一种脱色用β-甘露聚糖酶及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甘露聚糖酶的用途，具体涉及所述酶的脱色用途。
【背景技术】
[0002] 染料广泛用于食品、制药、化妆品、纺织和皮革等行业，目前已报道的染料超过1万 种，每年生产的染料超过7000万吨。在染料生产和使用过程中，大量的染料废水直接排放到 环境中，不仅影响水体的透明度和溶氧量，而且会产生如联苯胺一类的致癌物质，因此染料 废水的处理越来越受到人们的关注。传统的物理和化学方法由于其成本高，能耗大，且容易 形成有毒的副产物，在实际应用中受到一定的限制。在这种情况下，迫切需要一种成本和能 耗低、无二次污染、环境友好、操作简单的处理方法，研究者将视线转到生物酶降解法。该方 法是通过微生物的相关酶系对染料分子进行氧化或还原，破解其发色基团或不饱和键，通 过一些列的生物化学反应，降解为小分子化合物。近年发现β-甘露聚糖酶是在处理染料废 水中最具潜力的生物酶，其作用底物广泛，可催化降解多种不同结构的有机物。由于它具有 相当广泛的底物专一性，不会产生有毒物质，并且可在常温、常压的温和条件下降解污染 物，节约设备和能耗，因此在印染废水处理等方面有着非常巨大的应用潜力。
【发明内容】
[0003] 本发明具体涉及一种β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途。
[0004] 进一步地，其中所述染料为偶氮类染料、三芳甲烷类染料。
[0005] 进一步地，其中所述偶氮类染料为刚果红、甲基橙、达旦黄、铬黑Τ;所述三芳甲烷 类染料为水溶苯胺蓝、孔雀石绿、结晶紫或苯酚红。
[0006] 进一步地，所述β-甘露聚糖酶是由地衣芽胞杆菌，优选地是由地衣芽胞杆菌 HDGLJT-01产出的。
[0007] 进一步地，所述β-甘露聚糖酶是由以下方法制备的：
[0008] 将过夜培养的地衣芽胞杆菌HDGLJT-01种子液转接至魔芋胶发酵产酶培养基中， 37 °C、160rpm振荡培养48h，取40mL发酵液，4500r/min、4°C离心20min，得到的上清液，即粗 酶液;利用丙酮沉淀法纯化粗酶液，再采用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。
[0009] 进一步地，离子交换层析和凝胶过滤层析是指:将浓缩酶液加入已平衡好的DEAE-sepharose FF离子交换柱中，用0 · lmol/L的NaCl和0 · 005mol/L、pH为7 ·0的Tris-HCl进行梯 度洗脱，收集洗脱液，检测酶活和蛋白含量；将5mL离子交换纯化的酶液加到以平衡好的 sepadexG-75柱子中，用纯水作为洗脱液，洗脱流速为0.5mol/min，收集洗脱液。
[0010] 利用拥有自主知识产权的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-01产 生的β-甘露聚糖酶对不同结构的染料进行脱色处理，为该酶应用于染料脱色处理领域奠定 理论和技术基础(HDGLJT-01已经在之前专利CN102191235A中进行过公开，并进行了保藏， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M209288)。
【附图说明】
[0011 ] 图1为β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE电泳图。
[0012] 图2为β-甘露聚糖酶的最适温度。
[0013] 图3为温度对β-甘露聚糖酶稳定性的影响。
[0014]图4为β-甘露聚糖酶的最适pH。
[0015] 图5为pH对β-甘露聚糖酶稳定性的影响。
[0016] 图6为β-甘露聚糖酶对染料的脱色效果。
[0017] 图7为纯化与商品化的β-甘露聚糖酶对染料脱色的对比。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 .β-甘露聚糖酶的获得
