一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明提供了一种曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原免疫检测试剂盒，包括GM抗原包被的固相载体、抗GM抗原多克隆抗体和GM抗原标准品，所述试剂盒先将GM抗原包被在固相载体上，检测时，待检样本或GM抗原标准品与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点，再经酶与底物发生显色反应，测定结果的颜色深浅和待检抗原的浓度呈负相关，可根据GM抗原标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算待检抗原的浓度值。该试剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，其操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为GM抗原定量检测提供了一种有效工具。
【专利说明】
一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法 与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，尤其是一种曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM) 抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界的一种腐生菌及正常人体皮肤黏膜的 常驻真菌。曲霉孢子较小，直径2-3μπι，可以在空气中漂浮，并且通过呼吸道进入人体。由于 曲霉主要通过呼吸道进入人体，所以曲霉感染主要发生在肺部。
[0003] 在免疫抑制患者中侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis，ΙΑ)的发病率由于抗 生素的滥用而逐年增高，并成为其死亡的主要原因，烟曲霉菌是引起免疫抑制患者严重深 部曲霉菌感染的最常见病原菌，其次还有黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌等。IA在血液病和 造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplants，HSCT)患者中死亡率高达70%-90%，造成这种高死亡率的主要原因在于不能在病程早期对ΙΑ进行有效检测诊断，以至患 者得不到及时有效的治疗而死亡，因此选择早期检测诊断方法具有重要的意义。
[0004] 目前国际上开展的检测方法主要有以下4大类：
[0005] (1)组织病理学检查，该法为有创性检查，不易取材；
[0006] (2)血培养方法，该法敏感性差，耗时长，有些真菌样本采集难，阳性检出率不高， 且临床最多见的痰培养曲霉阳性并不能诊断曲霉感染；
[0007] (3)影像学检查，该法敏感性差，在疾病早期很难见到特征性表现；
[0008] (4)免疫学检测法:通过特异性针对GM抗原的抗体实现对曲霉菌的检测，检测血液 敏感性达到80%以上。免疫学检测方法灵敏度和特异性都较前三种方法有明显的优势，正 逐渐成为曲霉菌检测的常用方法。在国内外IFI的诊断标准中，均认为血清曲霉抗原阳性可 作为微生物学诊断标准，因此测定血清中的GM抗原水平有助于ΙΑ的早期诊断、早期治疗。
[0009] 免疫检测技术是利用抗原抗体间能发生特异性结合反应，通过检测标记在反应物 上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物的不同，分为酶联免疫 分析技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、免疫焚光检测技术、化学发光免 疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELI SA技术具有操作简单，灵敏度高， 检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。
[0010] 在曲霉菌的临床检测中，目前国际市场上免疫检测产品为数不多，现有的有美国 Bio-Rad公司的ELISA法检测试剂盒产品，该产品采用双抗夹心法，其方法是先将曲霉菌的 特异单克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本和辣根过氧化物酶(HRP)标记的同一单 克隆抗体，37 °C反应1.5个小时，待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结 构，再加入显色剂显色，颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现对GM抗原的检 测，该Bio-Rad曲霉菌试剂盒定性判定阴阳性结果。然而，该方法采用夹心免疫方法进行检 测，检测步骤繁琐，且单克隆抗体制备成本高，不利于试剂盒在临床检测中的推广和普及。 目前，国内还没有真正用于曲霉菌临床检测的免疫学检测产品，因此，在曲霉菌临床检测领 域内，迫切需要一种使用简单、成本低且特异性高的国内自主研发的定量检测GM抗原的诊 断试剂盒产品。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种使用简单、成本低且特异性高的曲霉菌 半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒。
