重组人甘露聚糖结合型凝集素的制作方法

专利名称：重组人甘露聚糖结合型凝集素的制作方法
本申请是国际申请日为2000年5月10日，发明名称为“重组人甘露聚糖结合型凝集素”即中国专利申请00809713.5的分案申请。
本发明涉及制备含MBL的组合物的方法，还涉及免疫系统疾病和障碍的治疗，包括免疫防御系统内部缺陷的治疗。更具体而言，本发明涉及与感染易感性增加相关的甘露聚糖结合凝集素(MBL)缺陷或其潜伏状态的治疗。本发明进一步涉及编码人MBL的新表达构建体的制备，一种新的人MBL重组制剂，而且还包括在与免疫抑制性化疗等相关的状态和/或MBL缺陷状态(包括潜伏状态，即非即需)等病情的治疗方法中使用该化合物。所述的治疗针对人，以及免疫系统行为与人免疫系统相似的动物。
背景技术：
免疫系统包括一套复杂的识别和靶向病原微生物或其感染细胞的细胞和分子机制。最近，MBL作为先天免疫系统的重要组成部分很受关注，先天免疫系统是指在出生时就起作用的免疫系统，相反，适应性免疫防御只是在婴儿期获得其全部的保护身体的能力(Janeway等，1999)。依靠与微生物表面的碳水化合物结合，MBL介导补体系列成分的激活，即一系列的酶激活步骤，最终锁定目标以便通过吞噬或溶解微生物而破坏目标(Law和Reid，1995)。补体系统通过至少三个不同的途径激活，分别称为经典途径、替代途径和MB凝集素途径(Janeway等，1999)。经典途径以补体因子1(C1)识别表面结合的免疫球蛋白为起始。C1复合物由两种蛋白分解酶，C1r和C1s，以及具有免疫球蛋白识别结构域的非酶性部分C1q组成。C1q和MBL具有共同的结构特点，用电子显微镜观察时，这两种分子都具有花环样外型。与C1q相似，MBL也与两种蛋白分解酶，即甘露聚糖结合型凝集素相关蛋白酶(MASP)形成复合物。这三种途径均产生与激活表面即所靶定的微生物病原体表面结合的补体因子3的转换酶(C3转换酶)。C3向表面结合型C3b的转换在通过吞噬或溶解作用消除微生物病原体的过程中是关键步骤(Janeway等，1999)。
甘露聚糖结合型凝集素(MBL)，也称为甘露聚糖结合蛋白或甘露糖结合蛋白(MBP)，首先是在家兔中鉴定的(Kawasaki等，1978)。甘露聚糖结合型凝集素(MBL)属于一组可溶性Ca2+依赖性(C-型)凝集素，它们含有C-末端碳水化合物识别结构域和胶原样区域，后者以甘氨酸(Gly)及其后两个非甘氨酸氨基酸组成的重复三联体基序为特点。因此MBL属于胶原凝集素(collectin)，即具有胶原样区域的C-型凝集素，它还包括肺表面活性蛋白A和D以及共凝集素和CL-43，但是这些成分仅在牛群中得到鉴定(Holmskov等，1994)。人MBL蛋白由多达18个相同的32kDa多肽链组成(Lu等，1990)，每个多肽链包括21个氨基酸的短N末端片段，其中含三个半胱氨酸，其后是7个胶原基序Gly-X-Y重复序列，中间插入一个Gln残基，随后又是12个Gly-X-Y重复序列。一段小的34残基“颈区”将93个氨基酸的C末端Ca2+依赖性凝集素结构域与该分子的胶原区域结合(Sastry等，1989)。三个MBL多肽链结合成MBL亚单位。MBL由多达6个15nm MBL亚单位茎组成在底部结合的花环。后来在啮齿类动物(Miznuno等，1981；Oka等，1988)、牛(Holmskov等，1993a；Kawai等，1997)和鸡(Oka等，1985；Lauren等，1995；Laursen等，1998)中鉴定出了MBL。在啮齿类动物(Drickamer等，1986)和恒河猴(Mogues等，1996)中发现了两种类型的MBL基因，通常称为A型和C型。在大鼠中发现了MBL“B”假基因(Drickamer等，1986)，最近又从人基因组中克隆了MBL假基因，序列分析表明这是灵长类MBL-A基因的残迹(Guo等，1998)。人MBL是Kawasaki等在1983年发现的。目前仅鉴定出一个活性人MBL基因，它包括MBL基因中的四个外显子和三个间插内含子，长度约为6kb，位于10q11.2-q21(Sastry等，1989；Taylor等，1989)。
所述三条多肽链的胶原区域组成一个亚单位，通过二硫键使其稳定。通过二硫键以及非共价相互作用将各个亚单位结合(Lu等，1990)。
然而，这些二硫键的位置还没有完全确定。在非还原条件下MBL的SDS-PAGE分析中出现了表观分子量(m.w.)大于200kDa的条带，可能代表由3、4、5和甚至6个亚单位组装成的大分子(Lu等，1990)。
对于天然人MBL蛋白中亚单位的实际数目还存在争议。Lipsombe等(1995)通过应用超离心得到的数据表明25％的人血清MBL是由2-3个亚单位组成，只有很少一部分达到6个亚单位。通过经化学发光显示的Western印迹密度测定法，可进行相对定量。由于把高分子量蛋白转移到膜的效率低于低分子量蛋白，使得通过这种方法进行分析十分复杂。Lu等(1990)通过对离子交换层析的组分进行SDS-PAGE分析，发现主要的共价结合型MBL亚单位链是由四聚体组成，而只有五聚体或六聚体复合物可激活补体。相反，凝胶渗透层析(GPC)分析表明MBL的大小与C1复合物相当。可以在适当的条件下进行GPC，该条件允许对蛋白-蛋白的弱相互作用在MBL分子形成过程中的重要性进行研究，并联合标准的MBL分析对GPC组分中MBL含量进行无偏测定。
MBL的体内作用似乎主要作为介导一些抗微生物活性的体液因子与先天免疫系统相关，不需要成熟到可进行象T或B细胞识别为基础的适应性免疫防御系统那样的自身/非自身鉴别，如(Janeway等，1999；Vorup-Jensen等，1998)。MBL结合靶点的识别由C-型凝集素结构域介导。C型CRD在多种蛋白中发现，它们可能具有系统发生和功能前景意义。至于MBL，CRD优先识别带有平展的(equatorial)3-和4-OH基团的己糖，例如甘露糖和N-乙酰葡糖胺，而不与不符合这种空间需要的糖，例如半乳糖和D岩藻糖结合(Weis等，1992)。
末端CRD的结合方式应使得目标表面存在约53间距的结合位点以便与所有三个结构域结合(Sheriff等，1994；Weis和Drickamer，1994)。“模式识别”的这种特性使得可以进一步对微生物表面进行选择性结合。很明显，碳水化合物选择性是MBL自身/非自身区分的重要方面，并且其可能是由微生物表面上的甘露糖和N-乙酰葡糖胺优势程度的差异所介导，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)等酵母细胞壁中含大量甘露糖。哺乳动物蛋白糖基化中，糖结构通常以唾液酸结束，唾液酸可以阻止MBL与这些低聚糖结合，因此阻止了MBL识别“自身”表面。每个MBL亚单位的三聚体结构对目标识别可能也起重要作用。
通过利用体外合成体系，已经进行了一些MBL结构和生物合成方面的研究。通过结晶大肠杆菌产生的重组蛋白，确定(resolved)了大鼠MBL-A的CRD的结构(Weis等，1992)，通过利用重组材料，同样地确定了大鼠MBL-C的结构(Ng等，1996)。最近，通过表达“颈区”和CRD而组装的CRD三聚体的晶体结构证实了早期关于“颈区”通过盘绕的α螺旋之间的氢键将三条链聚集在一起的研究(Sheriff等，1994；Weis和Drickamer，1994)。同样在大肠杆菌系统中表达了其它胶原凝集素的CRD和“颈CRD”片段，它们不需要重折叠过程来获得功能活性。因此，可以在原核或简单的真核表达系统中即针对糖识别的功能特点又针对三聚作用的结构特点而进行有效的MBL结构域体外合成。
通过重组技术体外合成纯粹的胶原凝集素主要使用哺乳动物细胞系，例如CHO和COS细胞作为宿主细胞。在昆虫细胞中表达MBL的尝试仅产生低分子量的MBL(Ma等，1996)，重组蛋白几乎全部由MBL亚单位链的亚单位、二聚体和三聚体组成。
一些研究中已经报道了在哺乳动物细胞系中人MBL的重组合成。在关于MBL的调理功能(即增加巨噬细胞吞噬的功能)的研究中，Kuhlman等(1989)使用由CHO细胞产生的显示相同调理活性的rMBL作为天然MBL。没有对rMBL的结构和翻译后加工进行鉴定。同样，Schweinle等(1993)通过稳定转染CHO细胞，制备了rMBL和胶原尾缺陷的截短型rMBL。通过检测与MBL和消除了抗蒙德维亚沙门菌抗体的稀释人血清(作为补体来源)预温育后蒙德维亚沙门菌上的C3沉积，测定了该重组蛋白的活性。奇怪的是，虽然碘化rMBL的超离心分析表明大多数蛋白是低分子量物质，但重组全长MBL的活性与天然MBL的活性一样高。没有包括通过SDS-PAGE、超离心或GPC对CHO细胞产生的rMBL与天然MBL的大小进行的比较。在Super等(1992)等的研究中，给出了由小鼠Sp2/0Ag14杂交瘤细胞产生的rMBL的GPC谱，提示通过碳水化合物亲和层析从培养上清中纯化的rMBL的大小分布与通过抗MBL抗体亲和层析分离的rMBL的大小分布明显不同。
