专利名称：用于治疗疾病的甘露糖结合凝集素融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及各种疾病和感染的治疗。更具体而言，本发明涉及包含甘露糖结合凝 集素多肽序列的融合蛋白。所述融合蛋白可以被用在用于治疗传染病、癌症、免疫相关病症 和其它病患的药物组合物中。
背景技术：
甘露糖结合凝集素(MBL)也称为甘露糖结合蛋白(MBP)，是钙依赖性血清蛋白，它 通过与广泛的病原体(病毒、细菌、真菌、原生动物)的表面上的糖结合而在天然免疫响应 中起作用，其在病原体表面可以激活补体系统。甘露糖结合凝集素是于肝脏中制备的蛋白胶原凝集素家族的一员。胶原凝集素 (collectin)由于其具有胶原蛋白样区和凝集素(lectin)区而得名。凝集素是与通常处 于细菌表面的糖结合的蛋白。胶原蛋白区与天然免疫系统的效应子部分相互作用。人类染 色体10上的MBL2基因产生MBL，MBL是由3个相同多肽链组成的、包含N端半胱氨酸富集 区、胶原蛋白样区、颈区和糖识别区(CRD)的248氨基酸蛋白亚基的寡聚物。3个MBL多肽 链组装成可见于体内的生物活性三聚体。当血清MBL与微生物体表面上的糖相互作用时，其形成补体激活的凝集素途径的 病原体识别组分。MBL与含有重复甘露糖或N-乙酰基葡萄糖胺残基的表面阵列结合。其作 为与一个或多个MBP相关丝氨酸蛋白酶(MASP)的复合物循环，所述丝氨酸蛋白酶在所述复 合物与合适的表面结合时自动激活。MBP的表面识别功能由3个通过α螺旋的卷曲螺旋而保持在一起的C型糖识别 域(CRD)的簇介导。N端部分胶原蛋白样域由Gly-X-Y三联体组成，并具有在域中形成转 角(bend)的单个中断(interruption)。短N端域含有数个形成链间二硫键的半胱氨酸残 基。血清MBL组装为在啮齿类中含有2 4个三聚体亚基、在人类中多达6个亚基的更大 形式。指定为MBP-A的大鼠血清MBP的所有三种寡聚形式都能固定补体，但更大的寡聚物 具有更高的特异性活性。许多物种表达第二种形式的MBP。在大鼠中，第二形式MBP-C见于 肝脏中。MBP-C不会形成超出含三个多肽的简单亚基以外的更高级寡聚物。对大鼠MBP-A 与MBP-C的嵌合物的分析表明，胶原蛋白样域含有MASP结合位点。MBL作为治疗剂已被研究了数年。例如，曾考虑将MBL作为对用肿瘤坏死因子 (TNF)抑制剂治疗而造成吞噬细胞功能受损的个体的感染的治疗(参见W002/05833)。MBL 以其天然形式使用以便允许通过MBLCRD区与感染物的结合的感染清除和后续清除，由此 补偿用TNF抑制剂治疗的患者亚组中的吞噬细胞功能的缺乏。也曾考虑将MBL用在带有TNF 超家族配体的用作疫苗佐剂的融合蛋白中(参见US 7，300，744)。如MBL等胶原凝集素的
4前述用途使得能够产生三聚体的基于TNF的分子家族(例如CD40L)，其激活树突状细胞和 T细胞以引发免疫响应。对于佐剂性质而言，理想的是较高等级的如以上应用中所述的多聚 化。因此，这些方法提供了可以激活天然和适应性免疫功能从而提供抗体响应的分子。然 而，这些方法并非设计来启动补体激活。事实上，补体激活对于疫苗效果将是有害的，这是 因为其将导致杀死已与MBL融合蛋白结合的期望免疫细胞。在本申请中，将MBP用来介导 补体激活，然而对免疫响应和抗体生成的引发是极不理想的。因此，本发明人已确定了本领域中对提供治疗感染、癌症和其它激活补体的病症 的方法的需要。
发明内容
在一方面，本发明提供了包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，第一多肽包含具 有效应子功能的甘露糖结合凝集素(MBL)多肽，而第二多肽包含与细胞表面或病毒结合的 靶向序列，其中第一多肽不包含活性MBL C型凝集素样域(CLTD)。第二多肽的靶向序列与 选自肿瘤细胞、免疫细胞、细菌细胞、原生动物、真菌和受病毒感染的细胞的细胞的表面上 的靶标部分结合。所示靶标部分可以包含与特定细胞相关的糖、脂质或氨基酸序列中的任 何一种或组合。靶向序列可以包含凝集素，包括C型凝集素域(CTLD)。第一多肽包含允许 效应子功能(例如，诱导哺乳动物补体系统)的序列。在一方面，本发明提供了激活哺乳动物补体系统的方法，所述方法包括对哺乳动 物施用包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白第一多肽包含具有效应子功能的甘露糖结合 凝集素(MBL)多肽，而第二多肽包含与细胞表面或病毒结合的靶向序列，其中第一多肽不 包含活性MBL C型凝集素样域(CLTD)。在一方面，本发明提供了包含本发明的融合蛋白和可药用赋形剂的药物组合物。 本发明的药物组合物还可以包含至少一种其它治疗剂，例如，化学治疗剂和/或靶标治疗 剂，如抗体、激酶抑制剂或癌疫苗。在另一方面，本发明提供了治疗病原性疾病的方法，所述方法包括对罹患所述疾 病的患者施用有效量的本发明的融合蛋白或其药物组合物，其中靶向序列与病原体的细胞 表面标记或受病毒感染的细胞上的标记结合。在另一方面，本发明提供了治疗与肿瘤细胞相关的增殖性疾病的方法，所述方法 包括对需要所述治疗的患者施用有效量的本发明的融合蛋白或其药物组合物，其中靶向序 列与肿瘤细胞表面上(例如，癌细胞表面上)的标记结合。在其他方面，本发明涉及包含编码本发明的融合蛋白的序列的分离核酸、包含所 述核酸的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞、以及用于制备包含所述核酸、载体和宿 主细胞的本发明的融合蛋白的方法。通过本发明的以下详细描述，本发明的其它方面将对本领域技术人员显而易见。
图1描绘了全长人类MBP(SEQ ID NO :38)和一般性结构区(信号肽区、多聚区、胶 原蛋白样区、卷曲螺旋区和C型凝集素区)的多肽序列。据认为斜体和下划线的氨基酸包 含MBP的与丝氨酸蛋白酶(MASP)相干的结合区。
图2 展示了对来自人类(SEQ ID NO 39)、大鼠(MBP-A 为 SEQ ID NO 40 ；MBP-C % SEQ ID NO 41)、小鼠(MBP-A 为 SEQ ID NO 42 ；MBP-C 为 SEQ ID NO 43)和猴(SEQ ID NO 43)的各种MBP序列的比对。残基“0”代表羟基脯氨酸；星号(*)是指在整个MBP和纤维胶 凝蛋白(ficolin)中保留的氨基酸残基。粗体的下划线氨基酸残基经鉴定为在MBP与MBP 相关丝氨酸蛋白酶(MASP)的相互作用中较重要(参见，Wallis等，J.Biol. Chem.，279(14) 14065-073(2004))。人MBP的MASP结合区的功能性变异体的一个实施方式如SEQ ID NO: 45中所定义。图3显示了与固定Ley HAS结合的经标记的MBP/DC-SIGN CTLD融合但不的ELISA 结合分析。㈧转染后4日各种MBP/DC-SIGN构建体的结合活性。(B) DC-SIGN/Fc和MBP/ DC-SIGN(ACsC)的比较性结合，各自带有或不带各种竞争剂。(C)转染后4日对各种MBP/ DC-SIGN构建体的其它结合活性测试。图4显示了利用悬浮相ELISA的与SKBR-3细胞结合的MBP/DC-SIGN CTLD融合蛋 白的结合。(A)构建体Abs和ABsC展示出比正对照DC-SIGN/Fc更高的结合活性。(B)在 存在各种竞争剂和钙时的MBP/DC-SIGN ABs构建体对Ley的结合特异性。(C)与正对照和 负对照相比的MBP/DC-SIGN构建体Abs和ABsC与MCF-7细胞的ELISA。图 5 显示了 MBP/DC-Sign CTLD ABs 和-ABsC在 25mL 甘露聚糖-琼脂糖柱(Sigma) 上的洗脱曲线。图 6 显示了对分离的 MBP/DC-Sign CTLD-ABS (A)和 MBP/DC-Sign CTLD-AbsC(B) 衍生物的SDS-PAGE分析。凝胶中最左边的泳道是分子量标准尺寸梯带。图7显示了对通过甘露聚糖-琼脂糖亲和力纯化而分离的MBP/DC-SIGN CTLD Abs 的寡聚概况的蛋白印迹分析(非还原)。印迹显示绝大多数的纯化ABs构建体以较高级的 寡聚物存在。图 8 显示了 MBP/DC-SIGN CTLD ABs (■)和 DC-SIGN-Fc ( )与固定的 Lewis Y-HAS的ELISA结合结果。MBP的多聚域提供了相对于DC-SIGN-Fc分子增加的亲合力增益 (avidity gain)。图9显示了利用C4的MASP依赖性切割的通过MBP/DC-SIGN CTLD ABs对C4补体 激活的诱导。图 10 显示了细胞上的 MBP/DC-SIGN CTLD ABs (- -) -MASP 依赖性转化。图11显示了由MBP/DC-SIGN CTLD衍生物ABsC和-ABsCO或赫赛汀对 SKBR-3 (A)和 MCF-7 (B)细胞的抑制。图例菱形(_ _)MBP/DC_SIGN ；正方形(-■-) MBP-DC-SIGN-ABsC0+5y g/mL 赫赛汀；三角形(_ ▲ _)赫赛汀；“X”(-X_) TBSC 缓冲液；星号 (-*_)仅培养基。
具体实施例方式本发明通过构建一系列包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白来利用MBP的补体 固定(complement fixation)活性，所述第一多肽包含能诱导补体固定的甘露糖结合凝集 素(MBL)多肽，而所述第二多肽包含靶向与特定细胞类型和病原体相关的部分的序列。在 一方面，本发明提供了包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第一多肽包含甘露 糖结合凝集素多肽并且具有效应子功能，而第二多肽包含与所靶向部分结合的序列。
在另一方面，本发明针对通过对有需要的受试对象提供包括MBL的效应子功能 和引导融合蛋白进入所关注的细胞或其它病原体的靶向序列的融合蛋白而治疗疾病。一 旦与细胞或病原体相关联，MBL的效应子功能激活宿主的补体系统，由此启动调理素作用 (opsonization)并最终启动该细胞或病原体的吞噬作用。本发明的融合蛋白缺乏MBL糖识 别域或活性MBP C型凝集素样域，从而所述MBL融合蛋白虽然保留了效应子功能但是却没 有会与细胞表面上的甘露糖或其它寡糖结合的MBL序列。定义在进一步详细限定本发明之前，要先定义一些术语。除非在本文中对术语提供了 具体定义，否则本公开通篇中所用术语和短语应取自本领域内通常所理解的含义。此外，如 本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的指代物，除非上 下文中明确另外指出。如本文所用，“效应子功能”是指在哺乳动物中诱导不与抗体或T细胞响应相关的 免疫响应的能力。例如，甘露糖结合蛋白(MBP)的效应子功能激活补体系统，补体系统是共 同作用以攻击细胞外病原体的一组血浆蛋白。尽管补体系统的最重要的作用是调理素作 用(用吞噬细胞所识别的受体涂覆外来生物体)，它也募集炎性细胞并通过膜攻击复合物 直接杀伤病原体。在哺乳动物中，激活或“固定”补体通常是指MBP与血清蛋白C1、C2、C3、 C4、C5、C6、C7、C8和C9(总称为“补体”)结合，并由此刺激巨噬细胞与蛋白的结合并促进 随后由这些巨噬细胞的吞噬。“四连接素三聚域”是指源自如美国专利申请第2007/0154901号公报(‘901申请) (本文通过参考并入其全部内容)所述的四连接素(tetranectin)的三聚域(trimerizing domain) 0成熟人四连接素单链多肽序列在本文中作为SEQ ID N0:46提供。四连接素三聚 域的实例包括SEQ ID NO 46的17 49位、17 50位、17 51位和17 52位氨基酸， 它们代表由人四连接素基因的外显子2编码的氨基酸以及可选的由所述基因的外显子3编 码的前一个、前两个或前三个氨基酸。其它实例包括1 49位、1 50位、1 51位和1 52位氨基酸，它们代表外显子1和2的所有编码氨基酸以及可选的由所述基因的外显子3 所编码的前一个、前两个或前三个氨基酸。替代性地，在三聚域中仅包含由外显子1所编码 的氨基酸序列的一部分。特别地，三聚域的N端可以从SEQ ID NO 46的任何残基1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17处开始。在具体实施方式
中，N端为IlO或V17， 而碳端为 Q47、T48、V49、C(S)50、L51 或 K52(编号与 SEQ ID NO :46—致)。在本发明的一个方面，三聚域是具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列的四连接素三聚 结构单元(“TTSE”)，所述氨基酸序列是如US 2007/00154901所更全面描述的四连接素家 族三聚结构单元的共有序列。TTSE包括天然存在的四连接素蛋白家族的成员的变异体，特 别是在氨基酸序列中已得到修饰但没有在任何显著的程度上负面地影响TTSE形成α螺旋 卷曲螺旋三聚体的能力的变异体。在本发明的各个方面，本发明的三聚多肽包含作为三聚 域的TTSE，该TTSE三聚域具有至少66%的与SEQ ID NO :47的共有序列的氨基酸序列同一 性，例如，至少73%、至少80%、至少86%或至少92%的与SEQ ID NO 47的共有序列的氨 基酸序列同一性(仅计入限定(非X)的残基)。换言之，SEQ ID NO :47中至少一个、至少 两个、至少三个、至少四个或至少五个限定的氨基酸可以被取代。在一个具体实施方式
中，SEQ ID NO 46的50位(C50)处的半胱氨酸可以有利地
