 17 :780，1999 ；以及 Humphreys, et al.，Protein Eng. Des. 20 227,2007)中被提供。在某些实施方案中，本发明的抗体以Fab'片段的形式存在。全长轻链通过将八 区融合到人的κ或λ恒定区产生。任一恒定区可被用于任何轻链。然而，在典型的实施 方案中，κ恒定区与VK可变区联用，以及λ恒定区被用于与νλ可变区联用。Fab'的重链是Fd'片段，其是通过将本发明的Vh区融合到人重链恒定区序列，第 一恒定结构域(CHl)和铰链区产生的。该重链恒定区序列可以来自任何的免疫球蛋白类， 但通常来自IgG，以及可以来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本发明的Fab'抗体还可以是杂 种序列，例如铰链序列可以来自一个免疫球蛋白亚类，CHl结构可以来自不同的亚类。在优 选的实施方案中，包含CHl结构域和铰链序列的重链恒定区来自人的IgGl。Fab'分子可以是利用已知的方法聚乙二醇化的。重链的铰链区包含适合于结合 到聚乙二醇衍生物的半胱氨酸残基。该铰链序列可以是免疫球蛋白重链的完整的天然铰链 区，或可以是通过一个或多个氨基酸截短的。在某些实施方案中，该铰链区可以是被修饰的 或合成的序列。在进一步的实施方案中，该铰链是天然免疫球蛋白铰链序列，并包含两个半 胱氨酸残基。在某些实施方案中，Fab'分子能够通过位点特异性结合结合到甲氧基聚乙二醇 的马来酰亚胺衍生物(mPEG-mal)。该mPEG-mal能够具有例如介于10_40kD之间的平均分 子量。该PEG可以是分枝PEG或线性PEG。在某些实施方案中，该mPEG-mal是线性分子， 并且具有大约30kD的分子量。mPEG-mal的一个或多个分子结合到每个Fab'分子。该 mPEG分子经由mPEG-mal的马来酰亚胺部分和Fab‘重链铰链区中的一个或多个半胱氨酸 残基间的硫醚键连接，以形成聚乙二醇化的Fab'分子。在适合的缓冲剂中以及在适于硫醚 形成的条件下，利用本领域已知的用于马来酰亚胺衍生物结合到蛋白上的巯基的方法结合 mPEG-mal。Fab'可以以如下的形式从表达系统中生产，即该形式中的铰链半胱氨酸基团以 氧化形式存在。在这种情况下，该Fab'在结合之前可以经历还原的步骤。适合自由铰链 巯基生成的还原剂和铰链半胱氨酸选择性还原的方法为本领域所熟知，并包括二硫苏糖醇 (DTT)、β -巯基-乙醇、β -巯基-乙胺(MEA)和诸如三(2-羧乙基)磷化氢的非巯基还原 剂的使用。在某些实施方案中，还原在如下条件下实现，即铰链半胱氨酸被选择地还原，并且聚乙二醇化主要发生在铰链。通常，聚乙二醇化的Fab'包含由铰链上的两个半胱氨酸残 基聚乙二醇化产生的mPEG的两个分子。在某些实施方案中，突变可以引入铰链区，用于以 另一个氨基酸取代一个半胱氨酸残基。这种带有mPEG-mal的突变体的衍生导致单-聚乙 二醇化的Fab'生成。适合的铰链序列的实例是用于双-聚乙二醇化的天然的人Y-I铰链 THTCPPCPA用于单-聚乙二醇化的突变体铰链-1THTAPPCPA用于单-聚乙二醇化的突变体铰链-2THTCPPAPA聚乙二醇化的其他方法，例如其中PEG不被引入铰链，也是已知的。例如 Humphreys et al，在上，描述了通过破坏Fab重链和轻链之间的键间二硫键在铰链区外进 行半胱氨酸残基聚乙二醇化的方法。用于聚乙二醇化Fab'的纯化，以及包含更大数量PEG部分的期望的单或双聚乙 二醇化Fab'与未发生反应的mPEG-马来酰亚胺和Fab'分子的分离的方法为本领域所熟 知。这种方法包括，例如尺寸排阻或离子交换色谱法。VI.用于治疗铜绿假单胞菌感染的PcrV抗体的给药。本发明还提供了通过给予本发明的抗体来治疗已经感染了铜绿假单胞菌或正面 临感染铜绿假单胞菌风险的患者的方法。在某些实施方案中，这种患者患有囊性纤维化、 呼吸机相关性肺炎(VAP)、癌症相关性嗜中性粒细胞减少症或烧伤症状。本发明的方法包 含利用适于疾病治疗的给药方案、以治疗有效的量将PcrV抗体作为药物组合物给予感染 了铜绿假单胞菌的患者。该组合物可以被配制为用于多种药物递送系统。一种或多种生理 学上可接受的赋形剂或载体也可以包括在组合物中用于适当的制剂。适合用于本发明的制 齐[J在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿氏药物科学)，Mack Publishing Company,Philadelphia,PA, 17th ed. (1985)中可以找到。对于药物递送方法的简述，参见 Langer, Science 249 :1527_1533(1990)。PcrV抗体以适合注射入患者体内的溶液形式提供，例如用于注射的无菌等渗水溶 液。该抗体在可接受的载体中以适合的浓度被溶解或悬浮。在某些实施方案中，载体是水 性的，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等等。组合物可以包含接近生理条件所需的辅助性药 物物质，例如PH调节和缓冲剂、张力调节剂等等。本发明的药物组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾病的症状及其并发症 的量给予患者，例如感染铜绿假单胞菌的囊性纤维化患者。足以实现这一目的的量被定义 为“治疗有效剂量”。治疗有效剂量通过监测患者对治疗的反应来确定。指示治疗有效剂量 的一般基准包括患者体内感染症状的改善，或患者体内铜绿假单胞菌水平的降低。用于这 一用途的有效的量将取决于疾病的严重程度和患者的综合健康状况，包括诸如年龄、体重、 性别、给药途径等其他因素。抗体的单次或多次给药可以按照患者所需和耐受的剂量及频 率给予。在任一情形下，该方法提供了有效地治疗患者的足够量的PcrV抗体。抗体可以单独给予，或与其他治疗联合给予，以治疗铜绿假单胞菌感染。抗体可以通过经由包括但不限于静脉内、皮下、肌肉内或腹腔内途径的任何适合 途径的注射或输注给药。在某些实施方案中，该抗体可以通过喷射给予。在示例性的实施方 案中，抗体可以在4°C以10mg/ml储存在无菌等渗注射用盐水溶液中，并且在给予患者前，