[0012] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检 测试剂盒的制备方法。
[0013] 本发明所要解决的还一技术问题在于提供上述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检 测试剂盒的应用。
[0014] 为解决上述技术问题，本发明提供一种曲霉菌半乳甘露聚糖(简称GM)抗原免疫检 测试剂盒，所述试剂盒包括GM抗原包被的固相载体、抗GM抗原多克隆抗体和GM抗原标准品， 所述GM抗原标准品包括至少三种已知浓度的GM抗原溶液，所述GM抗原标准品的浓度在0-50ng/mL范围内。
[0015]优选的，所述GM抗原标准品的浓度在0-10ng/mL范围内，最优选的，在0-5ng/mL范 围内。所述GM抗原采用0. lmol/L PBS缓冲液进行配制。
[0016] 本发明所述GM抗原可由下述方法得到：
[0017] 将曲霉菌采用固体培养基培养至培养基长满绿色孢子;过滤除去菌丝，灭活菌体 及孢子;离心后，收集孢子并洗涤;孢子经破碎后过滤除去孢子碎片；将滤液经醇沉、洗涤 后，得到GM抗原粗提物;将GM抗原粗提物经脱色、超滤后得到所述GM抗原。
[0018] 其中，所述固体培养基选自PDA培养基、沙氏培养基或察氏培养基;优选为PDA培养 基，其中TOA培养基成分为每升培养基含300g土豆煮沸后的上清液，40g D-葡萄糖，15g琼脂 粉。
[0019] 在本发明一【具体实施方式】中，上述GM抗原的制备方法具体包括如下步骤：
[0020] 1)将曲霉菌采用PDA固体培养基，其中，PDA培养基成分为每升培养基含300g 土豆 煮沸后的上清液，40g D-葡萄糖，15g琼脂粉;培养温度为25-30°C，培养时间为3-5天，至培 养基长满绿色孢子；
[0021] 2)用无菌生理盐水冲洗孢子，孢子悬液经无菌纱布过滤除去菌丝，在孢子悬液中 加入终浓度为3.7 %的甲醛在4°C静置24-48h，灭活菌体及孢子；
[0022] 3)4°C，12,000g离心30min收集孢子，用无菌生理盐水洗涤孢子；
[0023] 4)用液氮研磨冷冻的孢子，加入无菌生理盐水，使用匀浆仪或超声细胞破碎仪破 碎孢子，所得孢子破碎液经定性滤纸过滤，滤液经〇. 45μπι滤膜过滤以除去孢子碎片；
[0024] 5)将所得滤液转移至洁净容器中，加入2.5倍体积无水乙醇，4°C静置过夜;4°C， 12，000g离心30min，将沉淀溶于去离子水中；加2.5倍体积无水乙醇，静置2小时；离心分离 沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤；
[0025] 6)4°C，12,000g离心30min，弃上清;将所得沉淀用去离子水溶解，再加入活性炭粉 末，4 °C搅拌4小时脱色;室温抽滤，除去活性炭颗粒;所得滤液经0.22μπι滤膜过滤;滤液转移 至10KD离心超滤管，4000g离心20min，即得到所述GM抗原。
[0026] 本发明所述抗GM抗原多克隆抗体，可与GM抗原特异性结合，用SDS-PAGE显示为均 一抗体产物，用GM抗原包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1 X 105，所述抗体可由 下述方法得到：
[0027] 用GM抗原作为免疫原免疫动物，对得到的血清进行分离纯化，得到所述抗GM抗原 多克隆抗体;其中，免疫采用皮下注射、足垫注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注射，免疫剂 量为0.01-0. lmg，所述动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，优选兔，所述纯化方 法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法。
[0028]在本发明一【具体实施方式】中，上述抗GM抗原多克隆抗体的制备方法具体包括如下 步骤：
[0029] 1)用GM抗原作为免疫原免疫兔，测定免疫后兔的血清效价，取免疫后的兔的耳动 脉血，分离抗血清；
[0030] 2)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化：
[0031]取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，于4 °C沉淀 过夜；
[0032] 10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL PBS溶解，缓慢滴加lmL饱和硫酸铵 溶液，在4°C静置1小时；
[0033] 10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用lmL PBS溶解，用PBS溶液4°C透析过夜；
[0034] 3)用亲和层析的方法进一步纯化：
[0035] 用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
[0036] 用5_10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0037] 用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0038] 用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