7被诱变为丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸或任何其它氨基酸残基以便避免形成不需要的可能导致 不必要多聚的链间二硫键。其它已知变异体包括选自第6、21、22、24、25、27、28、31、32、35、 39、41和42位氨基酸残基(编号与SEQ ID NO :46—致)的可被任何非螺旋破坏性氨基酸 残基取代的至少一个氨基酸残基。这些残基已据显示不会直接参与稳定三个天然四连接素 单体TTSE的三聚复合物的分子间相互作用。在一方面，TTSE具有式为a-b-C-d-e-f-g(N 至C)的重复七肽(h印tad)，其中残基a和d(即，26、33、37、40、44、47和51位)可以为任 何疏水性氨基酸(编号与SEQ ID NO 46 一致)。在其它实施方式中，可以通过引入多组氨酸序列和/或蛋白酶切割位点(例如，凝 血因子Xa或颗粒酶B(Granzyme B))(参见US 2006/0199251，本文通过参考将其并入)以 及通过加入C端KG或KGS序列来修饰TTSE三聚域。此外，为协助纯化，可以用甘氨酸取代 2位的脯氨酸以协助纯化。术语“C型凝集素样蛋白”和“C型凝集素”用于指代存在于任何真核物种中或在 其基因组中编码的任何蛋白，所述蛋白含有一个或多个CTLD或者一个或多个属于CTLD的 亚组的与糖配体结合的域(糖识别域(CRD))。该定义具体包括膜连接的C型凝集素样蛋白 和C型凝集素、缺乏功能性跨膜域的“可溶性”C型凝集素样蛋白和C型凝集素、其中在体内 已通过糖基化或任何其它合成后修饰而改变的一个或多个氨基酸残基的C型凝集素样蛋 白和C型凝集素、以及通过C型凝集素样蛋白和C型凝集素的化学修饰而获得的任何产物。CTLD由大致120个氨基酸残基组成，且特征在于含有两个或三个链内二硫 键。尽管CTLD与不同蛋白在氨基酸序列水平的相似性相对较低，但已发现多种CTLD的 三维结构是高度保留的，且结构变化性基本局限于通常由至多5个环限定的所谓环形区 (loop-region)。数种CTLD含有对钙的一个或两个结合位点，且大多数与钙相互作用的侧 链位于环形区内。基于三维结构信息可获取的CTLD，已推知典范CTLD在结构上的特征在于以β 1、 α 1、α 2、β 2、β 3、β 4和β 5的顺序依次出现的7个主要二级结构单元(即，5个β链和 两个α螺旋)。图2展示了 10种C型凝集素的已知三维结构的CTLD的比对。在三维结构 已得到确定的所有CTLD中，β链被安置为两个反平行β折叠，其中一个由β 和β5组 成，而另一个由β 2、β 3和β 4组成。一个额外β链β 0常常处于序列中的β 1前面，并 且在存在时形成将β 1、β 5折叠整合的额外链。此外，在迄今所表征的所有CTLD中不变 地发现了两个二硫键，其中一个连接α 和β 5 (CI-CIV)，而另一个连接β 3和连接β 4及 β 5的多肽片段(CII-CIII)。在CTLD三维结构中，三个保留二级结构单元对多个环(本文中统称为“环形 区”)形成伸出核心的紧密支架。在CTLD的一级结构中，这些环被组织为两个片段，环片 段A (LSA)和环片段B (LSB)。LSA代表常常缺乏常规二级结构并且含有多达4个环的连接 β 2禾Π β 3的长多肽片段。LSB代表连接β链β 3和β 4的多肽片段。LSA中的残基连同 β 4中的单个残基已据显示会指定数个CTLD (包括四连接素的CTLD)的Ca2+结合位点和配 体结合位点。例如，涉及一个或数个残基的取代的诱变研究已经显示，CTLD域可以适应结 合特异性、Ca2+敏感性和/或亲和力的变化。已知有多种CTLD，包括以下非限制性实例四 连接素、胰石蛋白(Iithostatin)、小鼠巨噬细胞半乳糖凝集素、Kupffer细胞受体、鸡神经 聚糖、perlucin、去唾液酸糖蛋白受体、软骨蛋白多糖核心蛋白、IgE Fc受体、胰腺炎相关蛋白、小鼠巨噬细胞受体、自然杀伤细胞组、肝细胞生长因子、因子IX/X结合蛋白、甘露糖结 合蛋白、牛共凝集素、牛CL43、胶原凝集素肝1、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、e-选择素、 被囊动物c型凝集素、CD94NK受体域、LY49A NK受体域、鸡肝凝集素、鳟鱼c型凝集素、HIV gp 120结合c型凝集素和树突状细胞免疫受体。参见US 2007/0275393，本文通过参考并 入其全部内容。 表达“有效量”是指本发明的融合蛋白与可有效预防、改善或治疗所关注的疾病或 病况的治疗剂中的一者或两者的量，不管是同时还是依次施用。在具体实施方式
中，有效量 是足以提高或增加(例如协同性地提高或增加)细胞进行凋亡的倾向性、减小肿瘤体积或 延长患有癌症或其它疾病的哺乳动物的存活的融合蛋白与治疗剂的组合的量。术语“癌症”、“癌性”和“恶性”指代或描述哺乳动物中通常特征为未经调节的细 胞生长的生理学状况。癌症的实例包括但不限于包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、 肉瘤和白血病的癌。这些癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌 (NSCLC)、胃肠道癌、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、 宫颈癌、卵巢癌、肝癌(如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内 膜癌、骨髓癌(例如多发性骨髓癌)、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞癌和Wilms肿瘤)、基底 细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌和各种类型的头颈癌。在本文中，术语“抗体”用于描述天然的或者部分或完全合成产生的免疫球蛋白。 由于抗体可以以多种方式修饰，应该认为术语“抗体”覆盖了具有结合域特异性的任何特 异性结合部件或物质。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、功能性等价物和抗体的同源物 (包括含有免疫球蛋白结合域的任何多肽)，不论其是天然的或者完全或部分合成的。因 此包括含有免疫球蛋白结合域或等价物的与另一多肽融合的嵌合分子。该术语还涵盖了 具有作为抗体结合域或与其同源的结合域的任何多肽或蛋白，例如，抗体模拟物。这些物 质可以源自天然来源，或者其可以部分或完全通过合成产生。抗体的实例是免疫球蛋白同 种型及其同种型亚类(isotypic subclass)；包含抗体结合域的片段，例如，Fab、Fab ‘、 F(ab' )2、scFv、Fv、dAb、Fd ；和双链抗体(diabody)。“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂， 例如噻替派和CYTOXAN 环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡； 氮丙啶，例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa ；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲 蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(尤其是 布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin ； CC-1065(包括其卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和 念珠藻环肽8)；多拉司他汀；duocarmycin (包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊 瑚醇；水鬼蕉碱；sarcodictyin ；spongistatin ；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰 胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化二氯甲基二乙胺、美法仑、新恩比兴、 苯芥胆留醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺和尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀，氯脲霉素，福莫司 汀，洛莫司汀，嘧啶亚硝脲和雷莫司汀；抗生素，例如，烯二炔抗生素(例如，加里刹霉素， 尤其是加里刹霉素Y 11和加里刹霉素ω 11 (参见例如、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. ,33 183-186(1994)) ；dynemicin、包括dynemicin A ；双膦酸盐、例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素； 以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、埃斯培拉霉素、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色 霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 阿霉素(包括吗啉阿霉素、氰基吗啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)、表阿霉素、 依索比星、去甲氧柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄 榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结 核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶 酸类似物，例如，二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；曙呤类似物，例如，环胞苷，阿扎胞 苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄性激素， 例如，卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米 托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩 尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil ；比生群；依达曲沙；defofamine ；地美可辛；地吖醌；依氟 鸟氨酸；乙酸依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；氮化镓；羟脲；香菇多糖；Ionidainine ；类 美登醇，例如美登素和安丝菌素；丙脒腙；米托蒽醌；莫哌达醇；nitraerine ；喷司他丁 ；蛋 氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰胼；丙卡巴胼；PSK 多糖复合物(JHS NaturalProducts, Eugene, Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸 ’三 亚胺醌；2，2' ,2,2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin Α、杆孢 菌素A和蛇形菌毒素)；氨甲酸乙酯；长春地辛；氮烯唑胺；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫 矛醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷(“Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫衫烷，例 如，TAXOL 紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 无Cremophor的经白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)禾口TAXOTERE 多炼紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR 吉西他滨；6_硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨 蝶呤；钼类似物，例如顺钼和卡钼；长春碱；钼；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽 醌；长春新碱；NAVELBINE 长春瑞滨；诺安托；替尼泊甙；依达曲沙；柔红霉素；氨蝶 呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-Il ；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)； 类视色素，例如视黄酸；卡培他滨；以及上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。所述定 义还包含如bortezumib (Velcade)等蛋白酶体抑制剂、BCL-2抑制剂、IAP拮抗剂(Smac synthetics)、HDAC 抑制剂(HDACI)和激酶抑制剂(Sorafenib)。 在该定义中还包括如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)等抗激素 剂，所述抗激素剂起着调节或抑制激素对肿瘤的作用的功能，包括例如，它莫西芬(包括 NOLVADEX 它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬 盐酸盐、LY117018、奥那司酮和FAREST0N-托瑞米芬；对调节肾上腺中的雌激素生产的芳香 酶进行抑制的芳香酶抑制剂，例如，4 (5)-咪唑、氨基苯乙哌啶酮、MEGASE 乙酸甲地孕 酮、AROMASIN ·依西美坦、福美司坦、法倔唑、RIVISOR 伏氯唑、FEMARA 来曲 唑和ARIMIDEX 阿那曲唑；和抗雄激素，例如，氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮脯利特 和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(a 1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是 抑制参与异常细胞增殖的信号转导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如，PKC-α、 Ralf和H-Ras ；核酶，例如，VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZΥΜΕ 核酶)和HER2表 达抑制剂；如基因治疗疫苗等疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；PROLEUKIN rlL-2 ；LURTOTECAN 拓扑异构酶 1 抑制剂； ABARELIX rmRH ；以及上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。本发明的具体方面现对本发明进行更详细说明，在SEQ ID NO :38中公开了全长人甘露糖结合蛋白 (MBP)(图1)。图1中还描述了 MBP的各种功能区。如本文所用，“甘露糖结合凝集素(MBL) 多肽”是用于指SEQ ID NO 38的21 133位氨基酸(也以SEQ ID NO 48表示)及其如 本文所述的功能变异体和片段。融合蛋白的MBL多肽能与甘露糖结合蛋白(MBP)相关丝氨 酸蛋白酶(MASP)结合并且能启动效应子功能，例如通过补体固定的免疫响应。在某些实施方式中，MBL多肽包含SEQ ID NO :48。在其它实施方式中，MBL多肽包 含SEQ ID NO 38的42 133位氨基酸。在某些实施方式中，MBL多肽包含SEQ ID NO 38 的48 99位氨基酸。在其他实施方式中，MBL多肽包含具有以下一般序列的SEQ ID NO 3的变异体GXYGXYGXOGKYGPYG(SEQ ID NO 45)其中X和Y可以是任何氨基酸，且0是羟基脯氨酸(HyP)。在某些实施方式中，X 选自 Leu、Pro、Phe、Ser、His*Glu。在某些实施方式中，Y 选自 Arg、Ser、HyP、Gin、Leu、 Val、Met、Ala、Thr、Lys、糖基化 Lys (g-Lys)和羟基化 Lys (h-Lys)。在其他实施方式中，MBL多肽变异体可以包含除上文在SEQ ID NO 45中所述以外 其他的SEQ ID NO :48区域中的氨基酸取代。本发明的MBL多肽变异体保留了对于MASP的结 合位点所必需的结构；因此，本发明的变异体不会破坏MBL多肽的胶原蛋白样域的结构。例 如参见 Wallis 等，J.Biol. Chem.，279 (14) 14065-14073 (2004)，本文通过参考将其并入。 因而，MBL变异体可以源自跨越多种物种的各种胶原蛋白样区、多聚区和卷曲螺旋区的共有 序列。此外，可以基于各种MBL多肽的二级和三级结构来进行保守氨基酸取代，且可以将亲 水性、电荷和氢键相互作用均考虑在内，并且可进行适当的保留MASP结合活性的取代。在 包含变异体(例如，MBL多肽的MASP结合区之外的区域中的却是、插入或取代变异体)的 实施方式中，同一性百分比可以低至50 %。在其它的在MASP结合区内包含此类变异体的实 施方式中，变异体具有至少80%的与SEQ ID N0:38或SEQ ID NO :48的同一性。在某些实 施方式中，此类变异体具有至少 85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%、96%、97%、98%或 99%的与 SEQ ID N0:38 或 SEQ ID NO :48 的同一性。在本发明的 融合蛋白的各种实例中，靶向序列在C端与MBL于MBL的K123、K124、W125和Τ127处融合 (相对于SEQ ID NO 38进行编号)。在本发明的上述方面的某些实施方式中，可以选择第二多肽的序列来靶向如糖、 脂质和/或氨基酸序列等与特定细胞类型和/或病原体相关的部分。例如，可以选择靶向 序列以靶向与诸如树突状细胞、B细胞、T细胞和/或肿瘤细胞等细胞或其组合相关的糖、脂 质和/或蛋白(例如，细胞表面受体或跨膜转运蛋白)。类似地，可以选择靶向序列以靶向 与诸如病毒、真菌、细菌、原生动物或其它寄生物等病原体或其组合相关的糖、脂质和/或 蛋白(例如，细胞表面受体或跨膜转运蛋白)。在一个实施方式中，选择靶向序列以靶向与肿瘤细胞相关的糖、脂质和/或蛋白。 在一个具体实施方式