22在IOOml或200ml 0. 9%的注射用氯化钠中稀释。在1小时的时程以0. 2-10mg/kg的剂量 通过静脉内输注的方式给予抗体。在其他的实施方案中，抗体通过静脉内输注的方式被给 予的时间段为15分钟-2小时。在其他的实施方案中，给药操作通过皮下弹丸注射。选择抗体的剂量以为患者提供有效的治疗，所述剂量为小于0. lmg/kg体重至 25mg/kg体重的范围，或为lmg-2g/患者的范围。优选地，该剂量为l_10mg/kg或大约 50mg-1000mg/患者的范围。该剂量可以以适当的频率重复，根据抗体的药代动力学(例如， 抗体在循环中的半衰期)和药效反应(例如，抗体疗效的持续时间)，该频率可以为每天一 次至每三个月一次。在某些实施方案中，在体内的半衰期为约7-约25天，以及在每周一次 至每三个月一次的范围内重复抗体给药。在其他的实施方案中，抗体以大约每月一次给药。在另外的实施方案中，抗体是聚乙二醇化的。例如，本发明的抗体可以利用诸如本 文所描述的方法聚乙二醇化，并给予感染铜绿假单胞菌的患者。本发明的Vh区和/或八区还可以用于诊断目的。例如，Vh区或八区可以用于临 床分析，例如检测来自已经感染铜绿假单胞菌或疑似感染铜绿假单胞菌患者的样本中的铜 绿假单胞菌。本发明的Vh区或\区还可以用于例如生产抗-Id抗体。
实施例实施例1-工禾旱化的人杭-PcrV Fab分子的鉴定。如美国专利申请20050255552中所描述的，产生表位聚集的工程化的人抗体Fab 库。衍生自人免疫球蛋白序列集合(r印ertoires)的V节段序列被克隆在每一重链和轻链 的选定的⑶R3-FR4序列的上游。对于重链集合，⑶RH3包含来自先前鉴定的抗-PcrV单克隆抗体(Mab 166 ；Frank et al 2002 J. Infectious Dis. 186 :64_73)的序列 D 节段衍生序列(NRGDIYYDFTY)，其构 成结合特异性决定簇。重链集合的完整⑶RH3-FR4序列的序列如下所示。对于VHl库1015，所用的CDR3-FR4组合是CDR3NRGDIYYDFTYAFDIffGQGTMVTVSS(FR4 = JH3)对于VH3库，所用的⑶R3-FR4组合的差异在于⑶RH3中的单个氨基酸CDR3NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS(FR4 = JH3)对于轻链集合，包含？1 1-0)虬1寸1 2-0)虬2寸1 3的人￥1^或νλ序列被插入选定 的⑶RL3-FR4序列的上游。该⑶RL3包含来自Mabl66轻链的结合特异性决定簇，具有序列 FWXTP (其中X可以是S或G)。对于V κ库，⑶RL3和FR4的C末端残基由人种系JK2序列 IIFGQGTKLEIK (⑶RL3中的JK2残基以下划线表示)构成。对于V λ库，FR4区由JL2种系 序列FGGGTKLTVL构成。JL2种系序列与JL3序列完全相同。在某些情况下，如美国专利申请20060134098所描述的，构建盒式文库(cassette libraries)(文库1070)。对于文库1080，全长λ链被筛选与VH盒式文库结合。重链和轻链多肽被表达为成熟的蛋白，即没有信号肽，并在大肠杆菌细胞中被分 泌，所述细胞表达如美国专利申请20070020685中所描述的突变SecY基因。因此，被表 达的该肽具有N末端甲硫氨酸。如美国专利申请20050255552中所描述的，重组Fabs与PcrV的结合通过利用包被有GST-PcrV融合蛋白标记物的硝化纤维素滤膜的滤膜结合试验 (filter-binding assay)来鉴定。结合活性通过利用包被GST-PcrV的板的抗原ELISA来 确认，以及亲和力通过利用ForteBio Octet生物传感器的生物膜层干涉测量技术来测定。示例性的高亲和力抗-PcrV抗体的V区的序列如图1和图2中所示。每个Fabs都具有对PcrV的高亲和力。通过利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物传感器的生物膜层干涉测量技术所确定的，几个Fabs被鉴定为具有至少与 Mabl66Fab相等(大约1. 4nM)的亲和力。上述鉴定的V1^P八区能够被用于各种组合。例如与包含SEQ IDN0. 11的Vh结合， 或与包含SEQ ID NO 3的Vh结合，Vk轻链SEQ IDNO 12支持对PcrV的高亲和力结合。1070-9E抗体是利用美国专利申请NO. 20060134098中所描述的方法由V区盒式交 换衍生的高亲和力抗体的实例。为了分离这一抗体，构建了 4个V区取代盒(!^placement cassette) :1)重链前端盒(由人VH3FR1-CDR1-FR2序列组成)，2)重链中间盒(由人 VH3FR2-CDR2-FR3序列组成)，1)轻链前端盒(由人VKIFRl-CDR1-FR2序列组成)，2)轻链 中间盒(由人的VK1FR2-⑶R2-FR3序列组成)。每一盒与另外来自Mab 166的V区序列和 选定的⑶R3-FR4区组装而成，并在大肠杆菌TOPlO细胞中表达为Fab片段，所述细胞用过 表达突变SecY基因的治疗转化以允许无信号Fabs的分泌。然后，在包被GST-PcrV滤膜上 筛选盒式Fab库，以鉴定PcrV结合物。然后，将从支持PcrV结合的Fabs选择的序列重组 和再次筛选，以鉴定支持对PcrV高亲和力结合的完全是人的V节段。