[0039]用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗GM抗原多克隆抗体；
[0040] 其中，所述洗脱缓冲液选自0. lmol/L甘氨酸缓冲液、1?缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓 冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0;所述偶联缓冲液选自roS缓 冲液、Tr i s-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选为PBS缓冲液。
[0041] 在本发明一【具体实施方式】中，所述固相载体为酶标板、微孔板、试管或微孔滤膜， 优选的，所述固相载体为酶标板;固相载体的材质例如可为聚苯乙烯、硝酸纤维素、尼龙等。
[0042] 在本发明一【具体实施方式】中，所述抗GM抗原多克隆抗体为标记酶的抗GM抗原多克 隆抗体;优选的，所述抗GM抗原多克隆抗体为标记酶的兔源抗GM抗原多克隆抗体。
[0043] 在本发明其它实施方式中，所述抗GM抗原多克隆抗体为未标记酶的抗GM抗原多克 隆抗体，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗可与抗GM抗原多克隆抗体相结合;优选 的，所述抗GM抗原多克隆抗体为未标记酶的兔源抗GM抗原多克隆抗体，所述试剂盒还包括 酶标羊抗兔二抗。
[0044] 在本发明一【具体实施方式】中，所述酶为辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP)、喊性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)或葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，G0);更优选的，所述酶为辣根过氧化物酶。
[0045] 在本发明一【具体实施方式】中，所述GM抗原标准品包括GM抗原标准品a，GM抗原标准 品b，GM抗原标准品c，GM抗原标准品d，GM抗原标准品e，其中，所述GM抗原标准品a的浓度为 5ng/mL、GM抗原标准品b的浓度为2.5ng/mL、GM抗原标准品c的浓度为Ing/mL、GM抗原标准品 d的浓度为0.5ng/mL、GM抗原标准品e的浓度为0.25ng/mL。
[0046] 在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，还 包括样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液中的一种或多种。
[0047] 优选的，所述样本处理液为蛋白变性溶液;更优选的，选自以下蛋白变性溶液中的 一种或多种：〇·05-0·2mg/mL蛋白酶K;pH2-pH10的0·03-0· 18mol/L EDTA(乙二胺四乙酸二 钠)溶液;5-30 % DMS0 (二甲基亚砜)溶液;pH7.0-pH8.0的1 -8mo 1 /L的尿素。
[0048] 优选的，所述浓缩洗液为含吐温-20的roS溶液(简称TOST溶液），其中，所述PBST溶 液中可包含生物液体防腐剂如ProCl in300;更优选的，所述浓缩洗液按重量份数计为:氯化 钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份， ProClin3002份，超纯水 1000份。
[0049] 优选的，所述样本稀释液为含5-15%脱脂乳粉、BSA或牛血清的的CBS稀释液;优选 为含10%脱脂乳粉的CBS稀释液。
[0050] 优选的，所述底物溶液选自0PD (邻苯二胺）、0T (邻联甲苯胺）、ABTS(2，2 ' -连氮-双 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））或p-NPP(对硝基苯磷酸酯）；优选为TMB。
[0051 ]优选的，所述终止液为HOmol/L的硫酸溶液，优选2mol/L的硫酸溶液。
[0052] 在本发明一【具体实施方式】中，所述试剂盒还包括样本处理液、浓缩洗液、样本稀释 液、底物溶液和终止液，所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组 分及配比如下：
[0053] 样本处理液:选自以下蛋白变性溶液:0 · 05-0 · 2mg/mL蛋白酶1(;?!12-?!110 0.03-0 · 18mol/LEDTA 溶液；5-30 %DMS0 溶液；
[0054]浓缩洗液:按重量份数计为:氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠 31.6份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份；
[0055]样本稀释液:含10%脱脂乳粉的CBS稀释液；
[0056] 底物溶液:TMB;
[0057] 终止液:2mo 1 /L的硫酸溶液。
[0058] 在本发明一【具体实施方式】中，所述标记或未标记酶的抗GM抗原多克隆抗体、GM抗 原标准品、酶标二抗、样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和/或终止液分别放入 各个试剂瓶中，上述各试剂瓶由海绵托架固定，并同GM抗原包被的固相载体和封板膜一同 置于试剂盒盒体内。