中，靶向序列靶向与肿瘤细胞相关的至少一个蛋白，其非限制性实例 如 CA125、CA19-9、CA15-3、D97、gp 100,Lewis Y、CD20、CD21、TAG-72、EGF 受体、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、PMSA, CDCP1、CD26、H印sin、 HGF (肝细胞生长因子)、Met、CAIX(G250)、EphhB4 (Ephrin B 型受体 4)、EGFR 1、EGFR2、PDGF、 VEGFR、DPP6、粘结蛋白聚糖1、IGFBP2 (人胰岛素样生长因子结合蛋白2)、CD3、CD28、CTL4、 VEGF、Her2/Neu 受体、酪氨酸酶、MAGE UMAGE 3、MART、BAGE、TRP-1、CA 50、CA 72-4, MUC 1、NSE(神经元特异性烯醇酶)、α -胎蛋白(AFP)、SSC(鳞状细胞癌抗原)、BRCA-1、BRCA_2、 磷脂酰肌醇聚糖_3 (GPC3)、结肠抗原-1 (C0A-1)、六个前列腺跨膜上皮抗原1 (STEAPl)、 NY-ES0-1、平足蛋白(podoplanin)、黑色素瘤过表达抗原(meloe)、CD200和hCG。在一个实施方式中，选择靶向序列以靶向与树突状细胞相关的糖、脂质和/或蛋 白。如本文所用的“树突状细胞”包括任何已知树突状细胞亚型，例如，骨髓树突状细胞或 类浆细胞树突状细胞。在一个具体实施方式
中，靶向序列靶向与树突状细胞相关的至少一 个蛋白，例如非限制性实例CD83、CD205、CD197、CCR7和CD209/DC-SIGN。在一个实施方式中，选择靶向序列来靶向与B细胞相关的糖、脂质和/或蛋白。在 一个具体实施方式
中，靶向序列靶向与树突状细胞相关的至少一个蛋白，例如非限制性实 例 CD19、CD20、CD21、CD22、CD32、CD79a , CD79 β、CD83、CD138、CD139、CD179 a、CD179 3 和 CD180、TACI、BCMA 以及 BR-3。在一个实施方式中，选择靶向序列来靶向与T细胞相关的糖、脂质和/或蛋白。本 文所用“T细胞”包括任何类型的T细胞亚型，例如，激活的T细胞；调节性T细胞(Tkk)；细 胞毒性T细胞(Te、CTL)；辅助性T细胞(效应子T细胞或TH;例如，Th1、Th2、Th3、Th17、ThF)； 记忆T细胞(Ta、Tem)；天然杀伤T细胞(NKT) ； Y δ T细胞(γ δ T细胞)。在一个具体实 施方式中，靶向序列靶向与T细胞相关的至少一个蛋白，例如非限制性实例CD3、CD4、CD8、 CCR7、CD153、CD154、CD137、CD134、CD25、CD28、CD129、CD200、CDw217、a -TCR 和 β -TCR0在一个实施方式中，选择靶向序列以靶向与至少一种病原体(细菌、原生动物、寄 生物和病毒等)相关的糖、脂质和/或蛋白。在一个具体实施方式
中，靶向序列靶向与病原 体相关的至少一个蛋白，例如非限制性实例呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白(例如，RSV F糖蛋 白和RSV G糖蛋白等)；人副流感病毒1 4 ；人偏肺病毒、亨德拉病毒和尼帕病毒，以及正 粘病毒科，例如流感Α、Β或C组病毒蛋白(例如，流感病毒神经氨酸酶和流感病毒血凝素)； 疱疹病毒科，例如，单纯疱疹病毒蛋白(例如，单纯疱疹病毒1或2糖蛋白，包括例如gB、gC、 gD或gE蛋白或者gB、gC、gD或gE的同源物)，或者来自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病 毒、和人疱疹病毒6、7或8的蛋白，或来自猴B病毒(猴疱疹病毒1)的蛋白。蛋白还包括 但不限于来自逆转录病毒科的蛋白，例如，1型和2型人免疫缺陷病毒(HIV1和HIV2)以及 人嗜T淋巴细胞病毒1 4(HTLV-1 4)包膜和其它蛋白、以及来自β逆转录病毒属和泡 沫病毒属的蛋白。蛋白也可以来自披膜病毒科，包括如来自风疹或甲病毒属的衣壳蛋白等 蛋白，例如，委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和西方马脑炎病毒以及圣利基森林病毒 复合物。蛋白还可以包括但不限于来自腺病毒科(例如，人类腺病毒A F和其它多种人 类腺病毒)、来自痘病毒科(例如，痘疮(天花)、痘苗、牛痘、猴痘、传染性软疣(Molluscum contagiosum)、树鼠痘、雅巴猴肿瘤病毒、口疮病毒、伪牛痘和牛丘疹性口炎病毒)的蛋白。 蛋白还包括但不限于来自微小病毒科(例如，B19病毒、腺相关病毒和人博卡病毒)的蛋白。 蛋白还包括但不限于来自乳头瘤病毒科的蛋白，包括来自多种不同人乳头瘤病毒的蛋白。 蛋白还包括但不限于来自多瘤病毒科(例如，JC病毒、BK病毒、KI病毒、WU病毒和Merkel
12细胞多瘤病毒)和来自环病毒科(例如，输血传播病毒(TTV))的蛋白。此类蛋白还包括 但不限于来自以下病毒的蛋白呼肠孤病毒科，例如，轮状病毒、正呼肠孤病毒和科罗拉多 壁虱热病毒(coltivirus)；肝脱氧核糖核酸病毒科(例如，乙肝病毒)；微小核糖核酸病毒 科，例如，肠病毒属、埃柯病毒、双埃柯病毒属、A和B组柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒，甲肝 病毒、心脏病毒和鼻病毒；黄病毒科，例如，丙肝病毒和登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎 病毒、科萨努尔森林病病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和蜱传脑炎病毒；冠状 病毒科，例如，人冠状病毒、人曲状病毒，以及SARS冠状病毒蛋白，并且包括但不限于来自 以下病毒的S和M蛋白冠状病毒科；布尼雅病毒科，例如，克里米亚_刚果出血热病毒、加 州脑炎病毒、拉克罗斯病毒、裂谷热病毒和多种人类可传播汉坦病毒；博尔纳病毒科，例如， 博尔纳病病毒；弹状病毒科，例如，狂犬病病毒；和纤丝病毒科，例如，埃博拉病毒和马尔堡 病毒；杯状病毒科，例如，诺罗病毒(例如，诺瓦克病毒)、沙波病毒(例如，札幌病毒)和其 它杯状病毒；星状病毒科，例如，人星状病毒；沙粒病毒科，例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 病毒、拉沙病毒(Lassa virus),胡宁病毒(Junin virus),马丘波病毒(Machupo virus), 瓜纳里托病毒(Guanarito virus)，萨维亚病毒(Savia virus)，塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、弗莱克病毒(Flexal virus)禾口白水阿罗约病毒(Whitewater Arroyo virus)；月干 炎病毒科，例如，戊肝病毒，以及源自S病毒属(例如，丁肝病毒)的基因组的表面蛋白。
细菌的表面蛋白还包括但不限于见于以下各种物种的蛋白α变型菌门 (alphaproteobacteria)，例如以下属的那些细菌无形体属(Anaplasma)(包括粒细 胞无形体(Anaplasma phagocytophilum))、埃立克体(Ehrlichia)(包括查菲埃立 克体(E. chaffeensis)和尤茵埃立克体(E. erwingii))、立克次氏体(Rickettsia) (包括普氏立克次氏体(R.proWaZekii)、伤寒立克次氏体(R. typhi)和立氏立克次氏 体(R. rickettsii))、巴尔通体(Bartonella)(包括汉赛巴尔通体(B. henselae))和 布鲁氏菌属(Brucella) ； β变型菌门(betaproteobacteria)，例如以下属的那些细 菌伯克氏菌属(Burkholderia)(包括洋葱伯克氏菌(B. cepacia)和类鼻疽伯克氏 菌(B. pseudomallei))、博德特氏菌(Bordetella)(包括百日咳杆菌(B. pertussis)) 和奈瑟氏菌属(Neisseria)(包括淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌 (N. meningitides)) ； γ变型菌门(gammaproteobacteria)，例如以下属的那些细菌 弗朗西斯菌属(Francisella)(包括土拉热弗朗西斯菌(F. tularensis))、军团杆菌属 (Legionella)(包括嗜肺军团菌(L. pneumophila))、柯克斯体属(Coxiella)(包括贝纳柯 (C. burnetii))、f 云力木干胃M (Acinetobacter) (ySfiiIfiftf 云力ff胃(A. baumannii)) > 莫拉菌属(Moraxella)(包括腔隙莫拉氏菌(M. Iacunata))、假单胞菌属(Pseudomonas) (包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和栖稻假单胞菌(P. oryzihabitans))、普罗菲登菌 属(Providencia)(包括斯图氏普罗菲登菌(P. stuartii))、弧菌属(Vibrio)(包括霍乱 弧菌(V. cholerae)、创伤弧菌(V. vulnificus)禾口副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)) > 柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)(包括阴沟肠杆菌(E. cloacae) 和产气肠杆菌(E. aerogenes))、埃希氏菌属(Escherichia)(包括大肠杆菌0157 :H7)、克 雷伯杆菌属(Klebsiella)(包括肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae))、变形杆菌属(Proteus) (包括普通变形杆菌(P. vulgaris)、奇异变形杆菌(P. mirabilis)和潘氏变形杆菌 (P.penneri))、沙门氏菌属(Salmonella)(包括鼠伤寒、肠炎、伤寒沙门氏菌(S. entericaserovarsTyphimurium, Enteritidis 和 Typhi)、沙雷氏菌属(Serratia)(包括粘质沙雷 氏菌(S. marcescens))、志贺氏菌属(Shigella)(包括福氏志贺氏菌(S. flexneri)、痢 疾志贺氏菌(S. dysenteriae)和索氏志贺氏菌(S. sonnei))、耶尔森氏菌属(Yersinia) (包括鼠疫耶尔森菌(Y. pestis))、嗜血杆菌属(Haemophilus)(包括流感嗜血杆菌 (H. influenzae)和杜克嗜血杆菌(H. ducreyi))和巴斯德氏菌属(Pasteurella)(包括 多杀巴斯德氏菌(P.multocida)) ； ε变形菌门(印silonproteobacteria)，例如以下属 的那些细菌弯曲杆菌属(Campylobacter)(包括空肠弯曲杆菌(C. jejuni)、结肠弯曲 杆菌(C.coli)和胎儿弯曲杆菌(C. fetus))和螺旋杆菌属(Helicobacter)(包括幽門 螺旋杆菌(H. pylori))；硬壁菌门(firmicutes)，例如以下属的那些细菌梭状芽胞杆菌 属(Clostridium)(包括艰难梭菌(C. difficile)、产气荚膜梭菌(C. perfringens)、肉 毒梭菌(C.botulinum)、索氏梭菌(C. sordellii)和破伤风梭菌(C. tetani))、支原体属 (Mycoplasma)(包括肺炎支原体(M. pneumoniae))、芽胞杆菌属(Bacillus)(包括炭疽芽 胞杆菌(B. anthracis)和蜡状芽胞杆菌(B. cereus))、李斯特菌属(Listeria)(包括产单 核细胞李斯特菌(L. monocytogenes))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(包括金黄色葡萄球 菌(S. aureus)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)禾口表皮葡萄球菌(S.印idermis))、肠球 菌属(Enterococcus)(包括粪肠球菌属(E. faecal is)和屎肠球菌(E. faecium))和链球 菌属(Streptococcus)(包括化脓性链球菌(S. pyogenes)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、 无乳链球菌(S. agalactiae)、变形链球菌(S. mutans)、草绿色链球菌(S. viridans)和停 乳链球菌(S. dysgalactiae))；放线菌门(actinobacteria)，例如以下属的那些细菌放 线菌属(Actinomyces)(包括衣氏放线菌(A. israelii))、棒状杆菌属(Corynebacterium) (包括白喉棒状杆菌(C. diphtheriae)、无枝菌酸棒状杆菌(C. amycolatum)和短小棒状 杆菌(C. parvum))、加德纳菌属(Gardnerella)(包括阴道加德纳菌(G. vaginalis))、 分枝杆菌属(Mycobacterium)(包括结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、麻风分枝杆菌 (M. leprae)、脓肿分支杆菌(M. abscessus)和鸟分支杆菌复合物(M. aviumcomplex))和诺 卡氏菌属(Nocardia)(包括星形诺卡氏菌属(N. asteroides))；衣原体(chlamydiae)，例 如以下属的那些细菌衣原体属(Chlamydia)(包括沙眼衣原体(C. trachomatis))和披衣 菌(Chlamydophila)(包括鹦鹉热披衣菌(C. psittaci)和肺炎披衣菌(C. pneumoniae))； 螺旋体门(spirochaetes)，例如以下属的那些细菌疏螺旋体属(Borrelia)(包括伯 氏疏螺旋体(B. burgdorferi))、钩端螺旋体属(Leptospira)(包括问号钩端螺旋体 (L. interrogans))和密螺旋体属(Ti^ponema)(包括苍白密螺旋体(T. pallidum))；拟杆菌 (bacterioidetes)，例如拟杆菌属(Bacteroides)和普雷沃氏菌属(Prevotella)的那些细 菌；和梭杆菌门(fusobacteria)，例如梭杆菌属(Fusobacterium)的那些细菌。