[0019] 将过夜培养的B. licheniformis HDGLJT-01种子液转接至魔芋胶发酵产酶培养基 中，37 °C、160rpm振荡培养48h，取40mL发酵液，4500r/min、4°C离心20min，得到的上清液，即 粗酶液。利用丙酮沉淀法纯化粗酶液，再采用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。具 体地，将浓缩酶液加入已平衡好的DEAE-sepharose FF离子交换柱中，用0. lmol/L的NaCl和 0.005mol/L、pH为7.0的Tris-HCl进行梯度洗脱，收集洗脱液，检测酶活和蛋白含量。将5mL 离子交换纯化的酶液加到以平衡好的sepadexG-75柱子中，用纯水作为洗脱液，洗脱流速为 0.5mol/min，收集洗脱液，检测酶活和蛋白含量。利用SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量大小 (图 1)。
[0020] 实施例2. β-甘露聚糖酶部分性质分析
[0021]对本发明的β-甘露聚糖酶进行活性分析，包括酶的最适温度及热稳定性和酶的最 适pH及pH稳定性。
[0022] (1)β_甘露聚糖酶的最适温度及热稳定性
[0023] 取2mL的Tris-HCl缓冲液（0 · lmol/L、pH为8 · 0)与0 · 5mL的纯酶液混合，保温30min 后，立即测定酶活，以4°C下溶于Tris-HCl缓冲液中的纯酶酶活作为对照(此酶活为原始酶 活即100%)，计算不同温度下的酶活保留率，确定β-甘露聚糖酶的最适温度。结果表明（图 2)，该酶最适温度为60°C，说明此酶较为耐热。
[0024]取2mL的Tri s-HCl缓冲液与0.5mL的纯酶液分别在30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C 和 80°C下混合，并在6、12、24、48和7211测定酶活，以4°(：下保存于1^8-!1(：1缓冲液的纯酶酶活 作为对照(此酶活为原始酶活即100%)，计算不同温度和时间下的酶活保留率，确定该酶酶 活稳定温度范围及稳定的时间。结果表明（图3 )，该酶在6 0 °C下处理7 2 h，剩余酶活在 27.81% 以上。
[0025] (2 )β-甘露聚糖酶的最适pH及pH稳定性
[0026] 配制pH分别为4 ·0、5.0、5.5、6.0和6 · 5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;7.0、7.5、8.0、 8.5和9.0的Tris-HCI缓冲液以及pH分别为9.5、10.0和11.0的Glycine-NaOH缓冲液。在室温 下，取2mL上述3种缓冲液与0.5mL纯酶液混合静置lOmin(混合后酶液浓度为0.19mg/mL)，以 最高的酶活作为对照(此酶活设为100%)，测定不同pH下的β-甘露聚糖酶的酶活。计算其它 pH值下的相对酶活，确定最适pH值。结果表明（图4 )，该酶的最适pH为8.0。
[0027] 将pH为6.5、7.5、8.0、8.5和9.0的2mL上述缓冲液分别与0.5mL纯酶液混合(混合后 酶液浓度为〇. 21mg/mL)，室温放置0、40、80、120、160和200min，以最高酶活作为对照(此酶 活设为1 〇 〇 % )，计算不同时间和pH下的相对酶活，确定酶的稳定范围和稳定时间。结果表明 (图5)，pH为8.0时，前160min的相对酶活基本保持不变；160min之后，酶活下降，相对酶活为 56.35 %，酶活为273.28U/mL。由此可见，pH为8.0时，该酶稳定性较强。
[0028] 实施例3. β-甘露聚糖酶的脱色效果
[0029]表1脱色试验所用染料
[0030]
[0032]选取8种不同结构的染料(表1)，检测β-甘露聚糖酶的脱色能力。将一定量的β-甘 露聚糖酶和染料混合，37 °C、160rpm振荡反应，在0、6和12h时，进行全波长扫描，检测染料的 残留情况。结果表明（图7)，β-甘露聚糖酶对偶氮类染料脱色效果最佳，其中甲基橙、刚果红 和达旦黄脱色最好，在12h时，脱色率达几乎到了 100%，而铬黑Τ脱色率达到50%，脱色较 好。对三芳甲烷类染料脱色效果较好，其中水溶苯胺蓝、红雀石绿和苯酚红脱色率达到90% 左右，效果明显;结晶紫脱色率达到50%以上，脱色效果较好。
[0033]将本发明的β_甘露聚糖酶与商品化的β_甘露聚糖酶(4000U/mg)对偶氮类和三芳 甲烷类染料的脱色效果进行比较。结果表明（图7)，在对刚果红、甲基橙、达旦黄、铬黑T、水 溶性苯胺蓝、结晶紫、孔雀石绿、苯酚红脱色结果中，纯化的比商品化的β-甘露聚糖酶脱色 效果好。