[0059] 本发明还提供一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备方法，包括如 下步骤：
[0060] 1)制备GM抗原包被的固相载体
[0061 ] 配制GM抗原包被液:采用缓冲溶液将GM抗原稀释至lOOng/mL-lOyg/mL;所述缓冲 溶液选自：Tr is-HCl缓冲液，PBS缓冲液，CBS缓冲液或生理盐水；
[0062] 配制封闭液:将2%_8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲 溶液选自：Tr is-HCl缓冲液，PBS缓冲液，CBS缓冲液或生理盐水；
[0063] 包被固相载体:将配制的GM抗原包被液加入固相载体中；将固相载体置于12_18°C 恒温包被;将配制的封闭液加入固相载体中，置于12-18°C恒温;弃去固相载体中的封闭液， 置于20-25°C恒温，即得；
[0064] 2)配制标准品
[0065]用PBS缓冲液配制至少三种已知浓度的GM抗原溶液，使GM抗原标准品的浓度在0-50ng/mL范围内；
[0066] 3)制备抗GM抗原多克隆抗体
[0067] 将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成。
[0068] 本发明中，酶偶联物稳定剂能够保持抗体与酶偶联物之间稳定性的试剂，能够保 持抗体及酶的活性。优选的，其可为HRP酶偶联物稳定剂，本发明中酶偶联物物稳定剂可为 市售产品。
[0069] 在本发明一【具体实施方式】中，所述抗GM抗原多克隆抗体为标记酶的抗GM抗原多克 隆抗体，其制备方法包括:采用过碘酸盐氧化法或戊二醛交联法将酶标记在抗GM抗原多克 隆抗体上;将标记酶的抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1: 20000-1:40000的比例 稀释而成。
[0070] 在本发明其它实施方式中，所述抗GM抗原多克隆抗体为未标记酶的抗GM抗原多克 隆抗体，所述试剂盒还包括酶标二抗，其制备方法还包括:将酶标二抗用酶偶联物稳定剂以 1:5000-1:20000的比例稀释而成。
[0071] 在本发明一【具体实施方式】中，所述试剂盒的制备方法还包括配制样本处理液、浓 缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液中的一种或多种的步骤。
[0072]本发明所述试剂盒的制备方法中GM抗原、抗GM抗原多克隆抗体、酶标二抗、固相载 体、酶、样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液可与本发明前述试剂盒中相 同，在此不作赘述。
[0073]在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制 备方法，具体步骤如下：
[0074] 1)制备GM抗原包被的酶标板
[0075] 配制GM抗原包被液:采用缓冲溶液将GM抗原稀释至lOOng/mL-lOyg/mL;所述缓冲 溶液选自：· lmol/LTri s-HCl缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ; 0 · lmol/LPBS缓冲液，其口!16.0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ;或生理盐水；优选的，所述缓冲液为 0 · lmol/LPBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0;
[0076]配制封闭液:将2%_8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲 溶液选自：0.1111〇1/11^8-?：1缓冲液，其口册.01!19.0;0.1111〇1/1?85缓冲液，其口册.0-pH9.0; 0.05-0.2mol/L CBS缓冲液，其pH6.0-pH9.0;或生理盐水;优选的，将5%的新生牛血 清加入生理盐水中，配制成封闭液；
[0077]包被酶标板:将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150yL包 被液;酶标板置于12-18Γ环境下包被6-8h;将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加 入50-150μΙ^?闭液，置于12-18°C恒温箱，2-4h;从恒温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C十旦温2_4h，即得；
[0078] 2)配制标准品
[0079] 将GM抗原用0. lmol/L PBS缓冲液配制，使GM抗原的浓度分别是5ng/mL，2.5ng/mL， lng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL;
[0080] 3)配制标记酶的抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0081]采用过碘酸盐氧化法或戊二醛交联法将酶标记在抗GM抗原多克隆抗体上，将标记 酶的抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成；
[0082] 4)配制样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液