寄生物的表面蛋白包括但不限于见于真菌物种的各个生命期(孢子、菌丝、 出芽、酵母)的那些蛋白，所述真菌物种例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲 霉(A. flavus)、甲 土曲霉(A. terreus)、构巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉(A. niger)、 皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、念珠菌属(Candida spp.)、粗球杆菌 属(Coccidioides spp.)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹替隐球菌 (C. gatti)、小抱子虫属真菌(Brachiola algerae)、(B. connori)、(B. vesicularum)、 家兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、香鱼脑炎微孢子虫(E. he 11 em)、
14肠艾美球虫(E. intestinalis)、比氏肠胞微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)、斯 里兰卡微孢子虫(Microsporidium ceylonensis)、非洲微孢子虫(M. africanum)、 眼微粒子虫(Nosema ocularum)、具褶孢虫属(Pleistophora spp.)、人多孢微孢子 虫(Trachipleistophora hominis)、节肢云力物多抱微抱子虫(T. anthropophthera)、 (Vittaforma corneae)禾口耳口 氏月市抱子虫(Pneumocystis jirovecii)(从前被划分为 卡氏肺囊虫(P.carinii))；以及见于顶复门原生动物物种的各个生命期的蛋白，所述 物种例如果氏巴贝斯虫(Babesia microti)、分歧焦虫(B. divergens)、微小隐孢子 虫(Cryptosporidium parvum)、人隐孢子虫(C. hominis)、猫隐孢子虫(C. felis)、犬 隐孢子虫(C. canis)、啮齿类隐孢子虫(C.muris)、火鸡隐孢子虫(C. meleagridis)、圆 ife^it^. (Cyclospora cayetanensis) > JJl K it (Isospora belli)、生双帛 虫(Plasmodium falciparum)、三曰症原虫(P. malariae)、卵形疾原虫(P. ovale)、间曰 疟原虫(P.vivax)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)；以及纤毛门物种(例如结肠 小袋绦虫(Balantidium coli))和眼虫门物种(例如，夏科氏利什曼原虫(Leishmania chagasi))、杜氏利什曼原虫(L. donovani)、婴儿利什曼原虫(L. infantum)、墨西哥 利什曼原虫(L. mexicana)、亚马逊利什曼原虫(L. amazonensis)、委内瑞拉利什曼原 虫(L. venezuelensis)、热带利什曼原虫(L. tropica)、硕大利什曼原虫(L. major)、埃 塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、巴西利什曼原虫(Viannia亚属)(L. (subgenus Viannia) braziliensis)、圭亚那禾丨J 什曼原虫(Viannia 亚属)(L. (V.) guyanensis)、巴 拿马利什曼原虫(Viannia亚属)(L. (V.) panamensis)、秘鲁利什曼原虫(Viannia亚 M ) (L. (V.)peruviana) KH^ (Trypanosoma cruzi) ft^HMMH^ (Τ. brucei rhodesiense)和布氏冈比亚锥虫(T. brucei gambiense)；以及变形虫门物种(例如， 棘阿米巴属(Acanthamoeba spp.)、巴拉姆希阿米巴(Balamuthia mandrillaris)和 (Entamoeba histolytica))、双滴虫物种(例如，贾第鞭毛虫(Giardia Iamblia))、 鞭毛滴虫(trichomonads)物种(例如脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)和阴 道滴虫(Trichomonas vaginalis))、原生生物(protists)物种(例如，福氏耐格里 阿米巴(Naegleria fowleri))、原生藻菌(stramenopiles)物种(例如，人芽囊原虫 (Blastocystis hominis))上的蛋白；以及见于线虫类物种的各个生命期的蛋白，所述 物种例如广州血管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)、哥斯达黎加血管圆线虫 (A. costaricensis)(Anisakis simplex) >^jftIf^(Pseudoterranova
decipiens)、^(以虫引虫回线虫(Ascaris lumbricoides)禾口虫回虫属(Ascaris spp. )、proconyis 贝虫回虫(Baylisascaris proconyis)、菲 聿宾毛细线虫(Capillaria phillipinensis) > 肝毛细线虫(C. h印atica)、嗜气毛细线虫(C. aerophila)、麦地那龙线虫(Dracunculus medicinensis)(Brugia malayi)(B. timori)(Dirofilaria
spp.)、罗阿丝虫(Loaloa)、奥氏曼森线虫(Mansonella ozzardi)、常现曼森线虫 (M. perstans)、链尾曼森线虫(M. str印tocerca)、班氏吴策线虫(ffucheria bancrofti) > 螺形住肠线虫(Enterobius vermicularis)、gregorii 住肠线虫(E. gregorii)、棘 腭 口线虫(Gnathostoma spinigerum)、刚棘颚 口线虫(G. hipidum)、十 二指肠钩口 线虫(Ancylostoma duodenale)、锡兰钩 口线虫(A. ceylanicum)、巴西钩 口线虫(A braziliense)、犬钩 口线虫(A. caninum)、狭头刺口 钩虫(Uncinaria stenocephala)、美洲板口线虫(Necator americanus)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、肠类圆线虫 (Strongyloides stercoralis)、(S. fuelleborni)、犬弓首虫回虫(Toxocara canis)、费氏 类圆线虫(T. cati)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、伪旋毛虫(T. pseudospiralis)、 本地旋毛虫(T. nativa)、纳氏旋毛虫(T. nelsoni)、布氏旋毛虫(T. britovi)和毛首 鞭形线虫(Trichuris trichiura)；以及见于扁形动物门物种的各个生命期的蛋白，所 述物种例如华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、太平洋裂头绦虫(D. pacificum)、crodatum裂头绦虫(D. crodatum)、厄氏裂头绦 ^ (D. ursi)(D. dendriticum)、 lanceolatum(D. lanceolatum)、
广节裂头绦虫(D. dalliae)、yonagoensis裂头绦虫(D. yonagoensis)、犬复孔绦虫 (Dipylidium caninum)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、月干片吸虫 (Fasciola h印atica)、巨型吸虫(F. gigantus)、布氏姜片吸虫(Faciolopsis buski)、异 形异形吸虫(Heterophyes heterophyes)、微小膜壳绦虫(Hymenol印is nana)、横川后殖 吸虫(Metagonimus yokogawai)、廣猫后睾吸虫(Opisthorchis viverrini)、猫后睾吸 虫(0. felineus)、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、并殖吸虫属(Paragonimus spp·)、曼森氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(S· haematobium)、日本血吸虫 (S. japonic·)、湄公河血吸虫(S. mekongi)、刚果血吸虫(S. intercalate)以及猪肉绦虫 (Taenia solium)禾口绦虫属(Taenia spp.)。靶向序列可以包含具有与任何的靶标部分的上述非限制性实例的结合亲和力的 任何序列。靶向序列的某些非限制性实例包括凝集素域(例如，显示出对特定糖、脂质和/ 或蛋白的结合亲和力的C型凝集素域(CTLD))、抗体序列及其抗原结合片段(例如，scFv、 Fab' ,Fab2'等)或其它替代性支架结构。在某些实施方式中，本发明的融合蛋白利用C型凝集素域(CTLD)的结合特征和 MBL的补体固定特征。钙依赖性凝集素(C型凝集素)在包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋 巴细胞、肥大细胞和自然杀伤(NK)细胞的大量细胞类型中表达。巨噬细胞凝集素蛋白在 外来细胞和病原体的识别和破坏中执行着各种功能。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌已据 显示可与 C 型凝集素相互作用[Athamna 等，Infect Immun. 59 1673 (1991) ；Shimaoka 等， J. Immunol. 166(8) :5108 (2001)]。已发现人巨噬细胞C型凝集素可识别公知的人癌相关 表位[Suzki等，J Immunol 156:128(1996)]。此外，小鼠巨噬细胞C型凝集素的重组细 胞溶质糖结合域也充当细胞毒性活性抑制剂，这表明该凝集素是巨噬细胞肿瘤破坏性响 应的直接介导物[Imai等，J Immunol Methodsl71 23(1994)]0独特巨噬细胞凝集素可 以与由某些异常细胞或患病细胞表达的表面抗原特异性相互作用。C型凝集素是在其糖 识别域(CRD)中展示出氨基酸序列相似性并与选定的糖以钙依赖性方式结合的糖蛋白。C 型凝集素可以被划分为4个一般类别[Vasta等，Ann N Y Acad Sci.，712 =55-73(1994)； Spiess, Biochemistry, 29 10009-10018 (1990)]。第一个类别包含 II 型膜整合蛋白，例 如，去唾液酸糖蛋白受体、巨噬细胞半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)特异性凝集素以及 CD23 (Fe- ε RII)。该组的许多成员展示出对半乳糖/岩藻糖、半乳糖胺/GalNac或GlcNac 残基的特异性。第二个类别包括软骨和成纤维细胞蛋白聚糖核心蛋白。第三个类别包括胶 原凝集素，其包括ΜΒΡ、肺表面活性蛋白SP-A和共凝集素。第四个类别包括称为LEC-CAM的 某些粘附分子(例如，Mel-14、GMP-140和ELAM-1)。