通过盒式重组分离的Fab 1070-9E，对重组PcrV具有1. 48nM的亲和力，这可通过 生物膜层干涉测量技术测定。高亲和力抗-PcrV Fabs还是铜绿假单胞菌III型分泌系统有效的拮抗剂，并在基 于细胞的细胞毒性检测中抑制由铜绿假单胞菌株PA 103导致的铜绿假单胞菌外毒素介导 的P3-X63Ag8骨髓瘤细胞的杀伤作用。实施例2-聚乙二醇化的Fab丨在本实施例中，Fab'是聚乙二醇化的，该Fab'由以下组成=IgGl亚类的人Fd' 重链和人κ轻链，它们由涉及κ链的C末端半胱氨酸和重链的半胱氨酸残基C227(从成熟 蛋白的N末端连续编码)的链间二硫键连接。重组Fd'重链包含IgGlCHl结构域和包括2 个半胱氨酸残基的IgGl铰链区，该半胱氨酸残基还原后可用于结合到马来酰亚胺基团。因 此，表达的抗体蛋白是Fd'重链和κ轻链的二硫化物连接的异源二聚体，包含共计452个 氨基酸。示例性的Fd'恒定区序列如图3所示。为了生成体内清除比率降低的免疫结合物，从而得到改善的药代动力学谱，Fab' 被结合到聚乙二醇(PEG)。在双-聚乙二醇化的Fab ‘中，每个Fab ‘分子通过位点特异性 连接在铰链区结合到2个长链PEG分子，该位点特异性连接利用铰链半胱氨酸残基上2个 可用的反应巯基和马来酰亚胺衍生的PEG，即甲氧基-聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-mal)。该 mPEG-mal分子经由马来酰亚胺部分和铰链半胱氨酸残基间的硫醚键结合。为了生成双-聚乙二醇化的Fab'，从NOF公司获得平均分子量为30kD的 mPEG-mal。将从大肠杆菌表达和分泌的Fab ‘，在pH值为6. 5、含2mM EDTA的柠檬酸盐缓冲 液中制备为4mg/ml的浓度。在室温条件下加入还原剂(IOmM MEA，pH为6. 5) 30分钟，并利 用使用IOmM甘氨酸(pH 3)和2mM EDTA预平衡的Zeba脱盐柱将反应混合物立即脱盐。在室温条件下加入mPEG-mall小时，并利用购自GEHealthcare的Akta纯化系统上的HiTrap SP琼脂糖柱将双_聚乙二醇化的Fab'与其他聚乙二醇化的种类和与未反应的Fab'分离。图4中示意性提供了双-聚乙二醇化Fab'的结构。在本实施例中聚乙二醇化的 示例性双-聚乙二醇化Fab'以高亲和力结合到PcrV (通过表面等离子共振分析确定的 0. 6nM的亲和力)，并且是铜绿假单胞菌III型分泌系统有效的拮抗剂。单-聚乙二醇化的Fab'可以利用仅包含一个铰链半胱氨酸的Fab'的突变体衍 生物生成。突变铰链的序列是野生型人Y-I铰链 THTCPPCPA突变铰链-1THTAPPCPA突变铰链-2THTCPPAPA实施例3-用干检测具有针对铜绿假单胞,菌III型分泌系统的有效中和活性的抗体和Fab片段的细胞毒件测定建立了利用P3-X63-Ag8(X63)小鼠骨髓瘤细胞(ATCC)作为靶标的依赖TTSS的细 胞毒性测定。细胞被培养在含10% FBS(Hyclone)的RPMI 1640 (Media Tech)中。在Fab 存在下，在96孔板的孔中的0. Iml体积的培养基中，将约IO5细胞以感染复数(MOI)IO用铜 绿假单胞菌株PA103感染。在加入Fab和哺乳动物细胞之前，PA103被培养在MinS培养基 (Hauser AR et al. (1998) Infect Immun. 66. 1413-1420)中，以诱导 TTSS 的表达。在 5% C02、37°C下，与多种浓度的抗-PcrV Fab孵育3小时后，将细胞转移到12x75mm的流式细胞 用管中，并按照生产商的说明用碘化丙啶(Sigma)染色。透性化细胞的比例通过利用FACS Caliber流式细胞仪的流式细胞术定量。数据利用Prism4软件(Graphpad)进行分析。(细 胞毒性被标准化到未处理样本中的死亡细胞)。为了比较不同Fabs的效力，从至少三个独 立的测定中获得50%抑制所需的平均浓度(IC50)。几种示例性Fabs的结果如下面的表2 所示。表2. Fabs在细胞毒性测定中的效力 每一种检测的Fab都显示了 TTSS的强中和作用以及保护哺乳动物细胞免受细胞
毒性作用。在该测定中，几种Fabs比Mab 166Fab更为有效。因此，本发明的抗PcrV抗体一 般相对于Mab 166Fab显示出增强的效力。实施例4利用肺炎小鼠樽型的本发明抗体的体内作用。利用人工程化的Fabs进行在体实验，以评价抗体在肺炎小鼠模型中的作用。Fab 1A8具有人VH3亚类重链，包含人IgGl的第一恒定结构域，以及人VKI亚类κ轻链。通过 Biacore测定的Fab 1Α8的亲和力为0. 6nM。Fab 1Α8以比Mab 166Fab高大约2倍的亲和 力结合到PcrV。假单胞菌肺炎的急性致死模型被用于评价与Mab 166相比较的Fab 1A8的体内 功效。铜绿假单胞菌株PA103以1.5X106cm/鼠的剂量通过气管内给药直接滴注进小鼠 的肺部，这是先前所示的足够导致100%动物的死亡(3xLD9C1)的接种物(Sawa et al, Nat Med. 5 :392-8，1999)。监测存活率和体温48小时，并处死在这一时间点存活的小鼠，以测 定肺部内的细菌计数。存活数据(图5)表明，人Fab 1A8和鼠Fab能够防止由高细胞毒性 PA103菌株引起的死亡。用PA103感染的对照小鼠和用不相关的对照Fab治疗的小鼠在接 种后24小时内全部死亡。用10 μ g Mab 166或Fab 1A8对小鼠的治疗导致小鼠在48小 时100%的存活率。由于Fab 1A8缺少抗体Fc-区，因此抗体的效应器功能对于预防死亡 不是必需的。Fab 1A8在阻止死亡方面比Mabl66Fab明显更有效。Fab 1A8以1.25yg和 0. 