最近，Ohtani等(1999)发表了关于在CHO细胞中产生的人rMBL的资料，其产量为120μg每ml培养液。这是通过利用表达载体获得的，该表达载体允许通过G418抗性筛选转化体并允许通过甲硫氨酸硫代亚酰胺(methionine sulfoximine)筛选进行随后的基因扩增。有关糖选择性的功能活性与天然蛋白相同，然而当通过对细胞的裂解进行测定时，发现在激活补体的能力上存在一些差异。虽然作者指出总的大小分布与从血浆中纯化的MBL明显不同，GPC和SDS-PAGE分析均表明存在较高分子量的MBL。有趣的是羟基化形式与天然MBL基本相似，即使在不添加抗坏血酸时也是如此。关于翻译后加工，从本研究中应该指出rMBL的正确羟基化不能保证与天然MBL相似的结构。
人MBL基因座是多形态的，具有三个位于蛋白编码区的已知突变(Sumiya等，1991；Lipscombe等，1992a；1992b；Madsen等，1994)和影响该基因调节元件的其它突变(Madsen等，1995)。所有突变均明显导致受影响个体的体液中MBL水平显著较低。因而血清MBL浓度范围在蛋白编码区的突变为纯合型的个体中大约跨越三个数量级，从2-5μg MBL/ml到小于10ng MBL/ml。MBL缺陷与诊断为患有调理素缺陷的儿童的复发感染有关(Super等，1989；Sumiya等，1991)，这个发现强调了MBL水平不足与抗微生物防御功能降低之间的相关性。除了与微生物相互作用，胶原凝集素还表明可介导抗病毒防御(Hartshom等，1993；Malhotra等，1994)。关于与人类免疫缺陷病毒(HIV)的相互作用的体外研究表明，MBL抑制了对CD4阳性T细胞和U937细胞的感染。临床研究还表明，MBL具有作为抗HIV第一道防线的抑制感染的作用。从AIDS症状出现直到最后阶段的时间周期在MBL缺陷患者和MBL水平正常的患者之间似乎不同。另外，在MBL缺陷个体中该感染的易感性似乎显著提高，因为与健康对照组相比，MBL缺陷更经常出现在HIV感染患者中(Nielsen等，1995；Garred等，1997a)。遗传性补体缺陷可促成系统性红斑狼疮(SLE)的进展，这在C1、C2和C4缺陷的病历中已经显示(见Tan和Arentt的综述，1998)。虽然MBL的作用还不是非常清楚，一些研究表明MBL缺陷很可能是发生SLE的危险因子(Davies等，1995；Lau等，1996；Lp等，1998)。根据其它补体缺陷是SLE的成因的解释，我们认为由于MBL缺陷所致在补体固定中的缺陷导致免疫复合物的清除不好(Lp等，1998)，因而提出MBL参与保持内环境稳定。其它临床证据表明MBL在生殖生物学中起重要作用。最近的报道说明了习惯性流产和MBL水平之间的相关性(Kilpatrick等，1995；Christiansen等，1999)。
只有两个研究报道了以重建MBL途径为目标治疗有症状的MBL不足型个体的策略。对在一些儿童中发现的一种以反复临床显性感染为特征的调理素缺陷通过给药血浆进行治疗(Soothill和Harvey，1976)，而在最近的研究中，给两岁女童注射了血浆源性MBL(Valdimarsson等，1998)。在这两个研究中均报道了健康状态的改善，虽然在这些研究中涉及的患者人数少明显限制了关于MBL作为治疗药物的结论。rMBL尚未进行临床研究。Ma等(1999)的研究显示，rMBL在小鼠中通过病毒表达系统介导抗肿瘤活性。
如上所述，已经进行了几种尝试来在体外系统中表达与天然蛋白相同或高度相似的rMBL。然而，目前已知用于产生此rMBL的体外合成系统的能力已经被证实存在明显不足。
发明概述在一个方面，本发明提供了通过重组DNA技术在体外或体内制备的新型MBL。更具体而言，本发明涉及新型重组MBL(rMBL)，本发明人惊奇的发现其能够通过下述方法合成制备与天然人MBL大小分布谱至少有50％相同的人重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)组合物的方法，包括如下步骤-制备编码人MBL肽或其功能等价体的基因表达构建体，-用该构建体转化宿主细胞培养物，-培养该宿主细胞，从而使所述多肽表达并将其分泌到培养基中，随后，-利用碳水化合物衍生化基质将该培养基进行亲和层析，该碳水化合物衍生化基质对MBL的四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比对MBL亚单位的二聚体的亲和力至少高2倍。
-获得包括人重组MBL组合物的洗脱物。
人MBL的功能等价物是指具有人MBL功能，例如结合微生物碳水化合物，介导调理活性和/或激活补体的分子，这可以通过甘露聚糖包被型表面上的C4沉积证实。
MBL的功能活性通过其形成可激活补体系统的MBL/MASP复合物的能力可以判断。当C4被MBL/MASP切割时，活性硫醇酯被暴露并且C4与附近的亲核基团共价结合。因而相当量的C4b将与包被的塑料孔结合，并且可以用抗C4抗体进行检测。
针对MBL功能活性的定量TRIFMA由下述步骤组成1)用溶于100ml缓冲液的1mg甘露聚糖包被微滴定孔；2)用土温20封闭；3)加入待检样品，例如稀释的MBL制剂；4)加入MBL缺陷型血清(这导致MBL/MASP复合物的形成)；或者可以在加入到微滴定孔之前将MBL和MBL缺陷型血清混合；5)加入5mg/ml纯化的补体因子C4；6)37℃温育一小时；7)加入Eu标记的抗C4抗体；8)加入增强(enchancement)溶液；和9)通过时间分辨型荧光测定法(time resolved fluorometry)读取Eu。除了步骤8和9之间以外，在每个步骤之间将平板在室温下温育并洗涤。
可以类似地用ELISA进行评估，例如在步骤7中加入生物素标记的抗C4；8)加入碱性磷酸酶标记的亲和素；9)加入底物；10)读取颜色强度。利用一种选定的正常血清的各种稀释液，可以构建标准曲线。本发明使用了下述血清血浆库(pool)LJ6.5728/04/97。可以用MBL的比活性，例如每ng MBL的MBL活性单位，表示功能。
用于测定MBL功能等价体的另一种试验是测定与细胞上一或多种受体结合的能力。
用细胞荧光测定法，可以检测MBL与细胞上一或多种受体的相互作用。1)将浓度为50μg/mi的MBL与2×105个细胞共同温育。在含1％FCS和0.1％叠氮钠的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行结合。2)为了检测细胞结合型MBL，加入生物素化的抗MBL抗体；3)随后加入链霉亲和素-FITC和4)用荧光测定法检测混合物。
根据本发明的功能等效物满足至少一条上述标准，即激活C4或与细胞上的一或多种受体相互作用。在优选的实施方案中这两个标准均被满足。
“重组人MBL”是指由基因工程构建的核酸表达的人MBL，而“MBL基因表达构建体”是指适合于在宿主细胞中表达的表达载体。
术语“大小分布谱与天然人MBL至少有50％相同的组合物”是指各种MBL寡聚体在SDS-PAGE上的大小分布与用碳水化合物亲和层析从血浆中纯化的人MBL有50％相同。50％相同是指当用SDS-PAGE和/或Western印迹进行检测时，至少50％的寡聚体的表观分子量高于200kD。在测定表观分子量高于200kD的MBL的总量时，可以应用密度分析法，其中将SDS-PAGE凝胶上的蛋白条带用蛋白染色法，例如银染或考马斯亮蓝染色进行染色，或利用MBL特异性抗体进行Western印迹的特异性染色。
“纯化的重组MBL”是指用碳水化合物亲和层析法从培养上清或转基因动物体液或组织中纯化的重组MBL。
本发明提供了与天然人MBL形式相似的MBL，其纯化型的分子大小分布谱比目前已知的MBL更接近于天然人MBL。因而，本发明的另一个方面涉及包括MBL亚单位寡聚体的重组人MBL组合物，所述寡聚体的大小分布谱与天然血浆人MBL的大小分布至少有50％相同。
在本文中，术语“寡聚体”指MBL的各种聚合体，例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。单体由三个相同的肽链，即本文中称为亚单位的链组成。其它寡聚体是由2-6个亚单位组合而成。
至于rMBL的表达，本发明涉及编码重组人甘露聚糖结合型凝集素(MBL)多肽的基因表达构建体，其包括-至少一个来自人MBL或其功能等效物的内含子序列，-至少一个来自人MBL或其功能等效物的外显子序列，-与人MBL启动子不同的启动子区域，和-表达载体。
所述表达优选在例如哺乳动物细胞中进行，根据本发明的制剂通过使用包括MBL基因内含子序列和至少一个外显子序列的表达载体来获得。关于作为表达系统的转基因动物，这个术语在本文中是指经遗传修饰而含有并表达人MBL基因或其片段或其类似物的动物。
“在非变性条件下与天然人MBL结构特点相似的重组MBL”是指在凝胶渗透层析中与人血清MBL的洗脱相似的重组MBL。“具有在变性条件下与天然人MBL相似的结构特点的重组MBL”是指在SDS-PAGE上其大小分布与用碳水化合物亲和层析法从血浆中纯化的人MBL有50％相同的纯化MBL(见

图1)。因而，“重组MBL”是指基本上不含任何与从血浆中纯化的MBL天然相关之杂质的MBL。
在这点上，甘露糖连接的丝氨酸蛋白酶(MASP)不被认为是杂质。