[0083]所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如 下：
[0084] 样本处理液：选自以下蛋白变性溶液：0.05-0.2mg/mL蛋白酶K; pH2-pH100.03-0 · 18mol/LEDTA溶液;5-30%DMS0溶液;优选的，所述样本处理液为pH2-pH100 · 03-0 · 18mol/ L EDTA溶液；
[0085] 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-20 0.2份，ProCl in300 2份，超纯水1000份，混合均匀；
[0086] 样本稀释液:含10%脱脂乳粉的CBS稀释液；
[0087] 底物溶液:TMB;
[0088] 终止液：2mol/L的硫酸溶液。
[0089] 在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制 备方法，具体步骤如下：
[0090] 1)制备GM抗原包被的酶标板
[0091] 配制61抗原包被液:采用缓冲溶液将61抗原稀释至100即/11^-1(^8/1^;所述缓冲 溶液选自：0.1111〇1/11^8-?：1缓冲液，其口册.01!19.0;0.1111〇1/1?85缓冲液，其口册.0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ;或生理盐水；优选的，所述缓冲液为 0 · lmol/LPBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0;
[0092]配制封闭液:将2%_8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲 溶液选自：0.1111〇1/11^8-?：1缓冲液，其口册.01!19.0;0.1111〇1/1?85缓冲液，其口册.0-pH9.0; 0.05-0.2mol/L CBS缓冲液，其pH6.0-pH9.0;或生理盐水;优选的，将5%的新生牛血 清加入生理盐水中，配制成封闭液；
[0093]包被酶标板:将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150yL包 被液;酶标板置于12-18Γ环境下包被6-8h;将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加 入50-150μΙ^?闭液，置于12-18°C恒温箱，2-4h;从恒温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C十旦温2_4h，即得；
[0094] 2)配制标准品
[0095] 将GM抗原用0. lmol/L PBS缓冲液配制，使GM抗原的浓度分别是5ng/mL，2.5ng/mL， lng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL;
[0096] 3)配制抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0097] 将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成； [0098] 4)配制酶标二抗溶液
[0099] 将酶标二抗用酶偶联物稳定剂以1:5000-1:20000的比例稀释而成；
[0100] 5)配制样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液
[0101]所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如 下：
[0102] 样本处理液：选自以下蛋白变性溶液，0.05-0.2mg/mL蛋白酶K; pH2-pH100.03-0· 18mol/L EDTA溶液；5-30%DMS0溶液；优选的，所述样本处理液为口!121!1100.03-0.18mol/L EDTA溶液；
[0103] 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-20 0.2份，ProCl in300 2份，超纯水1000份，混合均匀；
[0104] 样本稀释液:含10%脱脂乳粉的CBS稀释液；
[0105] 底物溶液:TMB;
[0106] 终止液:2mol/L的硫酸溶液。
[0107] 本领域技术人员知晓，上述试剂盒制备方法中各组分的配制顺序不用于限定本发 明，本领域技术人员可根据实际需求任意调整顺序。
[0108] 本发明还提供一种所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒在检测GM抗原 中的应用。
[0109] 在本发明一【具体实施方式】中，本发明试剂盒检测GM抗原的应用采用竞争ELISA法， 其应用原理如下：
[0110] a)将GM抗原包被在固相载体上；
[0111] b)将待检样本处理后与标记酶的抗GM抗原多克隆抗体加入固相载体，使待检样本 中的抗原与包被后的抗原竞争结合有限的抗体结合位点；
[0112] 或者，将待检样本处理后与未标记酶的抗GM抗原多克隆抗体加入固相载体，使待 检样本中的抗原与包被后的抗原竞争结合有限的抗体结合位点，恒温反应并彻底洗涤，加 入酶标二抗；
[0113] c)经过恒温反应并彻底洗涤，再加入酶的底物溶液显色，颜色的深浅和待检样本 中GM浓度呈负相关；