625 μ g/小鼠的剂量提供了有效的保护，以防止死亡。以相同剂量的小鼠Mabl66Fab治疗 的动物显示出100%的死亡率(对于2. 5 μ g、l. 25 μ g和0. 625 μ g剂量的Fab 1A8和Mab 166Fab间的差异，P < 0. 05)。在防止死亡方面，Fab 1A8的活性可与Mab 166IgG相比。Fab 1A8在诱导恢复体温方面也是有效的，其表示防止败血症(图6)。未治疗 的感染PA103的小鼠在感染后的最初几小时内显示出体温迅速下降。在用抗体治疗的组 中，体温在12-24小时内的恢复与随后的存活相关。1.25 μ g/小鼠的低剂量的Fab 1A8或 Mab 166导致体温的迅速恢复，并能防止至少80%的小鼠死亡。然而，这一剂量的小鼠Mab 166Fab片段不足以使体温恢复，并且在这一组中的所有小鼠在感染后48小时全部死亡。还分析了感染后48小时存活小鼠的肺中残留假单胞菌的存在。值得注意的是， 被分析的Mab 166和Fab 1A8片段刺激了细菌的显著清除(图7)。48小时后，在用IOyg Fab 1A8治疗的所有小鼠中，细菌计数从1. 5xl06cm/小鼠的感染剂量减低至少1000倍。48 小时后，在用这一剂量Fab 1A8治疗的80%的小鼠肺部中没有显示出可检测的假单胞菌。 在用小鼠Mab 166Fab治疗的小鼠中，检测到更高的残留细菌计数。在这一分析中，人Fab 1A8具有可与完整IgG Mab 166相比的功效，其表明Fc效应器功能对抗体刺激细菌清除的 能力没有显著的贡献。还利用肺炎小鼠模型在体内评价了具有Mab 166最小的必需结合特异性决定簇 的另一人工程化Fab。通过气管内给药为雌性Balb/c小鼠(体重约20g ；Charles River)接种IxlO6的铜绿假单胞菌株PA103。在接种前，PA 103细菌于37°C下在YPT肉汤中生长过 夜，然后将其在新鲜培养基中以1 5稀释，后在37°C下生长2小时，直至它们达到指数生 长期。在室温下，将培养物以2000xg离心10分钟，并将沉淀重悬于SmL磷酸缓冲盐(PBS) 中。通过600nm处的吸光度对细菌进行定量，并通过胰蛋白酶大豆(TS)琼脂平板(Teknova， Half Moon Bay, CA)上的菌落生长来验证细菌菌落形成单位。将抗体Fab 2片段与细菌预 混合，随即进行气管内滴入。监测被感染小鼠48小时的体温(直肠温度)和存活。仅用盐水溶液治疗的对照小鼠在细菌接种24小时内显示出100%的死亡率。用 IOyg Fab 2治疗的小鼠显示出免于死亡的完全保护；用Fab治疗的小鼠在48小时100% 存活。因此，这一实施例说明本发明的人工程化的抗体展示出有效的抗铜绿假单胞菌的 体内活性。Fabs在体内比母株M166Fab更有效。实施例5-评估人工稈化的Fab在人体内的免疫原件。评估人工程化的抗体聚乙二醇化的Fab'片段在受试人体内的安全性、免疫原性 和血浆/血清半衰期。受试者通过静脉(i. v.)注射接受1、3或10mg/kg的一个剂量。人工程化的抗体在所有剂量水平都是良好耐受的。利用固定在微量滴定板上的 PcrV抗原通过ELISA来测量药物在血浆中的浓度。将GST-PcrV固定在微量滴定板上于4°C 过夜。洗涤板并加入封闭/稀释缓冲液封闭所有非吸附的位点至少60分钟。洗涤板后，将 分析物分配至预包被的微量滴定板上并孵育至少60分钟。洗涤板并加入含有对所述人工 程化的抗体特异的生物素化抗体的溶液至少45分钟。洗涤板，然后加入HRP-偶联的溶液 30分钟。经过最后的洗涤步骤后，加入四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物溶液并孵育约6 分钟。用磷酸溶液终止反应。产生的颜色与存在的聚乙二醇化Fab成比例。在利用两个滤 光片(450nm用于检测，背景用620nm)的读板仪上读板。在通过将光密度(OD)与浓度作图 获得的标准曲线上确定浓度。利用四参数逻辑斯特(logistic)拟合生成校准曲线。该方法 在人血清中的范围是血清中0. 200至12. 8ng/mL(100%血清中为20. 0ng/mL至1280ng/ mL) ο人工程化抗体在人受试者体内的药代动力学谱 该人工程化的抗体具有大约14天的终末血浆半衰期。在输注前和输注后8天、15天、29天、70天检测抗药物抗体，即针对人工程化抗 体生成的抗体的存在。利用电化学发光测定(ECLA)来测量抗药物抗体。用稀释缓冲液按 1 25稀释阳性对照和阴性对照血清。通过加入等体积的0.8%的醋酸按1 2进一步稀 释对照(产生2X溶液)，然后在环境温度下孵育大约15分钟。接着，利用Label Master Mix (0. 5 μ g/mL终工作浓度的抗体-生物素和抗体-SulfoTag)按1 2对样本进行再次稀 释，得到最终的1 100稀释度。然后通过轻摇在室温下孵育所有对照1小时。通过加入 稀释缓冲液封闭包被有链霉抗生素蛋白的标准MA240096孔微量滴定板60分钟。通过吸出 从板孔移除稀释缓冲液，然后将对照血清加到板上，孵育60分钟。吸出和洗涤板后，加入带 有表面活性剂的IX MesoScaleDiscovery (MSD)读数缓冲液Τ。于MSD电化学发光检 测器上在1分钟内读板。产生的相对光单位(RLU)的强度与存在的抗药物抗体量成比例。在任何时间点都没有检测到抗药物抗体。因此该实施例表明了人工程化的抗体在 人体中没有可检测的免疫原性。