已知C型凝集素可充当凝集素、调理素、补体激活剂和细胞相关识别分子[Vasta 等，Ann N Y Acad Sci. ,712 55-73,1994；Spiess, Biochemistry,29 10009-10018,1990 ； Kery, Int J Biochem.，23 (7-8) =631-40,1991] 例如，巨噬细胞甘露糖受体起着清除 剂功能，以及介导包括卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii) [Ezekowitz等，Nature, 351 (6322) 155-8, (1991)]和白色念珠菌(Candida albicans) (Ezekowitz 等，J Exp Med.， 172(6) =1785-94, (1990)]的病原性生物体的摄取。因此，C型凝集素展示出具有生物学重 要性的不同能够，并且拥有与特定靶标部分(包括特定细胞类型和病原体)的理想结合特 性。任何类型的功能性CTLD都能用作本发明的融合蛋白中的第二多肽。在一个实施 方式中，靶向序列包含靶向肿瘤细胞表面上的诸如Lewis抗原等部分的序列。在另一个实 施方式中，靶向序列包含与Lewis抗原结合的DC-Sign (树突状细胞特异性ICAM-3结合非 整合素)或其功能性片段或变异体。在一方面，本发明针对MBL的融合蛋白、靶向序列和四连接素三聚域。根据本发 明，靶向序列可以与四连接素三聚域的N端或C端氨基酸残基相连。在各种实施方式中，靶 向序列与N端或C端相连，而具有效应子功能的MBL多肽与另一末端结合。除了经由肽键在末端连接之外，根据其他技术使异源性靶向序列与MBL复合 物相连。例如，经由与侧链的肽键或经由与半胱氨酸残基的键。然而，任何将异源性物 质与多肽链共价偶联的方式都是可用的。在这方面本领域技术人员可例如通过查阅WO 95/31540 (本文通过参考将其并入)的教导而了解这类可能性。在另一方面，本发明提供了激活哺乳动物补体系统的方法，所述方法包括对哺 乳动物施用包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，所述第一多肽包含甘露糖结合凝集素 (MBL)多肽并且具有效应子功能，而所述第二多肽包含与靶标部分结合的序列。在一方面，本发明提供了包含含有第一多肽和第二多肽的融合蛋白以及可药用赋 形剂的药物组合物，所述第一多肽包含甘露糖结合凝集素(MBL)多肽并且具有效应子功 能，而所述第二多肽包含与靶标部分结合的序列。在一方面，本发明提供了治疗病原性疾病的方法，所述方法包括对罹患该疾病的 患者施用包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白或其药物组合物，所述第一多肽包含甘露 糖结合凝集素(MBL)多肽并且具有效应子功能，而所述第二多肽包含与靶标部分结合的序 列，其中所述靶标部分是病原体的细胞表面受体。在一方面，本发明提供了治疗包含肿瘤细胞的增殖性疾病的方法，所述方法包括 对有需要的患者施用包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白或其药物组合物，所述第一多肽 包含甘露糖结合凝集素(MBL)多肽并且具有效应子功能，而所述第二多肽包含与靶标部分 结合的序列，其中所述靶标部分是肿瘤细胞表面上的受体。在一个实施方式中，肿瘤细胞 表面上的受体包含Lewis抗原。在另一个实施方式中，第二多肽包含与Lewis抗原结合的 DC-Sign (树突状细胞特异性ICAM-3结合非整合素)或其功能性片段或变异体。作为概念证明，在实施例中对本发明的非限制性实施方式进行详细描述，其中靶 向序列包含作为属于C型凝集素家族的II型跨膜蛋白的DC-Sign。该蛋白在树突状细胞 (DC)表面上的周边表达并且经由T细胞上的ICAM-3参与淋巴系统中的抗原呈递细胞与静 息T细胞之间的初步接触。DC-Sign还在DC向淋巴组织迁移期间与上皮细胞上的ICAM-2相互作用。DC-Sign还与HIV包膜蛋白gpl20牢固结合并促进反式⑶4+T细胞中的病毒感 染。DC-Sign蛋白由短氨基末端细胞质尾部、跨膜域、至多71/2重复片段的茎部以及其后的 C端C型糖识别域(CRD)组成。所述茎部促进四聚体(卷曲螺旋)的形成。血型相关Lewis肿瘤抗原(例如，Lex和Ley)在大多数的源自上皮的人类癌上表 达。Lewis抗原是复合寡糖，并且据发现其作为糖脂既可嵌入细胞膜中又可与细胞表面蛋白 (例如，HER1、HER2和CEA)相连，而且有限地表达于正常组织上。Lewis抗原已据显示可介 导树突状细胞粘附和肿瘤细胞浸润。Lewis Y与树突状细胞上的DC-SIGN受体相互作用以 通过促进免疫抑制而逃避免疫监督。因此，Lewis抗原提供了包含本发明的融合蛋白的第 二多肽的靶标部分的非限制性实例。所述肽和相应的编码人MBL的肽的C-DNA序列分别提 供于图1和序列表中。在某些实施方式中，本发明提供了 MBL多肽和作为融合蛋白的DC-Sign的组合，其 独特地合并了 DC-SIGN结合某些Lewis抗原的能力与MBP激活补体系统的能力。此外，对 MBP颈部区和DC-SIGN四聚域(均为螺旋卷曲-卷曲结构)的仔细比较鉴定出具有相似结 构性构造的区域。通过保留螺旋节律，已经设计出多种不同的非限制性MBP/DC-SIGN融合 蛋白，如下文实施例中所述。本发明的MBP/DC-SIGN融合蛋白具有较高的多聚程度，这显著增加了亲和力增益 (即增加的与表达大量受体的细胞的结合强度)，后者增加了特异性靶向癌细胞的治疗分 子的效果并减少了副作用的风险。在一个实施方式中，融合蛋白还可以阻断癌细胞与树突 状细胞之间的相互作用(该相互作用导致逃离免疫监督)，并且阻断由Lewis抗原介导的 粘附和肿瘤细胞侵入。在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白可以具有通过补体激活和 /或由单核细胞和中性粒细胞的摄取而介导对靶标细胞的杀伤的优点。本发明还提供了 MBP/DC-SIGN融合蛋白，包括选自以下蛋白的融合蛋白 MBP/DC-Sign CTLD-ABs (SEQ ID NO 2), MBP/DC-Sign CTLD-ACs (SEQ ID NO 4), MBP/ DC-Sign CTLD-ADs(SEQ ID NO 6), MBP/DC-Sign CTLD-ABsC(SEQ ID NO 8), MBP/DC-Sign CTLD-ACsC (SEQ ID NO 10), MBP/DC-Sign CTLD-ADsC (SEQ ID NO 12), MBP/DC-Sign CTLD-FE (SEQ ID NO 14), MBP/DC-Sign CTLD-GE (SEQ ID NO 16), MBP/DC-Sign CTLD-HE SEQ ID NO 18),MBP/DC-Sign CTLD-ACsCSG(SEQ ID NO 20),MBP/DC-Sign CTLD-ACsCSGGS (SEQ ID NO 22) , MBP/DC-Sign CTLD-ACsCSGGGS (SEQ ID NO 24), MBP/DC-Sign CTLD-ABsO(SEQ ID NO 26)和 MBP/DC-Sign CTLD-ABsCO(SEQ ID NO :28)。在某些实施方式中，本发明的融合蛋白可以额外与第三多肽(即第三融合伙伴) 相连。这可以是通过将此类第三融合伙伴加入本发明的MBP/DC-SIGN融合蛋白中，可以获 得较高的MBP/DC-SIGN融合蛋白产量。根据本发明，第三融合伙伴可以为任何合适的种类， 条件是其为肽、寡肽、多肽或蛋白，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽。在某些实施方式中， 第三融合伙伴可以是单个氨基酸。可以对其进行选择从而其使得融合蛋白更耐受蛋白酶降 解、促进融合蛋白的表达和分泌的提高、改善溶解性和/或允许对融合蛋白的后续亲和纯 化。在某些实施方式中，本发明的融合蛋白与如泛素等第三融合伙伴的连接区包含颗 粒酶B蛋白酶切割位点，例如人颗粒酶B(E. C. 3. 4. 21. 79)。对于颗粒酶B作为融合蛋白切割 剂的更详细的信息可见于已公开的美国专利申请第2006/0199251号或W0/2004/094478，
18本文通过参考将其每一个并入。在其他实施方式中，第三融合伙伴可以与亲和标签(affinity tag)偶联，或其自 身可以是亲和标签。此类亲和力标签可以包含使得融合蛋白能在亲和树脂上纯化的亲和 域。亲和标签可以是包括六组氨酸标签的多组氨酸标签、多精氨酸标签、FLAG标签、Strep 标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合肽、甲壳素结合域、谷胱甘肽S转移 酶标签或麦芽糖结合蛋白或者本领域技术人员已知的任何其他亲和标签。在其他实施方式中，第三融合伙伴可以包含通过增加(延长)融合蛋白的半衰期 而使融合蛋白稳定化的分子。能延长如蛋白等生物分子的半衰期的分子是本领域技术人员 已知的，且包括例如BSA结合肽、各种多元醇(例如，PEG)、IgG结合肽或者与FcRn或Fc抗 体片段结合的肽。在某些实施方式中，本发明的方法包括用于将通过对已经例如通过施用上述亲和 标签体系固定化的融合蛋白的酶促切割而形成的本发明的MBP/DC-SIGN融合蛋白进行分 离的分离步骤。该分离步骤可以通过蛋白分离领域内已知的任何合适方法进行，包括使用 离子交换和通过尺寸分级，其选择取决于融合蛋白的性质。在一个实施方式中，使第三融合 伙伴与包含MBL多肽和DC-SIGN多肽的区域之间的区域和人丝氨酸蛋白酶颗粒酶B相接 触，以便将融合蛋白在颗粒酶B蛋白酶切割位点处切割而产生本发明的融合蛋白。本发明还提供了编码本发明的MBP/DC-SIGN融合蛋白的分离核酸。核酸包括RNA 和DNA。更具体而言，本发明提供了编码本发明的MBP/DC-SIGN融合蛋白的分离核酸，其包 含选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 27 的核苷酸序列。本发明还提供了形式为质粒、载体、转录物或表达盒的包含至少一个上述核酸的 核酸构建体。合适的载体可以视情况而定被选择或构建来包含适当的调节序列，包括启动 子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列。视情况而定， 载体可以为质粒、病毒(例如，噬菌体)或噬菌粒。更多细节参见例如Molecular Cloning :a Laboratory Manual 二片反，Sambrook·，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。本发明还提供了包含一个或多个上述构建体的重组宿主细胞。合适的宿主细胞包 括细菌、哺乳动物细胞、酵母菌和杆状病毒体系。本领域内可利用的用于表达异源性多肽的 哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞和NSO小鼠黑色素瘤细 胞等。在一个实施方式中，宿主细胞是HEK293细胞。本发明的多肽的治疗应用包括使用MBP/DC-SIGN融合蛋白用于治疗癌症疾病，包 括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肝癌、骨髓癌和上皮癌。与HER2 (Erb B2)选择性结合的HERCEPTIN (曲妥珠单抗)已被认证用 于治疗过表达HER2的肿瘤中的乳腺癌，HER2与癌细胞上的Lewis抗原糖基化。靶向 HER2上的Lewis抗原不会干扰HERCEPTIN 的结合，并且据预期本发明的融合蛋白与 HERCEPTIN 的组合会对治疗具有协同效果。其它治疗剂包括如利妥昔单抗等单克隆 抗体、VEGF或EGFR靶向剂、激酶抑制剂、免疫刺激剂和癌疫苗。化学治疗药物常用于治疗结肠直肠癌，例如，5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、奥沙利钼 和雷替曲塞。已据报道此类化合物可提高Lewis Y表达，这表明以本发明的融合蛋白对
19Lewis抗原的靶向能与一系列化学治疗药物协同作用。因此，施用MBP/DC-SIGN融合蛋白可以包括施用至少一种其它治疗剂(例如， HERCEPTIN )以及化学治疗剂(例如，雷替曲塞、阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依立替 康和顺钼、丝裂霉素c和奥沙利钼)。治疗方法本发明的另一个方面设计治疗与免疫细胞、病原性细胞、肿瘤细胞或受病毒感染 的细胞相关的疾病的方法。所述方法包括使细胞与本发明的融合蛋白接触。本发明的另一个方面针对重组疗法。本发明还提供了包含融合蛋白与治疗剂的制 剂。据信此类制剂将特别适于储存以及用于治疗施用。所述制剂可以通过已知技术制备。 例如，可以通过在凝胶过滤柱上的缓冲液交换来制备所述制剂。可以根据已知方法来施用融合蛋白和治疗剂，例如，作为推注或在一段时间内的 连续输注的静脉内施用、通过肌内、腹腔内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部 或吸入途径。必要时，可以使用各种商购装置通过微型泵输注来进行施用。用于施用融合蛋白的有效剂量和方案可以根据经验确定，且作出此类决定是在本 领域技术内。可以采用单次或多次剂量。目前，据信单独使用的融合蛋白的有效剂量或量 可以为约lyg/kg体重/日 约100mg/kg体重/日以上。可以以本领域已知方式进行物 种间的剂量缩放，例如，如Mordenti等，Pharmaceut. Res.，8 1351(1991)中所公开。当采用体内施用融合蛋白时，正常剂量可以根据施用途径而在约lOng/kg哺乳动 物体重/日 高达100mg/kg哺乳动物体重/日以上变化，优选为约1 μ g/kg/日 IOmg/ kg/日。文献中提供了对于具体剂量和输送方法的指导(参见例如，美国专利第4，657，760 号、第5，206，344号或第5，225，212号)。本领域技术人员可以理解，不同制剂将对不同治 疗化合物和不同病症有效，靶向例如一个器官或组织的施用可能需要以不同于针对另一个 器官或组织的方式的输送。本领域技术人员可以理解，必须施用的融合蛋白的剂量将根据 例如接受该融合蛋白激动剂的哺乳动物、施用途径和正在对该哺乳动物施用的其它药物或 治疗而有所不同。据设想，可以在所述方法中采用其它额外疗法。一种或多种其它疗法可以包括但 不限于施用放射治疗、细胞因子、生长抑制剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、酪氨酸激酶抑制 剂、Ras法尼基转移酶抑制剂、血管新生抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，或者任 何其它的增加癌细胞对于采用所述融合蛋白的治疗的易感性的药剂。化学治疗剂的准备和给药方案可以根据制造商使用说明来使用，或者由本领域技 术人员根据经验确定。此类化学治疗的准备和给药方案也描述于Chemotherapy Service Ed.，Μ. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, Md. (1992)中。化学治疗剂可以在施用 Apo2L变异体之前或之后施用，或者可以与其同时施用。融合蛋白和治疗剂(以及一种或多种其它治疗)可以并行地(同时地)或依次地 施用。在特定实施方式中，融合蛋白和治疗剂可以并行施用。在另一个实施方式中，将融合 蛋白或三聚复合物在施用治疗剂之前施用。在另一个实施方式中，将治疗剂在融合蛋白或 三聚复合物之前施用。在施用后，可以对体外受处理的细胞进行分析。当存在体内处理时， 可以以本领域技术人员所公知的多种方式对受处理哺乳动物进行监测。例如，可以对肿瘤 组织进行病理学检验以分析细胞死亡，或可以分析血清的免疫系统响应。