[0114] d)用酶标仪在一定波长下测定吸光度(A值），通过标准曲线实现对抗原的检测。
[0115] 采用本发明试剂盒可实现对GM抗原的定量检测。
[0116] 在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测 GM抗原中的应用为竞争ELISA方法(一步法），具体步骤如下：
[0117] a)取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到 待检测物；
[0118] b)将GM抗原标准品和步骤a)的待检测物分别与标记酶的抗GM抗原多克隆抗体等 体积混匀并加入GM抗原包被的酶标板中同时孵育60-120min，孵育后洗板；
[0119] c)向步骤b)的酶标板中加入底物溶液显色10-15min后，加入终止液后进行检测， 于酶标仪上读取450纳米处的吸光光度值，通过标准曲线实现对抗原的检测。
[0120] 在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测 GM抗原中的应用为竞争ELISA方法(两步法），具体步骤如下：
[0121] a)取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到 待检测物；
[0122] b)将GM抗原标准品和步骤a)的待检测物分别与标记酶的抗GM抗原多克隆抗体等 体积混匀并孵育60-120min;
[0123] c)将步骤b)的混合物加入GM抗原包被的酶标板中并孵育60min-120min，孵育后洗 板；
[0124] d)向步骤c)的酶标板中加入底物溶液显色10-15min后，加入终止液后进行检测， 于酶标仪上读取450纳米处的吸光光度值，通过标准曲线实现对抗原的检测。
[0125] 在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测 GM抗原中的应用为竞争ELISA方法(一步法），具体步骤如下：
[0126] a)取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到 待检测物；
[0127] b)将GM抗原标准品和步骤a)的待检测物分别加入GM抗原包被的酶标板中，再加入 等体积抗GM抗原多克隆抗体混匀并同时孵育60-120min，孵育后洗板；
[0128] c)向步骤b)的酶标板中加入酶标二抗并孵育20-60min，孵育后洗板；
[0129] d)向步骤c)的酶标板中加入底物溶液显色10_15min后，加入终止液后进行检测， 于酶标仪上读取450纳米处的吸光光度值，通过标准曲线实现对抗原的检测。
[0130]在本发明一【具体实施方式】中，所述曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测 GM抗原中的应用为竞争ELISA方法(两步法），具体步骤如下：
[0131] a)取待检样本与样本处理液以1:1-5:1的体积比混合并煮沸l-10min后离心得到 待检测物；
[0132] b)将GM抗原标准品和步骤a)的待检测物分别与抗GM抗原多克隆抗体等体积混匀 并孵育 60min-120min;
[0133] c)将步骤b)的混合物加入GM抗原包被的酶标板中并孵育60min-120min，孵育后洗 板；
[0134] d)向步骤c)的酶标板中加入酶标二抗并孵育20-60min，孵育后洗板；
[0135] e)向步骤d)的酶标板中加入底物溶液显色10_15min后，加入终止液后进行检测， 于酶标仪上读取450纳米处的吸光光度值，通过标准曲线实现对抗原的检测。
[0136] 本领域技术人员知晓，对曲霉菌半乳甘露聚糖的检测包括不以/以疾病的诊断和 治疗为目的。
[0137] 本发明的有益效果是：
[0138]本发明所述曲霉菌半乳甘露聚糖(6&]^(：1:〇11^111^11，61〇抗原免疫检测试剂盒采用 竞争法，先将GM抗原包被在酶标板上，再将待检样本或GM抗原标准品分别与包被抗原竞争 结合有限的抗体结合位点，经酶与底物发生显色反应，测定结果的颜色深浅和待检抗原的 浓度呈负相关，所用抗体为抗GM抗原多克隆抗体，可根据GM抗原标准品绘制标准曲线，根据 标准曲线方程计算待检抗原的浓度值。该检测试剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与 参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵 敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为GM抗原定量检测提供了一种有效工 具。
【附图说明】
[0139] 图1显示了实施例1中GM抗原纯品中多糖含量测定标准曲线；
[0140] 图2显示了实施例1中GM抗原纯品的HPLC检测结果；
[0141] 图3显示了实施例2中兔源抗GM抗原多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果，其中，pAb 泳道为多抗，Μ泳道为蛋白Marker;
[0142] 图4显示了实施例2中兔源抗GM抗原多克隆抗体的效价测定的结果；
[0143] 图5显示了实施例24中GM抗原免疫检测试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0144] 实施例1曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原的制备