因而，本发明的另一个方面涉及制备人重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)的方法，包括如下步骤-制备上述编码人MBL多肽或其功能等效物的基因表达构建体，-用该构建体转化宿主细胞，-培养宿主细胞，从而使该多肽得到表达并分泌到培养基中，随后-收获含人重组MBL的培养基。
本发明另一个方面涉及分离或纯化人MBL以获得大小分布与天然人MBL至少有50％相同的多肽组合物的方法。
因而本发明涉及分离大小分布与天然血浆MBL至少有50％相同的人MBL寡聚体组合物的方法，包括-获得人MBL寡聚体的制剂
-用碳水化合物衍生化基质将该制剂进行亲和层析，所述碳水化合物衍生化基质与MBL亚单位四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比与MBL亚单位二聚体的亲和力高2倍。
-获得含分离的人重组MBL组合物的洗脱物。
本发明的另一个方面涉及用于治疗癌症和例如免疫系统和生殖系统疾病和障碍的MBL，包括rMBL、其片段或其类似物，该治疗包括建立、重建、提高和/或刺激补体的调理和杀细菌活性，即提高免疫防御能力以识别和杀伤病原微生物。在该治疗中，应用与天然MBL相似的rMBL与应用已知的MBL尤其是血浆源性人MBL相比有很大的优点，因为用rMBL进行治疗大大降低了病毒感染的危险。
该治疗可以包括治愈和/或预防人或动物中需要治疗的癌症和例如免疫系统或生殖系统的疾病和障碍状态等疾病、障碍和/或病情，所述动物具有所述功能单位且其作用在这方面与其在人体中的作用相似。需要治疗的状态理解为与当前和/或预计需要或相关于改善正常状态的任何状态。该治疗尤其是对MBL缺陷状态的治疗。
本发明进一步包括含根据本发明制备的MBL的药用组合物。
本发明的另一个方面涉及在用于治疗的药物或药用组合物的生产中使用根据本发明制备的MBL，包括其片段或其类似物，所述治疗包括治愈和/或预防人或动物中需要治疗的例如免疫系统或生殖系统的疾病和障碍等病情，所述动物具有所述功能单位且其作用与其在人体中的作用相似。
所述需要用本发明的化合物治疗的疾病、障碍和/或状态包括例如治疗MBL缺陷状态，治疗与免疫抑制性化疗相关的癌症和感染，尤其包括那些与癌症治疗期间的状态相关或与器官植入和/或移植相关的感染。本发明还包括治疗与习惯性流产相关的病情。
发明详述免疫系统具有相当强的防止感染的能力，其对于内环境稳定并因此对生命的存活或维持起决定性重要作用。因而鉴定在这些过程中起作用的化合物是相当重要的。这十年的深入研究已经发现，甘露聚糖结合型凝集素(MBL)是非常多样化的大分子，例如认为其在先天免疫系统中具有活性。
如上所述，根据本发明制备大小分布谱与天然人MBL有50％相同的人重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)组合物是可能的。
根据上述方法制备MBL组合物并进行亲和层析以便使其他寡聚体与较高级MBL寡聚体分离。
将含各种MBL寡聚体的培养液在碳水化合物衍生化基质上进行亲和层析。
亲和层析是众所周知的从蛋白混合物中纯化蛋白的方法。碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比MBL亚单位二聚体高至少两倍。在优选的实施方案中，碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比对MBL亚单位二聚体的高至少三倍。另外，碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力可以比MBL亚单位至少高2倍。
从而提供了MBL组合物，其大小分布与天然MBL至少有50％相同，如60％相同，如70％相同，如80％相同，如90％相同，如95％相同。优选大小分布基本上与天然MBL相同，即至少99％相同。
碳水化合物衍生化基质基本上对MBL亚单位和/或其二聚体没有亲和力。优选碳水化合物衍生化基质基本上只对MBL亚单位四聚体、五聚体和/或六聚体具有亲和力。
优选亚单位的较高级寡聚体如四聚体、五聚体和/或六聚体在组合物中占优势。因而，优选在组合物中四聚体、五聚体和/或六聚体与亚单位和/或二聚体的比例为至少为2∶1，更优选至少5∶1。
在优选的实施方案中，优选四聚体、五聚体和六聚体的总数与亚单位和二聚体的总数之比至少为2∶1，更优选至少为5∶1。
基质可以用任何与MBL结合并优选与MBL的较高级寡聚体结合的碳水化合物或其混合物进行衍生化。优选该基质为己糖衍生化基质，例如甘露糖或N乙酰葡糖胺衍生化基质，最优选甘露糖衍生化基质。
通过确保碳水化合物衍生化基质本身即未衍生化的基质对MBL亚单位尤其对MBL三聚体或更小的寡聚体没有亲和力，可获得所述基质的选择性。在该基质本身没有糖类时，这可以被确保。该基质尤其不应该含有任何Sepharose或类似物。优选该基质由非含糖多聚体材料组成，例如FractogelTSK珠。该基质可以是适合于层析的任何形式，主要是珠状形式，例如塑料珠。
将培养液上样至层析柱后，优选用非变性缓冲液洗涤层析柱，该缓冲液具有导致排除蛋白的组成、pH值和离子强度并且不洗脱MBL高级寡聚体。这样的缓冲液可以是TBS。用能够有效洗脱较高级MBL寡聚体的选择性吸附剂，例如含EDTA(如5mM)或甘露糖(如50mM)等吸附剂的TBS，进行MBL洗脱，收集MBL寡聚体。
根据本发明，MBL基因序列可以来自人MBL基因或来自其它动物种类的MBL基因，其中该动物的免疫系统行为在这个方面与人免疫系统相似。在下述的实施例1中叙述了根据本发明制备重组MBL的优选实施方案实例，其中通过利用含人MBL基因序列的表达载体，制备该重组MBL。在所述制备方法的优选实施方案中的表达载体见实施例1和图2的说明。
本发明还涉及表达载体的利用，该载体包括人MBL基因序列的功能性衍生序列。所述功能性衍生序列是指包括不导致或基本上不导致表达载体功能差异的碱基对变化的序列，并且这种方法制备的MBL的功能与用含没有变化的人MBL基因序列的载体制备的MBL相当。
除了纯化方法之外，优选基因表达构建体和宿主细胞也有利于产生较高级寡聚体。
因此，基因表达构建体优选包括人MBL基因或其功能等效体的至少一个内含子序列。
而且所述基因表达构建体可以包括人MBL基因或其功能等效体的至少两个外显子。更优选所述基因表达构建体包括人MBL基因或其功能等效体的至少三个外显子。当包括一个以上外显子时，外显子序列的排列优选与人MBL基因中的相同。
虽然优选在该序列中包括内含子序列，但表达构建体包括编码MBL亚单位或其功能等效体的cDNA序列，对于一些应用可能是方便的。
本发明的特点是在哺乳动物细胞系或转基因动物中应用MBL基因表达构建体而不是cDNA构建体来表达rMBL，获得在非变性和变性条件下具有与天然人MBL相似的结构特点的重组MBL。“重组人MBL”是指由基因工程化核酸表达的人MBL，而“MBL基因表达构建体”是指适合于在哺乳动物细胞系中表达的表达载体，其包括人MBL基因或其他动物MBL基因的外显子序列和至少一个内含子序列，所述其他动物包括但不限于黑猩猩和恒河猴(rhesus monkey)。
优选所述DNA序列编码SEQ IN NO1所示多肽序列或如上限定的其功能等效序列。SEQ ID NO1对应于数据库登记号为P11226的MBL序列。所述等效序列可以通过修饰SEQ ID NO1所示多肽序列而获得，如具有对应于本发明上述序列的特点，但其中一或多个氨基酸已被具有相似特性的其它氨基酸替代的序列。功能等效序列优选包括保守替代，即一个或多个氨基酸被具有相似特点的氨基酸替代，使蛋白化学领域的技术人员可以预测未改变的蛋白的二级结构和三级结构。适合于保守替代的氨基酸包括那些具有功能上相似的侧链的氨基酸。例如，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸等疏水性残基可以替代另一个这样的残基。同样，保守替代可以包括亲水性残基(例如精氨酸和赖氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，苏氨酸和丝氨酸)之间、碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸和组胺酸)之间和/或酸性残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)之间的互换。只要能保持所述多肽的功能，还可以(或者可以)通过氨基酸的缺失或插入或者氨基酸的化学修饰对功能等效序列进行修饰。
包括MBL的任何功能等效体的分离的MBL肽，在一个实施方案中包括至少80个氨基酸残基，如至少100个氨基酸残基，如至少150个氨基酸残基，如至少200个氨基酸残基，如至少220个氨基酸残基，如至少250个氨基酸残基。
在优选的实施方案中，表达载体适合于在哺乳动物细胞系或转基因动物中表达，其包括人MBL基因或其他动物MBL基因的外显子序列和至少一个内含子序列，所述其他动物包括但不限定于黑猩猩和恒河猴。在一个实施方案中，将宿主细胞在转基因动物中进行培养。在本文中转基因动物是指经遗传修饰而包含并表达人MBL基因或其片段或其类似物的动物。