【主权项】
1. 一种β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途。2. 根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，其中所述染料为偶氮类 染料、三芳甲烷类染料。3. 根据权利要求2所述的β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，其中所述偶氮类染料为 刚果红、甲基橙、达旦黄、铬黑Τ;所述三芳甲烷类染料为水溶苯胺蓝、孔雀石绿、结晶紫和苯 酚红。4. 根据权利要求1-3任一项所述的β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，其中所述β-甘 露聚糖酶是由地衣芽胞杆菌，优选地是由地衣芽胞杆菌HDGLJT-01产出的。5. 根据权利要求1-4任一项所述的β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，其中所述β-甘 露聚糖酶是由以下方法制备的： 将过夜培养的地衣芽胞杆菌HDGLJT-01种子液转接至魔芋胶发酵产酶培养基中，37°C、 160rpm振荡培养48h，取40mL发酵液，4500r/min、4 °C离心20min，得到的上清液，即粗酶液； 利用丙酮沉淀法纯化粗酶液，再采用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。6. 根据权利要求5所述的β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，其中，离子交换层析和凝 胶过滤层析是指：将浓缩酶液加入已平衡好的DEAE-sepharose FF离子交换柱中，用 0. lmol/L的NaCl和0.005mol/L、pH为7.0的Tris-HCl进行梯度洗脱，收集洗脱液，检测酶活 和蛋白含量;将5mL离子交换纯化的酶液加到以平衡好的sepadexG-75柱子中，用纯水作为 洗脱液，洗脱流速为0.5mo Ι/min，收集洗脱液。7. -种制备β_甘露聚糖酶的方法，其是将过夜培养的地衣芽胞杆菌HDGLJT-01种子液 转接至魔芋胶发酵产酶培养基中，37°C、160rpm振荡培养48h，取40mL发酵液，4500r/min、4 °C离心20min，得到的上清液，即粗酶液;利用丙酮沉淀法纯化粗酶液，再采用离子交换层析 和凝胶过滤层析进一步纯化； 优选地，所述离子交换层析和凝胶过滤层析是指将浓缩酶液加入已平衡好的DEAE-sepharose FF离子交换柱中，用0 · lmol/L的NaCl和0 · 005mol/L、pH为7 ·0的Tris-HCl进行梯 度洗脱，收集洗脱液，检测酶活和蛋白含量；将5mL离子交换纯化的酶液加到以平衡好的 sepadexG-75柱子中，用纯水作为洗脱液，洗脱流速为0.5mol/min，收集洗脱液。8. -种脱色用β-甘露聚糖酶，其特征在于，其是由地衣芽胞杆菌HDGLJT-01产出的；优 选地，其是由权利要求7所述的方法制备而成的。
【专利摘要】本发明涉及一种β-甘露聚糖酶用于染料脱色的用途，所述染料为偶氮类染料、三芳甲烷类染料，其中所述偶氮类染料为刚果红、甲基橙、达旦黄和铬黑T；所述三芳甲烷类染料为水溶苯胺蓝、孔雀石绿、结晶紫和苯酚红。所述β-甘露聚糖酶是由地衣芽胞杆菌，优选地是由地衣芽胞杆菌HDGLJT-01产出的，具体是由以下方法制备的：将过夜培养的地衣芽胞杆菌HDGLJT-01种子液转接至魔芋胶发酵产酶培养基中，37℃、160rpm振荡培养48h，取40mL发酵液，4500r/min、4℃离心20min，得到的上清液，即粗酶液；利用丙酮沉淀法纯化粗酶液，再采用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。本发明的产品比商品化的β-甘露聚糖酶脱色效果好。
【IPC分类】C12N9/24, C02F3/34
【公开号】CN105621630
【申请号】CN201610031200
【发明人】葛菁萍, 平文祥, 赵丹, 李兴霖, 金曼
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月18日