下面提供了本发明的抗-PcrV抗体V区的示例性列表示例性的抗-PcrV V区SEQ ID NO IVh (VHl)EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAISffVRQAPGQGLEffMGffISPYSGNPNYAQSLQGRVS LTTDRSTRTAYMELRSLKSDDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAFDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :2VkIDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGRAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT GFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :3VhQVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSTAGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :4VkI DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :5VhQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIffYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :6VkIAIQLTQSPSFLSASV⑶RVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :7VhQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNLKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :8VkIDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAffYQQKRGKAPKLLISAASSLQSGVPSRFSGSVSGT DFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :9VhQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO =IOVkIDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASALQSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO:IlVhEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSTAGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VFRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :12VkIDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :13VhQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :14Vk DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASALQSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :15VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGRNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :16VkIIIEIVLTQFPGTLSLSPGERATLSCRASQNVGSAYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRAPGIPDRFSGSGSG TDFTLTlNRLEPEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :17VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGYNKDYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :18VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :19VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :20VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLFYAASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :21VhEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVANIWYDGSSESYIDSVKGRFT VSRDDSRNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :22VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :23VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDQWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VK DIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :25VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDSWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :26VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :35VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDYWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :36VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffSTPYTFGQGTKLEIK具有λ轻链的示例性抗体的V-区SEQ ID NO :27VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID no :28V1
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDYVSWYQQHPGKAPKLIIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :29VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :30V1SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNT ASLTITGAQAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVL另外的Vl区SEQ ID NO :32V1SSELTQDPAVSVALGQTVTITCQ⑶SLRSLYASWYQQKPGQAPVLVLYSKNSRPSGIPDRFSGSSSGNT ASLTITGARAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :34V1QSVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQYPGKVPKLIIYEVTKRPSGVPDRFSGSKS GNTASLTVSGLRAEDEADYYCQHFWSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :37VkIDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffGTPYTFGQGTKLEIK出于清楚理解的目的，尽管已经通过说明和举例在一些细节上描述了前述发明， 但结合本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明作出某些变化和修 饰而不偏离所附权利要求书的精神或范围。本说明书引用的所有出版物、目录号、专利和专利申请都通过引用的方式并入本 文，如同各自被特别和单独地指明通过引用的方式并入一样。
权利要求
包含VL区的抗 PcrV抗体，所述VL区包含含有FWGTP的CDR3，其中所述抗 PcrV抗体选择性地结合PcrV。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含Vh区，所述具有包含序列 NRGDIYYDFTY 的 CDR3。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述\区节段与人种系V节段具有至少80%的一 致性。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述\区包含FR4，所述FR4与人种系JK1、JK 2、 J K 3、J κ 4或J κ 5节段的FR4区具有至少90%的一致性，或者与人种系J λ 1、J λ 2、J λ 3 或JX 7节段的FR4区具有至少90%的一致性。
5.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述\区包含FR4和V节段，所述FR4 与人JK2种系基因片段的FR4区具有至少90%的一致性，或与JL2种系序列具有至少90% 的一致性；以及所述V节段与人种系Vk I或VK III序列具有至少80%的一致性，或与人 种系V λ序列具有至少80%的一致性。
6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中\区CDR3具有序列Q(Q/H)FWGTPYT。
7.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其还包含Vh区，所述Vh区包含具有序列NRGDIYYDFTY的⑶R3、FR4和V节段，其中所述FR4包含 与人JH3或人JH6节段的FR4区至少90 %的一致性，以及所述V节段包含与人VH1-18亚类 V节段或与人VH3-30. 3V节段至少80%的一致性。
8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述Vh区包含具有序列 NRGDIYYDFTYA(M/F)DX1 的 CDR3，其中 X1 是 I、Q、Y 或 S。