在优选实施方案中，本发明的表达构建体包括病毒载体，例如DNA病毒载体，RNA病毒载体或嵌合病毒载体。DNA病毒的实例包括巨细胞病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、猴病毒40、牛乳头瘤病毒、腺伴随病毒、腺病毒、痘苗病毒和Baculo病毒。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种以病毒为基础的表达系统。在将腺病毒作为表达载体的情况中，可以将本发明的核酸分子连接至腺病毒转录/翻译调控复合物，例如晚期启动子和三联前导序列上。然后通过体外和体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组。在病毒基因组非必须区(如E1或E3区)中的插入将得到可在被感染的宿主细胞中存活并表达MASP-3基因产物的重组病毒(例如见Logan和Shenk，美国国家科学院院刊813655-3659，1984)。为了有效翻译所插入的核酸分子，还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及邻近序列。在将包括其本身的起始密码子及其邻近序列的整个基因或cDNA插入到表达载体的情况中，不需要额外的翻译调控信号。然而，在仅插入编码序列的情况中，必须提供包括如ATG起始密码子在内的外源翻译调控信号。而且，起始密码子必须与目的编码序列的阅读框相协调，以保证整个插入片段的翻译。这些外源翻译调控信号和起始密码子可以来自各种来源，既可以是天然的也可以是合成的。通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以提高表达效率(见Bittner等，酶学方法153516，1987)。
RNA病毒的实例包括塞姆利基(Semliki)森林病毒、新培斯病毒、Poko病毒、狂犬病病毒、流感病毒、SV5、呼吸道合胞病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、Kunjin病毒、仙台病毒、水泡性口炎病毒和逆转录病毒。
嵌合病毒的实例包括腺病毒、新培斯病毒和腺病毒-腺伴随病毒。
有关特异性载体参见Makrides，S.C.“用于基因转移和哺乳动物细胞中表达的载体的组成”，在此引入作为参考。
特别利用了Epstein-Barr病毒的复制起始点或其功能衍生体或类似体，包括pREP9载体。
在一个方面，本发明提供了编码人MBL的表达构建体，其特点是包括人MBL基因包括其功能衍生序列的一个或多个内含子序列。另外，它包括选自病毒基因或真核(包括哺乳动物和昆虫)基因的启动子区。
优选启动子区与人MBL启动子不相同，并且为了使MBL产量和MBL寡聚体的大小分布最佳，优选所述启动子区在所用的载体和宿主细胞中发挥最佳功能。
在优选的实施方案中，启动子区选自劳氏(Rous)肉瘤病毒长末端重复序列的启动子，巨细胞病毒即早期启动子和延伸因子1α启动子。
在另一个实施方案中，启动子区选自其他病毒、酵母和细菌等微生物的基因。
为了获得更高产量的重组MBL，启动子区可以包括增强子元件，例如小鼠血管内皮生长因子基因5’末端非翻译区的QBI SP163元件。用该构建体转化宿主细胞，获得能够表达MBL的宿主细胞培养物。
重组MBL的合成可利用体外或体内培养进行。宿主细胞培养优选真核宿主细胞培养。在本文中真核细胞的转化是指将重组DNA引入所述细胞。在该方法中所用的表达构建体的特点是具有选自哺乳动物基因的MBL编码区，所述哺乳动物基因包括人的基因和与其非常相似的基因，例如黑猩猩的基因。所应用的表达构建体的进一步特点是启动子区选自病毒或真核(包括哺乳动物细胞和昆虫细胞)基因。
因而本发明提供了与天然MBL相似的重组MBL，其纯化型的分子大小分布谱比目前已知的MBL更接近于天然人MBL。
根据本发明制备重组MBL的方法的特点是，宿主细胞培养优选真核细胞培养，例如哺乳动物细胞培养。优选的宿主细胞培养是人肾细胞培养，更优选的宿主细胞培养物是人胚肾细胞(HEK细胞)培养。本发明的特点是利用HEK293细胞系制备重组人MBL。“HEK293细胞系”是指来自人胚肾组织的任何细胞系，例如(但不限定于)在美国典型培养物保藏中心登记号为CRL-1573和CRL-10852的细胞系。
其它细胞包括鸡胚成纤维细胞、仓鼠卵巢细胞、仓鼠幼鼠肾细胞、人宫颈癌细胞、人黑色素瘤细胞、人肾细胞、人脐带血管内皮细胞、人脑内皮细胞、人口腔肿瘤细胞、猴肾细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠肾细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠少突细胞、小鼠巨噬细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠神经母细胞瘤细胞、小鼠前B细胞、小鼠B淋巴细胞、小鼠浆细胞瘤(plasmacytoma)细胞、小鼠畸胎瘤细胞、大鼠星形细胞瘤细胞、大鼠乳腺上皮细胞、COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、W138和NIH3T3细胞。
另外，可以选择可调节插入序列的表达或者以所需的特殊方式修饰或加工基因产物的宿主细胞。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白的功能可能是重要的。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白和基因产物翻译后加工和修饰机制。可以选择适当的宿主细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以应用具有对初级转录本进行正确加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。上述哺乳动物细胞类型属于那些可作为适当宿主细胞的细胞。
本发明的另一个方面提供了在例如哺乳动物细胞或转基因动物中通过重组DNA技术制备的MBL。更具体而言，本发明涉及重组MBL(rMBL)，其通过下述方法制备-制备如上所述的编码人MBL多肽或其功能等效体的基因表达构建体，-用该构建体转化宿主细胞，-培养该宿主细胞，从而使多肽表达并使其分泌入培养基中，随后，-获得包括人重组MBL的培养基，而且，本发明涉及MBL的合成，其通过(a)制备编码人MBL的表达构建体；(b)用该表达构建体转化真核培养细胞，从而得到真核重组宿主细胞培养物；(c)在体外或以转基因动物的形式培养该重组宿主细胞，从而表达所述人MBL；(d)收获所述表达的人MBL并将其通过上述亲和层析进行纯化。
所述宿主细胞可以在任何适当的培养基中培养，例如添加胰岛素、转铁蛋白、硒和胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基。
本发明进一步包括用上述的碳水化合物亲和层析法纯化或分离例如培养上清中或转基因动物的体液或组织中的人MBL的步骤。在本发明的优选实施方案中，用适合于上述亲和层析的甘露糖、己糖或N-乙酰葡糖胺衍生化基质进行亲和层析。特别是应用其基质已用甘露糖衍化的亲和层析。先前已经使用经甘露聚碳水化合物衍生化基质从培养上清中获得重组MBL。但是甘露聚碳水化合物衍生化基质与MBL的高分子量型和低分子量型均可结合，而上述衍生化基质，如甘露糖衍生化基质的应用，在重组MBL纯化中表现出令人惊讶的优点，因为这种基质选择性结合与天然MBL相似的重组MBL类型。通过SDS-PAGE及随后的凝胶蛋白染色(本领域已知的技术，例如见Ma等，1997)法测定的大小分布，与天然MBL的相似程度超过50％。
纯化的重组MBL在本文中理解为通过碳水化合物亲和层析法从细胞培养上清中或转基因动物体液或组织中纯化的重组MBL。
分离或纯化与血浆中天然MBL在大小分布上有至少50％相同的人MBL寡聚体组合物的方法优选包括-得到人MBL寡聚体制剂，
-利用碳水化合物衍生化基质对该制剂进行碳水化合物亲和层析，该碳水化合物衍生化基质对MBL四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比对MBL二聚体的亲和力高两倍。
-获得包括分离的人重组MBL组合物的洗脱物。
本发明提供了包括MBL亚单位寡聚体的新型重组MBL组合物，所述寡聚体的大小分布与天然血浆人MBL的大小分布至少有50％相同。在优选的实施方案中，所述大小分布与天然MBL有至少60％相同，如70％相同，如80％相同，如90％相同，如95％相同。
优选亚单位的高级寡聚体例如四聚体、五聚体和/或六聚体在组合物中占优势。因此，在组合物中四聚体、五聚体和/或六聚体与亚单位和/或二聚体的比例优选至少为2∶1，优选至少5∶1。
在优选的实施方案中，四聚体、五聚体和六聚体的总数与亚单位和二聚体的总数之比优选至少为2∶1，更优选至少5∶1。
在评估MBL组合物中寡聚体的大小分布时，通过在SDS-PAGE上的Westem印迹估测该大小分布。因此当用SDS-PAGE和/或Western印迹进行检测时，50％是指50％以上的rMBL具有高于200kDa的表观分子量。