药物组合物本发明的融合蛋白可以用于通过本领域公知的任何合适方法来制备药物组合物。 所述组合物可以包含融合蛋白以及用于其的一种或多种可接受载剂，和在必要时包含其它 治疗剂和/或化学治疗剂成分。于是，本发明涉及包含治疗有效量的本发明的融合蛋白以 及可药用载剂或赋形剂的药物组合物。如本文所用，“可药用载剂”或“可药用赋形剂”包括 任何和所有的生理学相容性的溶剂、分散介质、涂覆物、抗菌剂和抗真菌剂以及等渗剂和延 缓吸收剂等。可药用载剂或赋形剂的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋葡萄糖、甘油 和乙醇等中的一种或多种物质以及它们的组合。在许多情形中，优选在组合物中包含等渗 剂，例如，糖、如山梨醇、甘露醇等多元醇或氯化钠。也可以包含如润湿量或微量的辅助物质 (例如，润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)等提高抗体或抗体部分的使用寿命或有效性的 可药用物质。必要时可包含崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐(例如，藻 酸钠等)。除赋形剂以外，所述药物组合物还可以包含一种或多种以下物质如血清白蛋白 等载体蛋白、缓冲剂、粘合剂、甜味剂和其它调味剂、着色剂以及聚乙二醇。所述组合物可以处于各种形式，包括例如液体、半固体和固体剂型，例如，液体溶 液(例如，可注射和可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体剂和栓剂。优 选形式将取决于期望的施用途径和治疗应用。在一个实施方式中，所述组合物处于可注射 或可输注溶液的形式，例如，与用于采用抗体的人被动免疫的那些组合物相似的组合物。在 一个实施方式中，施用模式为胃肠外(例如，静脉内、皮下、腹腔内、肌内)。在一个实施方式 中，通过静脉内输注或注射来施用融合蛋白(或三聚复合物)。在另一个实施方式中，通过 肌内或皮下注射来施用融合蛋白或三聚复合物。用于所述药物组合物的其它合适的施用途径包括但不限于直肠、透皮、阴道、透过 粘膜或肠内施用。治疗组合物通常在制造和储存条件下是无菌且稳定的。可以将组合物配制为溶 液、微乳液、分散体、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构体。可以通过将活性化合物 (即融合蛋白或三聚复合物)以所需量在必要时与一种上文列举的成分或其组合一同加入 适当溶剂中、然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物加入含有基本 分散介质和所需的来自上文列举的那些成分的其它成分的无菌承载剂来制备分散体。在用 于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其 产生来自此前无菌过滤的溶液的活性成分和任何额外的所需成分的粉末。通过例如使用如 卵磷脂等涂覆物、通过在分散体的情形中维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂可 以维持适当的溶液流动性。通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明 胶)可以实现可注射组合物的延长吸收。可用于本文所述的病症的治疗中的包含融合蛋白和治疗剂的制造品(例如，试剂 盒)包含至少一个容器和标签。合适的容器包括例如瓶、管、注射器和试管。容器可以由如 玻璃或塑料等各种材料制成。容器上或与其关联的标签表明所述制剂用于治疗所选择的病 况。所述制造品还可以包含含有如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋葡萄糖溶液等可药 用缓冲剂的容器。该制造品还可包含从商业和用户角度理想的其它材料，包括其它缓冲剂、 稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有施用说明的包装插页。所述制造品还可以包含具有如 上所述的另一种活性剂的容器。
通常，在制剂中使用合适量的可药用盐以使得该制剂等渗。可药用载剂的实例包 括盐水、林格氏溶液和右旋葡萄糖溶液。制剂的PH优选为约6 约9，且更优选为约7 约 7. 5。对于本领域技术人员显而易见的是，根据例如施用途径和融合蛋白及治疗剂的浓度， 某些载剂可能更为优选。可以通过将具有适当纯净度的所需分子与可选的可药用载剂、赋形剂或稳定剂混 合[Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16版，Osol，Α·编，(1980)]，以冻干制剂、 水溶液或水性悬浮液的形式制备治疗组合物。优选的是，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂 对于接受者在所用剂量和浓度下是无毒的，并且包括缓冲剂，例如Tris、HEPES、PIPES、磷 酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如，十八烷基 二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇 或苯甲醇、如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯等对羟基苯甲酸烷基酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己 醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白，例如，血清白蛋白、明胶或 免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖，如蔗 糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如，钠离子；和/或非离子表面活性剂，例如， TWEEN , PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。此类载剂的其它实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例 如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如，甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘 油酯混合物、水、盐或电解质(例如，硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、胶体二 氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮和纤维素类物质。局部或凝胶类形式用载剂包括多糖 (例如，羧甲基纤维素或甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧化乙烯_聚氧化 丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和木蜡醇。对于所有施用，适当使用常规贮存形式。这类形式包 括例如，微胶囊、纳米胶囊、脂质体、硬膏剂(plaster)、吸入形式、鼻喷雾剂、舌下片剂和持 续释放制剂。待用于体内施用的制剂应该是无菌的。这可以通过在冻干并重建之前或之后过滤 透过无菌过滤膜而容易地实现。所述制剂如果系统施用则可以以冻干形式或溶液储存。如 果为冻干形式，通常将其与用于利用适当稀释剂在使用时重建的其它成分组合配制。液体 制剂的实例是用于皮下注射的填充于单剂量管内的无菌澄清无色的未经防腐处理的溶液。通常将治疗制剂置于具有无菌通入端口的容器内，例如，静脉内溶液袋或具有可 由皮下注射针头刺穿的瓶塞的管。优选将所述制剂作为静脉内(i.v.)、皮下(S. C.)、肌 内(i.rn.)反复注射剂或输注剂或者作为适于鼻内或肺内输送(对于肺内输送参见例如EP 257，956)的气雾剂制剂施用。本文公开的分子还可以以持续释放制剂形式施用。持续释放制剂的合适实例包 括含有蛋白的固体疏水性聚合物半透基质，该基质为成型物品形式，例如膜或微胶囊。持 续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，如Langer等，J. Biomed. Mater. Res. ,15 167-277(1981)和 Langer，Chem. Tech. , 12 98-105 (1982)所述的聚(甲基丙烯酸 2-羟基 乙酯，或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利第3，773，919号、EP 58，481)、L_谷氨酸与L-谷 氨酸Y -乙酯(Sidman等，Biopolymers，22 :547_556 (1983))、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯 (Langer等，见上)、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(例如，Lupron Depot (由乳酸-乙醇酸共
22聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133，988)。融合蛋白的制备本发明的融合蛋白可以在任何合适的标准蛋白表达体系中通过在可表达所述融 合蛋白的条件下对用编码所述融合蛋白的载体转化的宿主进行培养来表达。优选的使，所 述表达体系是其中可以容易地将所需蛋白分离并在体外重折叠的体系。一般而言，优选原 核生物表达体系，因为可以获得较高的蛋白产量并且可实现有效纯化和重折叠策略。因此， 适当的表达体系(包括载体和细胞类型)的选择是在本领域技术人员所了解的。同样，一 旦选定用于本发明的融合蛋白的原始氨基酸序列，则本领域技术人员可考虑到如选定宿主 中的密码子偏好、宿主中对分泌信号序列的需要和信号序列内蛋白酶切割位点的引入等因 素，而能容易地设计适当的编码所需氨基酸序列的重组DNA构建体。本发明的MBP/DC-SIGN蛋白的表达可以通过在适当条件下培养含有所述核酸的 重组宿主细胞而便利地实现。因此，不经过多实验而选择适当的或最佳的表达体系完全在 本领域资深技术人员的能力和裁断之内。同样地，一旦选定用于本发明的多肽的原始氨基 酸序列，则本领域技术人员可考虑到如选定宿主中的密码子偏好、宿主中对分泌信号序列 的需要和信号序列内蛋白酶切割位点的引入等因素，而能容易地设计适当的编码所需蛋白 的多核苷酸(例如，重组DNA构建体)。可以将这些重组DNA构建体于框架内插入适于所选 定的宿主的多种表达载体的任何一种内。对适当或最佳的表达载体的选择仍然完全在本领 域技术人员的能力和裁断之内。在某些实施方式中，表达载体将包含强力启动子以便驱动 重组构建体的表达。在一个实施方式中，可以施用合适的本领域内公知的标准步骤来分离本发明的 MBP/DC-SIGN融合蛋白，并在必要时对其进行例如冻干等其它加工。在一个实施方式中，所述分离多核苷酸编码包含融合蛋白的多肽。在一个实施方 式中，所述分离多核苷酸编码具有效应子功能的MBL多肽和包含靶向序列的第二多肽。在 某些实施方式中，所述多肽在单个连续多核苷酸序列(基因融合物(genetic fusion))中 编码。在其它实施方式中，多肽由非连续多核苷酸序列编码。因此，在某些实施方式中，将 所述多肽作为单独的多肽表达、分离和纯化并融合在一起而形成本发明的融合蛋白。可以将这些重组DNA构建体于框架内插入适于所选定的宿主的多种表达载体的 任何一种内。在某些实施方式中，表达载体包含控制重组融合蛋白构建体的表达的强力启 动子。当采用重组表达策略来生成本发明的融合蛋白时，可以使用合适的本领域公知的标 准步骤来分离和纯化所得融合蛋白，并在必要时对其进行进一步加工，例如冻干。可以将标准技术用于制备重组DNA分子、蛋白和融合蛋白，以及用于组织培养 禾口细胞转化。参见例如，Sambrook 等(见下)或 Current Protocols in Molecular Biology [Ausubel 等编著，Green Publishers Inc.和 Wiley and Sonsl994]。纯化技术 通常根据制造商说明书或者如本领域内通常完成的那样使用如Sambrook等[Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NY (1989)]所述或如本文所述的常规程序进行。除非提供具体定义，否则与实验室 程序相关联使用的命名以及本文所述的与分子生物学、生物化学、分析化学和药物/制剂 化学相关的技术都是本领域中公知且常用的。可以使用标准技术来进行生物合成、生化分 析、药物制备、配制和输送以及治疗患者。
可以理解，可以在必要时将柔性分子连接子插入融合蛋白的第一多肽与第二多肽 之间并将它们共价连接。在某些实施方式中，所述连接子包含约1 20个氨基酸残基的多 肽序列。所述连接子可以少于10个氨基酸，最优选的是5、4、3、2或1个氨基酸。在某些情 况下，所述连接子可以适当地为9、8、7或6个氨基酸。在某些实施方式中，所述连接子基本 为非免疫原性的，不易于受到蛋白酶切割并且不包含已知会与其它残基相互作用的氨基酸 残基(例如，半胱氨酸残基)。下述说明也涉及与一个或多个化学基团共价相连(下文称“轭合”)的融合蛋白和 三聚复合物的制备方法。适用于此类轭合物中的化学基团优选没有显著毒性或免疫原性。 必要时对所述化学基团进行选择以产生能在适于储存的条件下被储存并使用的轭合物。能 与多肽轭合的多种示例性化学基团是本领域内已知的并且包括例如糖(例如糖蛋白上天 然存在的那些糖)、聚谷氨酸酯/盐和非蛋白质聚合物(例如，多元醇)(参见例如，美国专 利第 6，245,901 号)。可以将例如多元醇与本发明的融合蛋白在包括赖氨酸残基的一个或多个氨基酸 残基处轭合，如WO 93/00109中所公开。所用多元醇可以为任何水溶性聚(亚烷基氧化物) (poly(alkylene oxide))聚合物并且可以具有直链或支链。合适的多元醇包括在一个或多 个羟基位置处由具有1 4个碳原子的化学基团(例如，烷基)取代的那些多元醇。通常， 多元醇为聚(亚烷基二醇)，例如聚乙二醇(PEG)，且因而为了便于描述，余下的讨论涉及其 中所用多元醇为PEG的示例性实施方式，且多元醇与多肽的轭合过程被称为“聚乙二醇化 (pegylation) ”。然而，本领域技术人员可认识到，可以使用如上文对于PEG所述的轭合用 技术来采用例如聚丙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物等其它多元醇。聚乙二醇化所采用的PEG的平均分子量可以有所不同，通常为约500 约30，000 道尔顿(D)。优选的是，PEG的平均分子量为约1，000D 约25，000D，且更优选为约 1，000D 约5，OOOD0在一个实施方式中，采用平均分子量约为1，000D的PEG来进行聚乙二 醇化。必要时，PEG均聚物可以没有取代基，但其也可在一个末端用烷基取代。优选的是，该 烷基为Cl C4烷基，且最优选为甲基。PEG制剂可商购，且通常适用于本发明的那些PEG 制剂是根据平均分子量销售的非均一制剂。例如，商购PEG(5000)制剂通常含有分子量稍 有变化(通常为士500D)的分子。还可以使用本领域已知的技术对本发明的融合蛋白进行 进一步修饰，例如与小分子化合物轭合(例如，化学治疗剂)；与单个分子轭合(例如，荧 光团)；与特异性结合对的分子轭合(例如，生物素/抗生物素链霉蛋白、抗体/抗原)；或 通过糖基化、聚乙二醇化或与稳定化域(例如，Fc域)进一步融合而稳定化。用于使蛋白聚乙二醇化的各种方法是本领域内已知的。制备与PEG轭合的蛋白的 具体方法包括美国专利第4，179，337号、第4，935，465号和第5，849，535号中所述的方法。 通常，主要取决于反应条件、聚合物分子量等，蛋白经由蛋白的一个或多个氨基酸残基与聚 合物上的末端反应性基团共价键合。带有反应性基团的聚合物在本文中被指定为活化聚合 物。反应性基团与蛋白上的游离氨基或其它反应性基团选择性地反应。