9.结合PcrV的抗-PcrV抗体，其包含vH区，所述vH区包含具有序列Nrgdiyydftyamdx1的cdr3、fr4和ν节段，其中X1是I、 Q、Y或S ；其中所述FR4包含与人种系JH3节段的FR4区或人种系JH6节段的FR4区至少 90%的一致性，以及所述V节段包含与人种系VH1-18亚类V节段或与人种系VH3-30. 3亚 类V节段至少80%的一致性，条件是当X1是Y时，FR4区不是WGQGTSVTVSS。
10.结合PcrV的抗-PcrV抗体，其包含vH区，所述vH区包含具有序列Nrgdiyydftyamdx1的cdr3、fr4和ν节段，其中X1是I、 Q、Y或S ；其中所述FR4包含与人种系JH3节段的FR4区或人种系JH6节段的FR4区至少 90 %的一致性，以及所述V节段包含与人种系VH1-18亚类V节段或与人种系VH3-30. 3亚 类V节段至少80%的一致性，条件是当X1是Y时，FR4区不是WGQGTSVTVSS ；Vl区，所述Vl区包含含有FW(S/G) TP的CDR3、FR4和V节段，其中所述FR4包含与人种 系JK2基因节段的FR4区或与人种系JL2节段的FR4区至少90%的一致性，以及所述V节 段包含与人种系VKIL12序列至少80%的一致性，或与Vk III序列至少80%的一致性，或 与人种系V λ 22c或V λ 331节段至少80 %的一致性。
11.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述Vh区的FR4具有序列 WGQGTX2VTVSS，其中 X2 是 T 或 M。
12.如权利要求9-11中任一项所述的抗体，其中轻链CDR3具有序列Q(H/Q)FW(G/S) TPYT。
13.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述\区的FR4具有序列TOQGTKLEIK或 FGGGTKLTVL。
14.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中Vh区V节段与人种系VH3-30.3节段具 有至少80%的一致性，以及重链区⑶Rl包含序列X3X4X5X6H,其中X3是S、T或N，X4是Y或 A，X5 是 A、G 或 P，且 X6 是 Μ、I 或 L ；以及重链区 CDR2 包含序列 X7IX8YX9GX10X11X12X13Y (A/I) X14SVKG,其中 X7 是 V、F 或 N，X8 是 S 或 W，X9 是 D 或 N，Xltl 是 S、K、R 或 Y，X11 是 N、S、D 或 E， X12 是 K、I 或 E，X13 是 Y、S、D 或 W，且 X14 是 D 或 S。
15.如权利要求14所述的抗体，其中所述Vh区V节段与VH3-30.3V节段具有至少90 % 的一致性。
16.如权利要求14或权利要求15所述的抗体，其中所述⑶Rl是TAGMH、SYGIH、 SYGMH、SYPLH 或 NYPMH ；或者所述 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、 VISYDGSEKWYADSVKG, VIffYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。
17.如权利要求14或权利要求15所述的抗体，其中所述⑶Rl是TAGMH、SYGIH、 SYGMH、SYPLH 或 NYPMH，以及所述 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、 VISYDGSEKWYADSVKG, VIffYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。
18.如权利要求1-13中任一项所述的抗体，其中Vh区V节段与人种系VH1-18 亚类V节段具有至少80 %的一致性，以及⑶Rl具有序列DHAIS和⑶R2具有序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo
19.如权利要求18所述的抗体，其中所述Vh区V节段与人种系VH1-18亚类V节段具 有至少90%的一致性。
20.结合PcrV的抗-PcrV抗体，其包含Vh区，所述Vh区具有CDR3序列NRGDIYYDFTYAFDI、CDRl序列DHAIS和CDR2序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo
21.如权利要求20所述的抗体，其中所述Vh区的V节段包含与人种系VH1-18亚类V 节段至少80%的一致性。
22.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述Vh区包含选自SEQID NOs 1、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列的 V 节段区。
23.如权利要求22所述的抗体，其中所述Vh区包含选自SEQIDNOs 1、3、5、7、9、11、13、 15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列。
24.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述\区V节段包含与人种系Vκ I L12或Vk III序列至少90%的一致性，或与人种系V λ 331或与V λ 22c序列至少90%的一 致性。
25.如前述权利要求1-20中任一项所述的抗体，其中所述八区V节段与人种系VKIL12 节段具有至少80%的氨基酸序列一致性，以及CDRl具有序列RASX15X16X17X18X19X2tlX21A,其中 X15是Q或E，X16是S或G，X17是I或V，X18是S或D，X19是S、R或T，X2tl是W或Y，且X21是 L或V ；以及CDR2具有序列X21ASX22LX23S,其中X21是D或A，X22是S、A或T，且X23是E、Q或 K0