可以通过任何适当的方式从培养液中纯化所述重组MBL组合物，例如任何物理化学分离方法，其包括但不限定于过滤法和层析法，如以大小为基础的离子交换层析、凝胶渗透层析或亲和层析等。优选用上述亲和层析的方法从培养液中纯化重组MBL组合物。
重组MBL组合物的功能性优选与血浆或血清MBL的功能性相似。在本文中，MBL功能性是指如上文关于功能等效体所述的激活补体系统的能力。可以用MBL比活性，例如每ng MBL的MBL活性单位，表示所述功能性。用比活性表示重组MBL组合物的功能性时，优选其功能性至少为从血清中纯化之MBL的比活性的25％，例如至少为从血清中纯化之MBL的比活性的50％，更优选其为从血清中纯化之MBL的比活性的75％。
根据本发明的MBL组合物基本上不含任何与在天然宿主生物中产生的MBL天然连接的杂质，例如不含与从血清中纯化的MBL天然相关的杂质。天然宿主生物是指MBL由正常表达MBL的细胞产生。
从亲和层析中获得的洗脱物本身可以用来制备药用组合物，或者在使用之前可以对该洗脱物进行进一步纯化。
根据本发明获得的MBL组合物可以用于制备药用组合物，其用来预防和/或治疗各种疾病或病情。
除了MBL寡聚体，该药用组合物可以包括可药用的载体物质和/或赋形剂。
尤其可以加入稳定剂来稳定MBL蛋白。该稳定剂可以是糖醇，糖，蛋白和/或氨基酸，例如稳定剂可以是白蛋白或麦芽糖。
例如根据给药类型，可以向药用组合物中加入其它传统的添加剂。
在一个实施方案中，该药用组合物为适合于注射的剂型。可以使用等渗盐水等传统载体物质。
在另一个实施方案中，该药用组合物为适合于经肺给药的剂型，例如用于吸入给药的粉末状制剂，或者是适合于局部应用的乳膏或流体制剂。
本发明是以新型重组MBL的合成为基础，这种重组MBL类型比迄今获得的MBL更接近于天然人MBL，并且可以用体外或体内技术进行合成。根据在免疫防御中MBL起重要作用的证据，所提供的该重组MBL形式表现出令人惊讶的对免疫抑制性化疗相关癌症和感染等病情进行治疗的可能性。早前报道的重组MBL制剂与天然MBL之间的结构差异使得任何这样的治疗均不大可能。另外，在该治疗中应用与天然MBL相似的rMBL比应用已知的MBL尤其是血浆源性人MBL有更大的优点，因为用rMBL治疗大大降低了病毒感染的危险。
所述的治疗不必是对已诊断的目前需要或可能需要治疗的疾病、障碍或病情进行治疗，而可以用来预防疾病或病情的发生。
在本文中治疗可以包括对例如人的免疫系统和生殖系统或具有相应功能单位的动物的相应系统的疾病进行治疗和/或预防。所治疗的病情不一定是指目前已知的需要治疗的状态，而是通常包括任何与当前需要和/或预期需要相关的状态或与正常状态的改善相关的状态。该治疗尤其是对MBL缺陷状态的治疗。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗药物的制造方法，该药物由所述MBL(包括rMBL片段或其类似物)的药用组合物组成，所述治疗包括对人的如免疫系统和生殖系统疾病或障碍或具有相应功能单位的动物的相应系统疾病进行的治疗和/或预防。
需要用本发明化合物治疗的所述疾病、障碍和/或病情包括例如治疗MBL缺陷状态和与免疫抑制性化疗相关的癌症和感染，尤其包括与癌症治疗期间的状态相关或与器官殖入和/或移植相关的感染。本发明还包括治疗与习惯性流产相关的病情。
因而，该药用组合物尤其可以用于治疗和/或预防选自下组的临床病情感染、MBL缺陷、癌症、感染等化疗相关疾病、人免疫缺陷病毒(HIV)相关疾病、先天性或获得性免疫缺陷相关疾病等。更具体而言，包括慢性炎症性脱髓鞘性多发神经炎(CIDP)，多灶性运动神经障碍，多发性硬化症，重症肌无力，Eaton-Lambert’s综合征，视神经炎，癫痫；原发性抗磷脂综合征；类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，系统性硬皮病，脉管炎，Wegner’s肉芽肿病，Siogren’s综合征，幼稚类风湿性关节炎；自身免疫性中性粒细胞减少症，自身免疫性溶血性贫血，中性粒细胞减少症；Crohn’s病，溃疡性结肠炎，腹腔疾病；哮喘，败血性休克综合征，慢性疲劳综合征，牛皮癣，中毒性休克，糖尿病，鼻窦炎，扩张性心肌病，心内膜炎，动脉粥样硬化，包括常见的可变性免疫缺陷的原发性低/无丙种免疫球蛋白血症，Wiskot-Aldrich综合征和重症联合免疫缺陷(SCID)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤患者的次级低/无丙种免疫球蛋白血症，急性和慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)，异源骨髓移植(BTM)，Kawasaki’s病和Guillan-Barre’s综合征。
给药途径可以是任何适当的途径，例如静脉内、肌内、皮下或皮内给药。本发明还考虑了经肺或局部给药。
MBL组合物给药尤其可以用来预防和/或治疗具有与先天性或获得性MBL缺陷相关的临床症状的患者或者有出现所述症状的危险的患者的感染。在MBL缺陷个体中有各种病情可以导致增加感染的易感性，例如化疗或其它细胞毒性治疗，癌症，AIDS，遗传倾向，慢性感染和中性粒细胞减少症。
由于化疗药物治疗对免疫系统细胞的副作用，经化疗的癌症患者大都对感染易感，这是用MBL治疗这种病情的基础。观察到的低MBL血浆浓度(低于500ng/ml)是对临床显著感染的易感性增加的指征，而且通过给药重组或天然血浆源性MBL，可以增强这些患者的免疫防御。
因而在化疗等开始之前和化疗的至少部分阶段，可以给药该药用组合物一段时间。
在化疗之前，可以将该MBL组合物作为普通的“激发剂”而给药，或者它可以给那些仅仅有发展成MBL缺陷的危险的患者施用。可以通过在治疗前检测MBL水平确定有此危险的患者，并且只对那些MBL水平低于预定水平的患者进行治疗。对于大部分人群，确定低MBL水平的界限是低于500ng/ml。可以通过实施例9中所述时间分辨免疫荧光检测、ELISA、RIA或比浊法测定MBL水平。
MBL给药的另一个指征是当MBL水平低于正常水平的50％，例如低于300ng/ml，或低于200ng/ml时。
该MBL组合物以适当的剂量方案给药，尤其通常以适当的间隔给药，例如化疗期间一周一次或两次。
正常情况下每剂量给药1-100mg，例如2-10mg，大部分是每剂量5-10mg。大部分情况下给药约0.1mg/kg体重。
因而本发明的一个方面涉及用MBL(包括rMBL、其片段或类似物)治疗癌症和例如免疫系统或生殖系统的疾病和障碍，该治疗包括创建、重建、增加和/或刺激补体系统的调理和/或杀细菌活性，即增加免疫防御能力来识别并杀伤微生物病原体。
而且，本发明的一个方面是应用根据本发明的重组组合物，该组合物是还包括另一种药物的试剂盒组件。所述另一种药物尤其可以是抗微生物药物，例如抗生素。
关于流产，已经报道在不明原因的习惯性流产患者中MBL低血浆水平的频率增加，这是在这些病例中通过给药重组MBL以重建MBL水平而降低流产易感性的基础。
至于本发明化合物的本性，在多个方面表明本发明涉及能够作为调理素的化合物，也就是说通过该化合物和巨噬细胞之间直接相互作用或者通过介导补体沉积于靶体表面，可以提高巨噬细胞的吞噬功能。关于此点的具体实例是MBL、其片段或类似物。本发明是以公开重组人MBL的合成为基础，该MBL比过去获得的MBL更接近于天然人MBL的结构。
现在已经在各个方面并足够详细的解释和说明了本发明，但是在下面用图1和图2以及优选实施方案的非限定性实施例又举例说明了本发明。
附图简述图1表明在非还原状态下通过SDS-PAGE和银染(包括一组(stacking)凝胶)方法对纯化的重组MBL和天然MBL的比较分析。泳道S上样24ng天然MBL(MO-04，The State Serum Institue)，泳道HEK上样60ng由HEK293EBNA细胞产生的rMBL，泳道Hyb上样12ng由Sp2/0Ag14细胞产生的rMBL(由R.A.B.Ezekowitz博士提供)。箭头表示杂交瘤细胞产生的rMBL中优势类型的位置。虽然泳道HEK的rMBL总量比泳道Hyb中高5倍，但是在泳道HEK中没有55kDa条带，说明在两种rMBL亚单位的二硫键形成中有明显的差异。(见实施例6所述)。
图2表示实施例1中所述本发明优选表达构建体即MBL/pREP9构建体的框架图。
图3显示来自凝胶渗透层析的级分(表示为洗脱体积)中MBL浓度(实施例7)。
图4表明用甘露糖-TSK珠、甘露聚糖-TSK珠、甘露糖-Sepharose珠、甘露聚糖Sepharose珠和未衍生化的Sepharose 4B珠进行纯化的rMBL的Western印迹分析。为了对比，包括了未分级分离的MBL/pREP9转化细胞的培养上清(实施例3)。
图5表明在非还原状态下进行分析的两种rMBL制剂的Western印迹根据本发明产生(“293EBNA细胞”)的50ng rMBL和根据Super等(1992)所述方法产生的(“Sp2/0Ag14细胞”)rMBL。天然MBL用Lu等(1990)所述的方法从人血清中纯化(“天然MBL”)(实施例6)。