PEG聚合物能与蛋 白上的氨基或其它反应性基团以随机方式或位点特异性方式偶合。然而，可以理解，为获取 最佳结果，所选的反应性基团的类型和数量以及所用聚合物的类型将取决于所用的具体蛋 白或蛋白变异体，以避免使所述反应性基团与蛋白上过多的特别活性的基团反应。由于这 无法完全避免，根据蛋白浓度推荐通常采用0. 1 1000摩尔活化聚合物/摩尔蛋白、优选2 200摩尔活化聚合物/摩尔蛋白。对活化聚合物/摩尔蛋白的最终量进行平衡以维持 最佳活性，而同时如果可能的话优化蛋白的循环半衰期。此外，可以将其它延长半衰期的分子与MBL多肽的N端或C端连接，包括血清白蛋 白结合肽、IgG结合肽或与FcRn结合的肽。应该注意，本文中的小节标题仅用于组织目的，而不应被认为以任何方式对所描 述的主题进行限制。出于各种目的将本文引用的所有参考文献通过参考并入其全部内容。下文的实施例仅是对本发明的某些实施方式进行说明，而不应被视为限制本发 明，本发明由所附权利要求限定。实施例实施例1 标记和未标记的MBP-⑶209 CTLD融合蛋白表达质粒克隆体在HEK293 细胞中的构建和表达DC-SIGN(树突状细胞特异性ICAM-3结合非整合素)是属于C型凝集素家族的II 型跨膜蛋白。该蛋白在树突状细胞(DC)的表面在周边表达并且通过T细胞上的ICAM-3参 与淋巴系统中的抗原呈递细胞与静息T细胞之间的初始接触。DC-SIGN在DC向淋巴组织迁 移期间还与上皮细胞上的ICAM-2相互作用。DC-SIGN还与HIV包膜蛋白gpl20牢固结合 并促进反式CD4+T细胞中的病毒感染。DC-Sign蛋白由短氨基末端细胞质尾部、跨膜域、至 多71/2重复片段的茎部以及其后的C端C型糖识别域(CRD)组成。所述茎部促进四聚体 (卷曲螺旋)的形成。DC-SIGN与包含Lex和Ley)的含甘露糖和含岩藻糖的复合糖轭合物 结合。与大多数其它凝集素相反，DC-SIGN与糖结构的内部部分结合，可能会增加该支架获 得更多样化和特异性的糖结合的可能性。一系列代表MBP信号序列的融合构建体，其后为富含半胱氨酰基的寡聚域、胶 原重复区、代表MBP颈部区与DC-SIGN CTLD融合的各种衍生物。使用一系列质粒分 别对编码不同 MBP/DC-SIGN CTLD 融合蛋白(MBP/DC-SIGN CTLD-ABs (SEQ ID NO 1)、 MBP/DC-SIGN CTLD-ACs (SEQ ID NO 3), MBP/DC-SIGN CTLD-ADs (SEQ ID NO :5)、MBP/ DC-SIGN CTLD-ABsC(SEQ ID NO 7), MBP/DC-SIGN CTLD-ACsC (SEQ ID NO :9)、MBP/ DC-SIGN CTLD-ADsC (SEQ ID NO 11), MBP/DC-SIGN CTLD-FE (SEQ ID N0:13)、MBP/ DC-SIGN CTLD-GE (SEQ ID NO : 15)、MBP/DC-SIGN CTLD-HE (SEQ ID NO : 17)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSG(SEQ ID NO 19),MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGS(SEQ ID NO 21),MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGGS(SEQ ID NO 23),MBP/DC-SIGN CTLD-ABsO(SEQ ID NO :25)和MBP/DC-SIGN CTLD-ABsC0(SEQ ID N0:27))的插入物的核苷酸序列进行克隆并插入特异性寡核苷酸 引物，如表 1 所示。MBP/DC-SIGN CTLD-ABs、MBP/DC-SIGN CTLD-ACs 和 M[BP/DC-SIGN CTLD-Ads 含有于 C 端截短的 DC-SIGN CTLD 域；MBP/DC-SIGN CTLD-ABsC、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsC 和 MBP/DC-SIGN CTLD-ADsC 含有全长 DC-SIGN CTLD 域；MBP/DC-SIGN CTLD-FE, MBP/DC-SIGN CTLD-GE 和 MBP/DC-SIGN CTLD-HE 含有 N 端和 C 端 DC-SIGN CTLD 域；而 MBP/ DC-SIGN CTLD-ACsCSG、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGS 和 MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGGS 含 有在DC-SIGN CTLD域的N端处的丝氨酸-甘氨酸插入物。其后将所述构建体使用GENETIC 3700分析仪验证并用BIG DYE 3.0版测序程序(Applied Biosystems)进行测序。表1 使用连续寡核苷酸组装体和亚克隆策略将能够表达融合蛋白MBP/DC-SIGN CTLD-ABs(SEQ ID NO :2)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACs(SEQ ID NO :4)、MBP/DC-SIGN CTLD-ADs(SEQ ID NO 6) , MBP/DC-SIGN CTLD-ABsC(SEQ ID NO :8)、M[BP/DC-SIGN CTLD-ACsC (SEQ ID NO : 10)、MBP/DC-SIGN CTLD-ADsC (SEQ ID NO : 12)、MBP/DC-SIGN CTLD-FE (SEQ ID NO : 14)、MBP/DC-SIGN CTLD-GE (SEQ ID NO : 16)、MBP/DC-SIGN CTLD-HE SEQ ID NO : 18)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSG (SEQ ID NO :20)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGS (SEQ ID NO 22)和 MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGGS (SEQ ID NO 24)的均 在其氨基末端用myc标记和His标记用myc标记和His标记进行标记的克隆体、以及两 种未经标记的融合蛋白衍生物 MBP/DC-SIGN CTLD-ABsO (SEQ ID NO :26)和 MBP/DC-SIGN CTLD-ABsCO (SEQ ID NO :28)构建于商购表达质粒 pcDNA3. 1 (Invitrogen)内，从而产生 所得质粒pMBP/DC-SIGN CTLD-ABs、pMBP/DC-SIGN CTLD-ACs, pMBP/DC-SIGN CTLD-ADs,pMBP/DC-SIGN CTLD-ABsC、pMBP/DC-SIGN CTLD-ACsC、pMBP/DC-SIGN CTLD-ADsC、pMBP/ DC-SIGN CTLD-FE, pMBP/DC-SIGN CTLD-GE, pMBP/DC-SIGN CTLD-HE, pMBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSG、pMBP/DC-SIGN CTLD_ACsCSGGS、pMBP/DC-SIGN CTLD_ACsCSGGGS、pMBP/ DC-SIGN CTLD-ABsO和MBP/DC-SIGN CTLD_ABsC0。将质粒转化至大肠杆菌XL-I蓝色细胞 (Stratagene)内以进行质粒增殖和对插入物的核苷酸序列验证。使用Qiagen MAXI PREP maxi pr印程序来分离用于转染至人胚胎肾细胞 (HEK293细胞)内的质粒DNA。最初，仅将标记的MBP/DC-SIGN CTLD融合蛋白衍生物转染并 对表达进行分析。使用阳离子脂质体(lipofectamine)方案(Invitrogen)转染细胞。将 所有构建体成功地瞬时转染，并在4日后分析培养物上清液的结合与人血清白蛋白(HSA) 偶合的固定Lewis肿瘤抗原y (Ley)或者表达人乳腺癌细胞系SKBR-3的Ley的能力。实施例2 与固定HSA-Ley或表达人乳腺癌细胞系SKBR-3的细胞的Ley结合的各 种标记的MBP-⑶209CTLD融合蛋白的分析在瞬时表达4日后，对来自用标记的MBP/DC-SIGN CTLD表达质粒(pMBP/DC-SIGN CTLD-Abs、pMBP/DC-SIGN CTLD-ACs, pMBP/DC-SIGN CTLD-ADs, pMBP/DC-SIGN CTLD-ABsC、 pMBP/DC-SIGN CTLD-ACsC、pMBP/DC-SIGN CTLD-ADsC、pMBP/DC-SIGN CTLD-FE, pMBP/ DC-SIGN CTLD-GE和pMBP/DC-SIGN CTLD-HE)转染的HEK293细胞培养物的上清液进行分 析，所述分析针对其结合与人血清白蛋白(HSA)偶合的固定Ley或者表达人乳腺癌细胞系 SKBR-3 的 Ley 的能力。还对 MBP/DC-SIGN CTLD Abs 禾口 MBP/DC-SIGN CTLD ABsC 融合蛋白 进行测试，所述测试针对其与MCF-7人乳腺癌细胞、LNCap前列腺癌细胞和A431皮肤上皮 鳞状癌细胞结合的能力。在第一个测试中，将PBSdOmM 磷酸钠，pH7. 4，IOOmM NaCl)中的 0. 5 μ g Ley-HSA (IsoSep, Uppsala,瑞典)/孔温育过夜并在96孔ELISA盘中固定。在洗涤除去未结 合的Ley-HSA并阻断后，分析100 μ L的每种培养物上清液在ELISA测试中的结合(图3Α、3Β 和3C)。使用商购DC-SIGN CTLD Fc融合蛋白(R&D systems)作为正对照，使用抗DC-SIGN 小鼠单克隆抗体克隆体MR-I (Abeam)、接着用HRP轭合的抗小鼠IgG抗体进行检测。融合蛋白MBP/DC-SIGN CTLD ACs,MBP/DC-SIGN CTLD ACsC 禾口 MBP/DC-SIGN CTLD ADs 显示出最强的结合，MBP/DC-SIGN CTLD Abs、MBP/DC-SIGN CTLD ABsC 和 MBP/DC-SIGN CTLD ADsC显示出适中的结合，而剩余融合蛋白未显示出结合(图3A、3C)。将MBP/DC-SIGN CTLD ACsC融合蛋白的结合与商购DC-SIGN CTLD Fc化合物的结合进行比较(图3B)。发 现结合具有特异性和钙依赖性。在另一个测试中，将表达Ley的SKBR-3或MCF-7细胞的半汇合培养物(分别在 370C和5 %的CO2生长于补充有10 %胎牛血清和1 % Pen/Strep的McCoy或DMEM培养基 中)从塑料表面刮下，用BSA洗涤并阻断，并与表达每种MBP-DC-SIGN CTLD融合蛋白或 纯化融合蛋白的培养物上清液一起温育1小时。仔细洗涤后，在悬浮相ELISA测试中确定 结合的融合蛋白的量(图4A 4C)。将商购融合蛋白DC-SIGN/Fc(R&D systems)包括在内 作为正对照。使用抗DC-SIGN小鼠单克隆抗体克隆体MR-I (Abeam)、接着使用HRP轭合的抗 小鼠IgG抗体进行检测。对于LNCap和A431癌细胞系而言，细胞在Nunclon 96-盘上分别在含有10% FBS 和Pen/Strep的RPMI和DMEM培养基中生长至70%汇合。在将细胞洗涤和阻断后，将其与纯化MBP-DC-SIGN CTLD融合蛋白一起温育1小时。仔细洗涤后，在ELISA测试中确定 结合的融合蛋白的量(图4A 4C)。将商购融合蛋白DC-SIGN/Fc (R&D systems)包括在内 作为正对照。使用抗DC-SIGN小鼠单克隆抗体克隆体MR-I (Abeam)、接着使用HRP轭合的抗 小鼠IgG抗体进行检测。融合蛋白MBP/DC-SIGN CTLD Abs 禾口 MBP/DC-SIGN CTLD ABsC 显示出最强的与 SKBR-3细胞的结合(图4A)，且据显示结合具有对Ley的特异性和钙依赖性(图4B)。图 4C中显示了对与MCF-7细胞结合的融合蛋白MBP/DC-SIGN CTLD Abs和MBP/DC-SIGN CTLD ABsC的评估。实施例3 使用甘露聚糖_琼脂糖亲和色谱的MBP/DC-SIGN CTLD衍生物纯化用超螺旋或线形化质粒DNA和不同浓度的质粒DNA转染HEK293细胞，从而建立表 达 MBP/DC-SIGN CTLD Abs、MBP/DC-SIGN CTLD ABsC 或 MBP/DC-SIGN CTLD ABsCO 融合衍生 物的稳定克隆细胞系以及表达MBP/DC-SIGN CTLD ABsO融合衍生物的稳定细胞系群。通过 在各种浓度接种细胞和使用博来霉素增加选择压力而获得稳定细胞系。繁殖数种克隆体， 并用实施例2所述的固定Ley HSA ELISA测试来分析培养物上清液的融合蛋白生产。如 以下段落所述，使用甘露聚糖_琼脂糖对来自稳定转染的克隆体的上清液的MBP/DC-SIGN CTLD衍生物进行亲和纯化。将MBP/DC-SIGN CTLD表达上清液(约2. 5L)过滤，供以250mL的10 X TBSC缓冲 液(1 XTBSC =IOmM Tris-HCl pH 7. 5，150mM NaCl, 2mMCa2+)，并在 4°C 以 0. 5mL/ 分钟施加 于25mL甘露聚糖-琼脂糖柱(Sigma)。施加后，将柱用2倍柱体积的IXTBSC洗涤，并用 lXTBS、5mM EDTA洗脱。向洗脱的蛋白组分中添加氯化钙至5mM并以500体积的IXTBSC 缓冲液透析。通过光谱(A28tl)确定蛋白浓度，并通过SDS-PAGE分析验证纯度。MBP/DC-SIGN CTLD Abs 和-ABsC 的洗脱曲线不相似(图 5)。MBP/DC-SIGN CTLD Abs作为一个尖峰洗脱，而ABsC作为两个峰洗脱，前一个峰小于后一个峰。两个洗脱曲线都 具有较陡的前沿和较长的尾部。从2. 5L培养物上清液中分离了 2mg的每种衍生物，纯度据SDS-PAGE分析判断> 90% (图6A 6B)。在每种情形中，融合蛋白的浓度在峰组分中为300 μ g/mL 660 μ g/ mL。在使用DC-SIGN特异性小鼠单克隆抗体克隆体MR-I (Abeam)通过3% 8%梯度的 SDS-PAGE分离的非还原样品的蛋白印迹上分析所分离的衍生物的寡聚曲线(图7)。实施例4 与商购(DC-SIGN)2-Fc衍生物的结合相比的MBP/DC-SIGN CTLD Abs 和-ABsC衍生物与固定Ley-HAS的结合的分析将带有固定于微滴定板中的孔中的Ley偶合HAS的ELISA测试显影，以分析与来自 R&D Systems 的二价 DC-SIGN Fc 衍生物相比的 MBP/DC-SIGN CTLD Abs 和-ABsC 衍生物的