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述八区V节段与人种系VKIL12节段具有至少 90%的一致性。
27.如权利要求25或权利要求26所述的抗体，其中所述⑶Rl具有序列RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；或者所述 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、 AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。
28.如权利要求25、26或27中任一项所述的抗体，其中所述CDRl具有序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；以及所述 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS, AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。
29.如前述权利要求1-23中任一项所述的抗体，其中所述\区V节段与人种系 VKIII L2序列具有至少80%的氨基酸序列一致性，且所述⑶Rl具有序列RASNSVGAYNLA或 RASQSVSSNLA ；以及所述 CDR2 具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。
30.如权利要求29所述的抗体，其中所述&区V节段与人种系VKIIIL2节段具有至 少90%的一致性。
31.如前述权利要求1-23中任一项所述的抗体，其中所述八区V节段与人种系Vλ 331 节段具有至少80%的氨基酸序列一致性，且所述⑶Rl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS ；以及所 述 CDR2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。
32.如权利要求31所述的抗体，其中所述\区V节段与人种系Vλ 331节段具有至少 90%的一致性。
33.如前述权利要求1-23中任一项所述的抗体，其中所述\区V节段与人种系Vλ 22c 节段具有至少80%的氨基酸序列一致性，且⑶Rl具有序列TGTSSDVGAYNYVS或TGTSSDYVS ； 以及 CDR2 具有序列(E/D) VT (K/N) RPS。
34.如权利要求33中所述的抗体，其中所述\区V节段与人种系Vλ 22c节段具有至 少90%的一致性。
35.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述\区包含选自SEQID NOs 2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列的 V 节段。
36.如权利要求35所述的抗体，其中所述Vl区包含选自SEQIDNO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列。
37.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是铜绿假单胞菌III型分泌 系统的拮抗剂。
38.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab'片段。
39.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG。
40.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是聚乙二醇化的。
41.如权利要求40所述的抗体，其中所述抗体是双-聚乙二醇化的。
42.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中Vh区或\区，或者Vh和\区二者的氨 基酸序列在N末端包含甲硫氨酸。
43.抗-PcrV抗体，其是III型分泌系统的拮抗剂，所述抗-PcrV抗体包含具有选自 SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列的 Vh 区； 以及具有选自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36和 37 的氨 基酸序列的八区。
44.如权利要求43所述的抗体，其中Vh区或\区，或者Vh和\区二者具有存在于N 末端的甲硫氨酸。
45.如权利要求43所述的抗体，其中所述抗体是双-聚乙二醇化的Fab'。
46.治疗感染铜绿假单胞菌的患者的方法，所述方法包含给予前述权利要求中任一项 所述的抗体。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗体在人体内不是免疫原性的。
48.如权利要求46所述的方法，其中通过静脉内、皮下或通过吹入法给予所述抗体。
全文摘要
本发明提供了针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PcrV蛋白的高亲和力抗体，其被给予以治疗铜绿假单胞菌感染时具有降低的免疫原性。
文档编号C07K16/12GK101910197SQ200880124705
公开日2010年12月8日 申请日期2008年12月1日 优先权日2007年11月30日
发明者克里斯托弗·R·贝炳东, 杰弗里·T·亚兰东, 肯尼思·鲁尔森, 马克·百尔 申请人:卡罗拜奥斯制药公司