实施例实施例1MBL基因表达构建体的设计从加入EDTA的20ml血液中分离人基因组DNA。将EDTA/血液与80ml冷(4℃)10mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1％(v/v)Triton X-100、0.32mM蔗糖混合，4℃放置30分钟并时常搅动。将该样品4℃1000×g离心30分钟，随后弃去上清并用10ml 0.9％(w/v)NaCl简单洗涤含核的沉淀。将收集的核重悬于6ml 75mM NaCl、24mM EDAT(pH8.0)中，并加入460μl 10％(w/v)SDS和1mg链霉蛋白酶(目录号165921，Boehringer-Mannheim，Mannheim，德国)。在室温下轻轻搅拌温育过夜(o/n)之后，加入2ml饱和(-6M)NaCl溶液。随后剧烈搅拌，通过1000×g离心弃去碎片。向上清中加入1∶1的异丙醇，将小瓶轻轻摇晃直到DNA沉淀出现。将线状沉淀物收集于封口的Pasteur移液管上，在70％(v/v)乙醇中的密封tip中洗涤，空气中干燥并最终重悬于1ml TE缓冲液中。PCR扩增MBL基因，正向引物含Xhol位点5’-AGATTAACCTTCCtcGAGTTTTCTCACACC-3’，反向引物含BamHI位点5’-TAACggaTTCACTCCAATAATACATACAC-3’(划线部分为经修饰加入到序列中的限制性内切酶位点，相对于Sastry等(1989)发表的天然基因序列已修饰的碱基对在两个引物序列中均用小写字母表示。通过DNAtechnology(Aarhus，丹麦)制备引物)。正向和反向引物分别位于5’和3’UTR中。PCR反应体系包括200μM dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP(目录号1969064，Boehringer-Mannheim)、1×反应缓冲液、0.75μl酶(目录号1732641，Expand High FidelityTM，Boehringer-Mannheim，反应缓冲液与酶共同提供)、基因组DNA(100ng)，加水致终体积50μl。PCR热循环的程序为96℃3分钟一个循环，10个循环的94℃15秒、60℃30秒和72℃5分钟，随后进行20个循环的94℃15秒、60℃30秒和68℃5分钟(每个循环增加20秒时间)，最后进行72℃5分钟的最后延伸(OmnETM热循环仪，Hydaid，Ashford，UK)。用TA cloning kitTM(目录号K2000-01，Invitrogen，Leek，荷兰)根据产品的说明将6.2kb PCR产物克隆到pCR2载体上。通过用Notl和BamHI内切酶(目录号15441-025和15201-023，GibcoBRL，Paisley，UK)在适当的缓冲液中37℃对该载体消化6小时，将MBL基因从pCR2中分离出来。用Pharmacia’s BandprepTM试剂盒(目录号27-9285-01，Pharmacia，Uppsala，瑞典)将插入的DNA片段即5’-Notl-MBL-BamHI-3’片段从1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离。按所述消化MBL/pCR2载体的方法消化pREP9载体(目录号V009-50，Invitrogen)，并且用同样的方法从琼脂糖中分离限制性消化产物即该线性化载体，以使未消化载体的污染最小。在终体积10μl中，1μl(-100ng)消化的pREP9载体、4μ1(-400ng)5’-Notl-MBL-BamHI-3’、1×连接缓冲液和20单位的T4连接酶(目录号202S，New England Biolabs，Beverly，MA，反应缓冲液与酶一起提供)在14℃条件下温育过夜。用CaCl2渗透法制备出转化感受态的大肠杆菌TOPF10细胞，并通过Hanahan等所述热休克法(1983)用所述连接产物转化。将细菌铺于含50μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂培养板上，在37℃培养过夜之后出现菌落。
图2显示根据本发明的优选表达构建体即MBL/pREP9构建体的框架图。所述MBL基因的PCR扩增部分(正向和反向引物的位置用黑色箭头标出)含4个外显子，包括如Sastry等(1989)确定的完整且已知的外显子4的3’非翻译区。将该片段与名为pREP9的表达载体在Notl和BamHI限制性内切酶位点进行连接(还标出了该载体中的EcoRV、XbaI、Bglll、XmnI、ClaI、StuI和SacI限制性内切酶位点)。克隆到pREP9表达载体中的MBL片段的转录由位于克隆位点上游(载体元件的转录方向用箭头标出)的劳氏肉瘤病毒长末端重复序列启动子(PRSV)调控，并且该载体还具有猴病毒40(SV40)聚腺苷酸化位点。通过氨苄青霉素抗性标记(Amp)和ColE1原核“复制起始点”，使细菌增殖，也就是说使大肠杆菌中产生载体DNA。Epstein-Barr病毒复制起始点(OriP)以及使载体与宿主细胞染色体结合的Epstein-Barr病毒核抗原1(EBNA-1)的表达使载体在HEK293EBNA细胞中得以维持。
实施例2重组MBL在哺乳动物细胞中的表达用加入10％FBS、谷氨酰胺、200μg G418/ml(遗传霉素TM，目录号G9516，Sigma)和抗生素(10,000单位青霉素和0.1％(w/v)链霉素)的DMEM培养基在150cm2细胞培养瓶(目录号9075，TPPAG)中培养HEK293EBNA细胞，直至细胞汇合，通过胰蛋白酶消化的方法收集细胞，在转染前24小时，以1/4的浓度(-25％的细胞汇合)将细胞接种在150cm2培养瓶(目录号90150，TPP)中。在转染前3小时更新所有的培养基。将60μg MBL/pREP质粒DNA(见实施例1)与150mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl(pH7.12)、268mM CaCl2进行混合，总体积为1680μl。将该DNA和钙溶液加到含50mM HEPES、250mM NaCl、1.5mM Na2HPO4+NaH2PO4的体积为1680μl的溶液中，调整至pH7.12。将细胞用该DNA/CaPO4沉淀温育14-16小时，用PBS洗涤两次并用含谷氨酰胺、抗生素(青霉素和链霉素)和胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)溶液(目录号51300-44，GibcoBRL)的RPMI-1640培养基(每瓶50ml)继续培养6-8天。
实施例3利用碳水化合物衍生化基质纯化rMBL将50ml Fractogel TSK HW-75珠与50ml 0.5M Na2CO3(pH11)和10ml乙烯砜(目录号V370-0，Aldrich，Milwaukee，WI)混合，随后在室温下搅拌温育1.5小时，从而激活Fractogel TSK HW-75珠(目录号14985，Merck KgaA，Darmstadt，德国)。将该珠粒收集到玻璃滤器上，用H2O和0.5M Na2CO3(pH11)各洗涤一次。用0.5M Na2CO3(pH11)将珠粒重悬，加入甘露糖至终浓度为10％(w/v)。将该混合物在室温下搅拌温育过夜。用H2O洗涤之后，将珠粒在0.1M氨基乙醇(pH9)中温育2小时，封闭残留的反应基团。用H2O和TBS洗涤之后，将5ml甘露糖偶联的TSK-75珠加到层析柱上，并用15ml 0.1M甘氨酸(pH3.0)洗涤，用TBS/0.05％(v/v)吐温-20、2mM CaCl2进行平衡，直至紫外吸收稳定为止。通过5000×g离心去除MBL/pREP9转染细胞培养液中的细胞，将此培养液以0.4ml/min的流速通过层析柱。用75ml含TBS和2mM CaCl2的溶液洗涤层析柱，将结合的rMBL洗脱到TBS、5mM EDTA中，并按每级分500μl进行收集。为了制备带有甘露聚糖(按Nakajima和Ballou(1974)所述方法从酵母中纯化)的TSK珠，用上述方法激活珠粒并用25mg甘露聚糖/ml 0.5M Na2CO3(pH11)温育，之后的步骤与制备甘露糖衍生化珠粒相同。按所述制备TSK珠的方法用甘露糖和甘露聚糖将Sepharose 4B珠(目录号17-0120-01，Pharmacia，Uppsala，瑞典)衍生化。按实施例A中的方法，将7ng从甘露糖-TSK珠、甘露聚糖-TSK珠、甘露糖-Sepharose珠、甘露聚糖Sepharose珠中纯化的rMBL分别加到SDS-PAGE凝胶上的不同泳道中，用Western印迹分析三种基质的洗脱物。为了比较，将相当于7ng rMBL的未分级培养上清加到一个泳道中。Western印迹结果见图4。
实施例4在非变性条件下通过凝胶渗透层析分析MBL在用5mM EDTA、TBS、0.01％(v/v)吐温-20(pH7.4)平衡的Superose-6柱(Superose 6TMHR 10/30，目录号17-0537-01，Pharmacia)上对纯化的rMBL或含rMBL培养上清进行渗透层析。将100μl样品体积以0.5ml/min的流速通过层析柱。上样5ml后按250μl的级分体积进行收集。