结合强度。在96孔ELISA盘的每个孔中添加在PBS (IOmM磷酸钠pH 7. 4, IOOmM NaCl)中的 0. 5mg Ley-HSA (IsoS印)，将其温育过夜并固定。洗掉未结合的Ley-HSA并阻断后，在每孔中 添加在 100 微升的 IX TBSC 中的 MBP/DC-SIGN CTLD Abs、_ABcC 或(DC-SIGN) 2_Fc 的连续稀 释液，并在ELISA测试中分析其结合。使用抗DC-SIGN小鼠单克隆抗体克隆体MR-I (Abeam)、 接着用HRP轭合的抗小鼠IgG抗体进行检测。来自比较分析的典型结果如图8所示，该图 展示了 MBP/DC-SIGN CTLD融合物(正方形)相对于Fc/DC-SIGN融合物(菱形)的结合的
28增加。实施例5 使用D-甘露糖琼脂糖亲和色谱的MBP/DC-SIGN CTLD衍生物纯化通过在D-甘露糖_琼脂糖基质上的亲和纯化来从稳定转染的克隆体的上清液分 离MBP/DC-SIGN-CTLD衍生物，接着通过在Source 15Q柱上的离子交换色谱进行进一步纯 化(“精制步骤”)。对MBP/DC-SIGN CTLD表达上清液给予10XTBSC缓冲液至最终1 XTBSC(10mM Tris-HCl pH 7. 5,150mM NaCl,2mM Ca2+)，并在 4°C流经 D-甘露糖-琼脂糖柱。D-甘露 糖_琼脂糖基质通过遵循标准方案将D-甘露糖与经二乙烯基砜激活的琼脂糖6-BC1偶合 而制备。施加后，将柱用2倍柱体积的IX TBSC洗涤，并用IX TBS、5mM EDTA洗脱。向洗脱 的蛋白组分添加CaCl2至5mM并以5 10倍体积的1 X TBSC缓冲液进行透析。洗脱后，添加 Tween 80至1 % (重量/体积比)并添加三正丁基磷酸盐至0. 3 % (重量/体积比)，然后 让洗脱的物质在室温静置6小时，从而实现使潜在病毒失活。在通过离心澄清后，将所述物 质加样至IXTBSC中的Source 15Q柱上。一旦加样后，将柱用5倍柱体积的15mM Na2HPO4 pH 8. 0,25mM NaCl冲洗。用15mM Na2HPO4 pH 8. 0,25mM NaCl将柱梯度洗脱。将洗脱的蛋 白渗滤至IOmM NaPO4 pH 7. 5, IOOmM NaCl中。然后通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，并通过 光谱(A28tl)确定浓度。实施例6 由C4切割监测的固定Ley-HAS上的补体溶血的启动的分析在补体激活测试中对如实施例3或实施例5所述而制备的纯化的MBP/DC-SIGN CTLD ABs和-ABs衍生物进行了测试。该测试是对MBL/DC-SIGN CTLD/MASP复合物在与 HSA-LeY结合时启动C4切割的能力的定量测定。其后通过抗C4抗体对沉积的C4片段进行定量。将微滴定板用PBS中的5 μ g/mL HSA-LeY过夜涂布。洗去过量抗原后，将板用 TBSdOmM Tris-HCl ； 140mM NaCl ；pH7，4)中的0. BSA封闭。将MBP/DC-SIGN CTLD与MBL 结合缓冲液(20mM Tris-HCl ；IOmM CaCl2 ；IMNaCl,0. 05% TritonX-IOO ；0. 1%BSA ；pH7，4) 中的2% MBL缺乏人血清(State Serum Institute，Copenhagen，丹麦)复合并使其在4°C 结合过夜。将板温和化(temperated)并洗涤。向孔中添加5 μ g/mL人C4蛋白(Quidel)， 温育1. 5小时。将孔洗涤，然后在ELISA测试中用多克隆抗C4抗体(DAKO)接着用HRP轭 合的抗兔Ig抗体(DAKO)对切割的C4片段进行检测(图9)。实施例7 :由C4切割监测的上皮癌细胞的补体溶血的启动的分析在标准补体激活测试中对如实施例3或实施例5所述而制备的纯化的MBP/ DC-SIGN CTLD ABs和-ABsC衍生物进行了测试。该测试是对MBL/DC-SIGN CTLD/MASP复合 物在与上皮癌细胞上的LeY肿瘤抗原结合时启动C4切割的能力的定量测定。其后通过抗 C4抗体对沉积的C4片段进行定量。使细胞生长至70%汇合并从塑料板上刮下。在0. 5% BSA/TBSC缓冲液中洗涤 并预阻断(preblocking)后，将细胞重悬于缓冲液中然后使其在室温结合2小时，该缓冲 液含有与0. 5% BSA/1XTBSC缓冲液中的2% MBL缺乏人血清(State Serum Institute, Copenhagen,丹麦)复合的MBP/DC-SIGN CTLD。将细胞在0. 5% BSA/TBSC缓冲液中洗涤 并在人C4中(0. 5% BSA/TBSC中为5 μ g/mL)重悬，并在室温温育1小时。将细胞再次洗 涤，然后在悬浮物ELISA测试中用多克隆抗C4抗体(DAKO)接着用HRP轭合的抗兔Ig抗体(DAKO)对切割的C4片段进行检测(图10)。实施例8 :MBP/DC-SIGN CTLD衍生物或单克隆抗体对上皮癌细胞增殖的抑制的分 析将乳腺癌细胞系SKBR-3和MCF-7以5000细胞/孔在37°C和5% CO2接种于分别 在McCoy和DMEM培养基(含有10 % FBS和1 % Pen/Strep)中的Nunclon 96孔盘中。向 细胞添加 MBP/DC-SIGN-ABs、MBP/DC-SIGN-ABsCO、MBP/DC-SIGN-ABsCO (+5 μ g/mL 赫赛汀)、 赫赛汀和缓冲液对照，并让细胞在37°C和5% CO2生长2天或5天。使用实施例5所述的 方案将MBP/DC-SIGN衍生物分离。其后用比色测试(CellTiter 96Aque0us非放射性细胞 增殖测试)根据制造商使用说明(Promega)对存活细胞数进行测定。5日后的测试结果如 图11所示。上文给出的实施例仅为说明性，而非意图作为本发明的所有可能的实施方式、应 用方式或改进方式的穷尽列举。因此，在不背离本发明的范围和主旨的情况下，本发明所述 方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言都是显而易见的。尽管已经结合具 体实施方式对本发明进行了描述，但应该理解的是所要求的发明不应被过分限制于这些具 体实施方式。事实上，对于分子生物学、免疫学、化学、生物化学或其它相关领域的技术人员 显而易见的对本发明的所述实施方式的各种修改都应该属于所附权利要求的范围之内。可以理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因为本领域资深技 术人员可以认识到这些方法、方案和试剂等可以有所不同。还应理解，本文所用的术语仅用 于描述具体实施方式
的目的，而并非旨在限制本发明的范围。参考所述非限制性实施方式，本发明的实施方式及其各种特点和有利细节得到了 更全面的说明，和/或在附图中得到图解，以及在以上描述中得到具体说明。应该注意，附 图中图示的特点不一定是按比例绘制的，且即使没有在本文中明确声明，本领域资深技术 人员仍可以认识到可以将一个实施方式的特点用于其它实施方式。本文叙述的任何数值包括以一个单位为增量的从较低值到较高值的所有值，条件 是在任何较低值和任何较高值之间存在至少两个单位的分隔。例如，如果据陈述某组分的 浓度或某过程变量(例如，尺寸、角度大小、压力和时间等)的值为例如1 90、特别是20 80、更特别是30 70，则应该预期如15 85、22 68、43 51、30 32等值均明确被列 举于本说明书中。对于小于1的值而言，一个单位可以在必要时被认为是0.0001、0.001、 0.01或0. 1。这些仅是所具体预期的数值的实例，而处于所列举的最低值和最高值之间的 数值的所有可能组合都应被认为以相似方式在本申请中被明确说明。对具体方法、装置和材料进行了描述，但与本文所述的那些方法和材料相似或等 同的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明。本文通过参考并入本文所引用的所有 参考文献和出版物的全部公开内容，其程度等同于通过参考将每一个单独并入。
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权利要求
一种融合蛋白，所述融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含具有效应子功能的甘露糖结合凝集素(MBL)多肽，而所述第二多肽包含与细胞表面或病毒结合的靶向序列，其中所述第一多肽不包含活性MBL C型凝集素样域(CLTD)。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述靶向序列与选自肿瘤细胞、免疫细胞、细菌 细胞、原生动物、真菌和受病毒感染细胞的细胞表面上的受体结合。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述免疫细胞选自炎性免疫细胞和抑制性免疫 细胞。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述靶向分子是凝集素。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述凝集素是树突状细胞特异性ICAM-3结合非 整合素(DC-SIGN)。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含SEQID NO 49
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一多肽与MBP相关丝氨酸蛋白酶(MASP)纟口口。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述蛋白激活哺乳动物补体系统。
9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含具有环形区的CTLD，其中所 述环形区包含所述靶向序列，所述CTLD不是MBP CTLD。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，所述蛋白选自MBP/DC-SIGNCTLD-ABs (SEQ ID NO :2)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACs (SEQ ID NO :4)、MBP/DC-SIGN CTLD-ADs (SEQ ID NO: 6)、MBP/DC-SIGN CTLD-ABsC(SEQ ID NO 8), MBP/DC-SIGN CTLD-ACsC(SEQ ID NO: 10)、 MBP/DC-SIGN CTLD-ADsC (SEQ ID NO : 12)、MBP/DC-SIGN CTLD-FE (SEQ ID N0:14)、MBP/ DC-SIGN CTLD-GE (SEQ ID NO :16)、MBP/DC-SIGN CTLD-HE (SEQ ID NO : 18)、MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSG(SEQ ID NO 20),MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGS(SEQ ID NO 22),MBP/DC-SIGN CTLD-ACsCSGGGS(SEQ ID NO 24),MBP/DC-SIGN CTLD-ABsO(SEQ ID NO :26)和MBP/DC-SIGN CTLD-ABsCO(SEQ ID NO :28)。
11.一种激活哺乳动物补体系统的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用权利要求 1所述的融合蛋白。
12.—种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的融合蛋白和可药用赋形剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，所述药物组合物还包含化学治疗剂和治疗剂中 的至少一种。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述至少一种治疗剂包含抗体、激酶抑制 剂或癌疫苗中的至少一种。
15.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自雷替曲塞、阿霉素、紫 杉醇、5_氟尿嘧啶、伊立替康、顺钼、丝裂霉素C和奥沙利钼，且所述治疗剂是曲妥珠单抗。
16.一种治疗病原性疾病的方法，所述方法包括对罹患所述疾病的患者施用有效量的 权利要求11所述的药物组合物，其中所述靶向序列与病原体的细胞表面标记或受病毒感 染细胞上的标记结合。
17.一种治疗包括肿瘤细胞的增殖性疾病的方法，所述方法包括对需要所述治疗的患 者施用有效量的权利要求11所述的药物组合物，其中所述靶向序列与所述肿瘤细胞表面2上的标记结合。
18.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括对所述患者施用癌疫苗。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述受体包含Lewis抗原。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述靶向序列包含与Lewis抗原结合的DC-SIGN 多肽序列。
21.一种治疗受试对象中的癌症的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的 如权利要求11所述的药物组合物。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺 癌、肝癌、骨髓癌和上皮癌。
23.如权利要求1所述的融合蛋白，所述蛋白还包含四连接素三聚域。
24.一种分离核酸，所述分离核酸包含编码权利要求1所述的融合蛋白的序列。
25.如权利要求22所述的分离核酸，其中所述核酸选自SEQID NO=U SEQ ID NO :3、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO : 23、SEQ ID N0:25 禾口SEQ ID NO: 27。
26.—种表达载体，所述表达载体包含权利要求22所述的分离核酸。
27.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求24所述的表达载体。
28.一种用于制备权利要求1所定义的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在使所述融合蛋白得到表达的条件下表达权利要求22所述的分离核酸，和(ii)回收所述融合蛋白。
全文摘要
本发明提供了具有靶向诸如糖、脂质和或蛋白等与某些细胞类型和/或病原体结合的特异性部分的序列以及诱导效应子功能的序列的融合蛋白。本公开还提供了编码所述融合蛋白的核酸，以及包含本文所述的融合蛋白的药物组合物、使用方法以及诸如传染病、癌症、免疫相关病症和其它病患等病况或疾病的治疗方法。
文档编号C07K14/47GK101918439SQ200880124509
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月10日 优先权日2007年11月9日
发明者米凯尔·H·安德森, 索尔·L·霍尔蒂特, 迈克尔·埃策罗特, 马杰布里特·H·基尼布 申请人:阿纳福公司