实施例5在变性条件下通过SDS-PAGE/银染法分析MBL按Jensen等(1997)所述方法制备SDS-PAGE 4％-20％梯度凝胶并将其用于电泳。银染方法采用Nesterenko等(1994)的方法。在100ml 50％(v/v)丙酮、6.25ml三氯乙酸、0.85％(v/v)甲醛中将PAGE凝胶固定15分钟，之后用H2O冲洗2次，并在H2O中洗涤15分钟。将凝胶在100ml 50％(v/v)丙酮中温育15分钟，随后在0.67mM Na2S2O3中温育1分钟，用H2O冲洗3次。在15mMAgNO3、0.9％(v/v)甲醛中进行凝胶的硝酸银染色，随后用H2O冲洗3次。通过使凝胶在0.19mM NaCO3、0.9％(v/v)甲醛、0.67mM Na2S2O3中温育约3分钟而显色。通过将凝胶在1％(v/v)乙酸中温育1分钟终止沉淀，并将其保存在25％(v/v)乙醇、3％(v/v)甘油中。
实施例6通过SDS-PAGE及随后的Western印迹分析rMBL按Sambrook等(1989)的方法制备pH值为7.4的Tris盐缓冲液(TBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)。为了封闭非特异性蛋白相互作用，在所述缓冲液中加入0.05％(v/v)吐温-20(TBS/Tw和PBS/Tw)。按Jensen等(1997)所述方法制备SDS-PAGE 4％-20％梯度凝胶并将其用于电泳。将50ng由HEK293EBNA细胞产生的rMBL(根据本发明制备)、50ng按Super等(1992)所述方法制备的rMBL和50ng从人血浆中制备的MBL(MO012，State Serum Institute)加到该凝胶上，使它们处于非还原条件。通过在50mM Tris碱、40mM甘氨酸(glycin)、3.7％(w/v)SDS、20％(v/v)乙醇中进行半干印迹60V×h，将蛋白转移到Amersham’s HybondTM-P膜上。通过用0.1％吐温-20将膜温育半小时，封闭非特异性蛋白相互作用。为了检测MBL，将所述膜在室温下用在TBS中稀释成1μg/ml抗人MBL单克隆抗体(Hyb 131-1，State Serum Institue)、0.05％吐温-20、1mM EDTA、1mg HSA/ml(目录号440511，State Serum Institute)、1mg人IgG/ml(目录号007740，Genteon Pharma GmbH，Marburg，德国)温育过夜。用TBS/Tw缓冲液洗涤3次之后，将所述膜与偶联了HRP的兔抗小鼠IgG(目录号P0260，Dako A/S，Copenhagen，丹麦)的TBS/Tw溶液(1∶2000)、1mM EDTA以及100μg人IgG/ml在室温下温育2小时。最后将膜在TBS/Tw中洗涤5次，并在底片(Kodak，NY)上用Pierce’s化学发光底物(SuperSignalTM，目录号34080，Pierce，Rockford，IL)进行显色。
实施例7通过凝胶渗透层析分析rMBL在用5mM EDTA、TBS、0.01％(v/v)吐温-20(pH7.4)平衡的Superose-6柱(Superose 6TMHR 10/30，目录号17-0537-01，Pharmacia)上对纯化的rMBL或含rMBL的培养上清进行渗透层析。将100μl样品体积(相当于100ngrMBL或天然MBL)以0.5ml/min的流速通过层析柱。上样5ml后按250μl的级分体积进行收集。用TBS/Tw、10mM EDTA将这些级分稀释2倍，并用实施例8所述的时间分辨荧光测定法进行分析。
实施例8用时间分辨荧光测定法(TRIFMA)分析rMBL用100μl(每孔)5μg/ml的Mab131-1抗MBL(Statens Serum Institute，Copenhangen，丹麦)PBS溶液将FlourosorpTM微滴定板(目录号437958，Nunc，Kamstrup，丹麦)包被过夜，并用TBS/Tw洗涤2次。用10mM EDTA、TBS/Tw将含已知浓度MBL(3.6μg MBL/ml)的标准血清稀释20倍，并使用此稀释血清及其进一步稀释5倍的溶液加样至平行孔中，每孔加入100μl稀释血清。应用3种用TBS/Tw/EDTA稀释20倍的对照血清，即含高浓度MBL(1.2μgMBL/ml)的血清、含中浓度MBL(250ng MBL/ml)的血清和含低浓度MBL(50ng MBL/ml)的血清。将MBL缺陷的血清同样稀释20倍并加到平板上作为阴性对照。通常将含FBS或无血清的培养上清稀释20倍和100倍。过夜温育之后，用TBS/Tw冲洗该平板3次，向每孔中加入100μl Eu3+标记的Mab131-1抗MBL(浓度为125ng/ml，用25μM EDTA、TBS/Tw配制)。基本上按Wallac’s方法(Wallac Turku，芬兰)制备标记的抗体。用标准的时间分辨荧光测定法(Hemmila等，1993)对结合的铕进行显色和检测。
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<160>3<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>248<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<300>
<308>swissprotP11226<400>1Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala1 5 10 15Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys20 25 30Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly35 40 45Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln50 55 60Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly65 70 75 80Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp85 90 95Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg100 105 110
Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe115 120 125Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu130 135 140Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala145 150 155 160Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn165 170 175Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu180 185 190Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp195 200 205Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu210 215 220Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His225 230 235 240Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile245<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物Ex.1<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2agattaacct tcctcgagtt ttctcacacc 30
<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物Ex.1<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3taacggatcc actccaataa tacatacac 29
权利要求
1.制备大小分布谱与天然人MBL至少有50％相同的人重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)组合物的方法，包括如下步骤-制备编码人MBL肽或其功能等价体的基因表达构建体，-用该构建体转化宿主细胞培养物，-培养该宿主细胞，从而使所述多肽表达并将其分泌到培养基中，随后，-将该培养基在碳水化合物衍生化基质中进行亲和层析，该碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位的四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比对MBL亚单位二聚体的亲和力至少高2倍，-获得包含人重组MBL组合物的洗脱物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述基因表达构建体包括人MBL基因或其功能等效体的至少一个内含子序列。
3.根据权利要求1的方法，其中所述基因表达构建体包括人MBL基因或其功能等效体的至少两个外显子序列。
4.根据权利要求1的方法，其中所述基因表达构建体包括编码MBL亚单位或其功能等效体的cDNA序列。
5.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞培养是在体外培养。
6.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞培养是在体内培养。
7.根据权利要求6的方法，其中所述宿主细胞培养是在转基因动物中培养。
8.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞培养是真核宿主细胞培养。
9.根据权利要求8的方法，其中所述宿主细胞培养是哺乳动物宿主细胞培养。
10.根据权利要求1的方法，其中所述基质本身对MBL基本上没有亲和力。
11.根据权利要求10的方法，其中所述基质本身不含碳水化合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述基质本身由不含碳水化合物的多聚体材料组成。
13.根据权利要求12的方法，其中所述基质由塑料珠组成。
14.根据权利要求1的方法，其中所述多肽组合物的分离在已碳水化合物衍生化基质上进行。
15.根据权利要求14的方法，其中所述多肽组合物的分离在甘露糖衍生化基质上进行。
16.根据权利要求1的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位和/或MBL亚单位二聚体基本上没有亲和力。
17.根据上述任一权利要求的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质基本上只对重组MBL亚单位的四聚体具有亲和力。
18.根据上述任一权利要求的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质基本上只对重组MBL亚单位的五聚体具有亲和力。
19.根据上述任一权利要求的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质基本上只对重组MBL亚单位的六聚体具有亲和力。
20.根据上述任一权利要求的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质基本上只对重组MBL亚单位的四聚体、五聚体和/或六聚体具有亲和力。
21.根据上述任一权利要求的方法，其中所述大小分布谱基本上与天然人血浆MBL相同。
22.含MBL亚单位寡聚体的重组人MBL组合物，所述寡聚体的大小分布谱与天然人血浆MBL的大小分布谱至少有50％相同。
23.根据权利要求22的组合物，其中所述大小分布谱与天然人血浆MBL的大小分布谱至少有95％相同。
24.根据权利要求22的组合物，其中MBL亚单位的四聚体、五聚体和/或六聚体与二聚体的比例至少为2∶1，优选至少为5∶1。
25.根据权利要求22的组合物，其中MBL组合物基本上不含任何当在天然宿主器官中产生时与MBL天然相联的杂质。
26.根据权利要求22-25中任何一项的组合物，其中所述大小分布谱是通过SDS-PAGE和/或Werstern印迹进行评定。
27.根据权利要求22-26中任何一项的组合物，其处于非变性状态。
28.根据权利要求22-26中任何一项的组合物，其处于变性状态。
29.根据权利要求22的组合物，其中所述MBL亚单位由三个含SEQ IDNO1所示序列的肽序列或其功能等效序列组装而成。
30.编码重组人甘露聚糖结合型凝集素(MBL)多肽的基因表达构建体，其包括-至少一个来自人MBL基因或其功能等效体的内含子序列，-至少一个来自人MBL基因或其功能等效体的外显子序列，-与人MBL启动子不同的启动子区域，和-表达载体。
31.根据权利要求30的基因表达构建体，其中所述启动子区选自真核生物，例如哺乳动物和昆虫的基因。
32.根据权利要求30的基因表达构建体，其中所述启动子区域选自病毒基因。
33.根据权利要求32的基因表达构建体，其中所述启动子区域选自劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒即早启动子和延伸因子1α启动子。
34.根据权利要求30的基因表达构建体，其中所述启动子区选自微生物，例如病毒、酵母或细菌的基因。
35.根据权利要求30的基因表达构建体，其中所述启动子区包括增强子元件。
36.根据权利要求30的基因表达构建体，其中所述载体是pREP9载体。
37.制备人重组甘露聚糖结合型凝集素(MBL)的方法，包括如下步骤-制备权利要求30-36中任一项的编码人MBL多肽或其功能等效体的基因表达构建体，-用该构建体转化宿主细胞，-培养所述宿主细胞，以表达该多肽并将其分泌到培养基中，随后-收获含人重组MBL的培养基。
38.分离人MBL寡聚体的组合物的方法，所述寡聚体与天然血浆MBL的大小分布有至少50％相同，所述方法包括-获得人MBL寡聚体制剂-将该制剂在碳水化合物衍生化基质中进行亲和层析，所述碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位的四聚体、五聚体和/或六聚体的亲和力比对MBL亚单位二聚体的亲和力高2倍，-获得含分离的人重组MBL组合物的洗脱物。
39.根据权利要求38的方法，其中所述基质本身对MBL基本上没有亲和力。
40.根据权利要求39的方法，其中所述基质本身不含碳水化合物。
41.根据权利要求39的方法，其中所述基质本身由不含碳水化合物的多聚体材料组成。
42.根据权利要求41的方法，其中所述基质本身由塑料珠组成。
43.根据权利要求38的方法，其中所述多肽组合物的分离在甘露糖-基质上进行。
44.根据权利要求38的方法，其中所述多肽组合物的分离在己糖-基质上进行。
45.根据权利要求38的方法，其中所述碳水化合物衍生化基质对MBL亚单位和/或MBL亚单位二聚体基本上没有亲和力。
46.根据权利要求38的方法，其中所述所述碳水化合物衍生化基质基本上只对MBL亚单位的四聚体、五聚体和/或六聚体具有亲和力。
47.包含权利要求22-29中任一项的人重组MBL组合物的药用组合物，任选进一步包括可药用的载体物质。
48.根据权利要求47的组合物，为适合于注射的剂型。
49.根据权利要求48的组合物，其中所述载体物质是盐水、人血清白蛋白或甘露糖。
50.根据权利要求47的组合物，为适合于经肺给药的剂型。
51.根据权利要求50的组合物，为用于吸入给药的粉末状剂型。
52.根据权利要求47的组合物，为用于局部给药的乳膏或洗剂。
53.权利要求30-36的基因表达构建体在制备人重组MBL组合物中的应用。
54.权利要求22-29的人重组MBL组合物在制备药用组合物中的应用。
55.权利要求54的组合物在制备药用组合物中的应用，所述药用组合物用于治疗个体中，选自感染、MBL缺陷、癌症、与化疗相关的疾病、流产、与中性粒细胞减少相关的疾病，和人免疫缺陷病毒(HIV)，的症状。
56.根据权利要求55的应用，其中所述药用组合物通过静脉内、肌内、皮下或皮内给药。
57.根据权利要求55的应用，其中所述药用组合物是经肺给药。
58.根据权利要求55的应用，其中所述药用组合物是在局部给药。
59.根据权利要求55的应用，其中所述药用组合物是在化疗或其它细胞毒性治疗开始之前预防性给药。
60.根据权利要求59的应用，其中将所述治疗在化疗或其它细胞毒性治疗开始之后继续一段时期。
61.根据权利要求60的应用，其中所述个体的血清MBL水平是在治疗开始之前测定。
62.根据权利要求61的应用，其中所述血清MBL水平在治疗开始之前低于正常水平的50％。
63.根据权利要求55的应用，其中所述MBL组合物的给药量是1-100mg/剂。
全文摘要
本发明涉及对免疫系统疾病的治疗，包括对免疫系统中的缺陷的治疗。本发明包括制备一种新的编码人MBL的表达构建体，一种新的与天然人MBL有高度相似性的重组人MBL制剂，还包括该化合物在组合物、药物、以及在治疗诸如与免疫抑制状态相关和/或与MBL缺陷状态(包括潜伏状态)相关的状态中的应用。甘露聚糖结合型凝集素(MBL)缺陷状态与对感染的易感性增加有关。更具体地，本发明涉及对所述状态(包括潜伏状态，即目前尚不需要治疗的状态)的治疗。所述治疗针对人类，以及免疫系统行为类似于人的动物。
文档编号A61P35/00GK1715296SQ20051006384
公开日2006年1月4日 申请日期2000年5月10日 优先权日1999年5月14日
发明者斯蒂芬·蒂尔, 詹斯·C·詹斯尼厄斯, 托马斯·V·詹森 申请人:斯蒂芬·蒂尔, 詹斯·C·詹斯尼厄斯, 托马斯·V·詹森