[0145] 采用曲霉菌制备GM抗原，本发明所采用的曲霉菌株购买自中国医学微生物菌种保 藏管理中心(CMCC)。
[0146] -、提取GM，其步骤如下：
[0147] 配制PDA固体培养基2.0L，其成分为600g 土豆煮沸后的上清液，D-葡萄糖80.0g，琼 脂粉30.0g，将曲霉菌株置于培养基中，25°C培养3天，至培养基长满绿色孢子。用无菌生理 盐水冲洗孢子，孢子悬液经8层无菌纱布过滤3次除去菌丝，在孢子悬液中加入终浓度为 3.7%的甲醛4°(：静置241 1，灭活菌体及孢子。4°(：，12,00(^离心301^11收集孢子，用无菌生理 盐水洗涤6次，除去可能存在的甲醛。用液氮反复研磨冷冻的孢子，再加入无菌生理盐水，再 用超声细胞破碎仪破碎孢子。所得孢子破碎液经定性滤纸过滤，滤液经〇.45μπι滤膜过滤以 除去孢子碎片。将所得滤液转移至洁净容器中，加入2.5倍体积无水乙醇，4°C静置过夜。4 °C，12，000g离心30min，将沉淀溶于去离子水中，加2.5倍体积无水乙醇，静置2小时，离心分 离沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤三次。4°C，12，000g离心30min，弃上清，得到粗提的GM。
[0148] 二、用活性炭吸附的方法对粗提的GM进行脱色，具体步骤如下：
[0149] 将GM溶于200mL去离子水，边搅拌边缓慢加入活性炭粉末3.0g，4°C脱色4小时，待 溶液棕黄色褪去，用布氏漏斗过滤，反复过滤至溶液澄清，即得到去除色素的GM提取物。
[0150] 三、用超滤的方法对GM进行纯化，具体步骤如下：
[0151] 室温抽滤，除去活性炭颗粒，所得滤液经0.22μπι滤膜过滤。滤液转移至10KD离心超 滤管，4000g离心20min，即得到高纯度GM。
[0152] 四、对GM进行纯化，对得到的GM样品进行多糖、蛋白质及核酸含量检测：
[0153] 1)用Dubois-硫酸苯酚法对上述得到的GM抗原纯品进行多糖含量测定，检测结果 如表1-1，表1-2,附图1所不：
[0154] 表1-1 GM抗原纯品中多糖含量
[0156] 表1-2 GM抗原纯品中多糖含量
[0158] 由检测结果可知，采用该制备方法从2L烟曲霉培养基最终可得到220mg烟曲霉菌 半乳甘露聚糖抗原纯品。
[0159] 2)对该制备方法得到的GM抗原纯品样本进行紫外吸收检测。分别在UV260nm、 UV280nm、UV320nm波长下检测样本，结果如下表2。由检测结果可知，核酸及蛋白质的总含量 不超过样本总质量的4%。
[0160] 表2 GM抗原纯品中DNA和蛋白质含量
[0162] 五、对GM进行纯化，对得到的GM样品进行HPLC检测：
[0163] 对该制备方法得到的GM抗原纯化样品进行HPLC检测。检测器为示差折光检测器。 检测结果如附图2所示。从图中可看出，样品出峰单一，尖窄，并无明显杂峰出现，说明所含 物质大小均一，纯度较高。
[0164] 六、用该制备方法对GM抗原进行纯化，对得到的GM抗原纯品样本用Bio-Rad公司的 烟曲霉抗原检测试剂盒进行抗原鉴定。
[0165] 目前国际上通常采用美国Bio-Rad公司的烟曲霉抗原检测试剂盒对GM抗原进行检 测。用该试剂盒对GM抗原样品进行检测，样本浓度为Ing/mL。检测结果见下表3,由结果可 知，GM抗原呈阳性，且0D值大于阳性质控，说明用本发明中的方法可以获得烟曲霉的半乳甘 露聚糖抗原。
[0166] 表3采用Bio-Rad烟曲霉抗原检测试剂盒进行抗原鉴定检测结果
[0168] 实施例2抗GM抗原多克隆抗体的制备
[0169] -、抗GM抗原的多克隆抗体的制备
[0170] 1.免疫动物
[0171] 将GM抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积，充分乳化后对新西兰大耳兔进 行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-0. lmg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性 对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
[0172] 2.多克隆抗体的获得
[0173] 1)效价测定:免疫过程中，免疫后每隔7天采血测效价1次，免疫次数6次。
[0174] 2)分离抗血清:血清效价达到很高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝 固，血清分离出后，高速离心，取上清，在-20 °C下保存。
[0175] 3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
[0176] 取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，于4 °C沉淀 过夜；
[0177] 10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mL PBS溶解，缓慢滴加lmL饱和硫酸铵 溶液，在4°C静置1小时；
[0178] 10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用lmL PBS溶解，用PBS溶液4°C透析过夜。
[0179] 4)用亲和层析的方法进一步纯化
[0180]用7倍柱床体积的洗脱缓冲液(0.01M PB磷酸缓冲液)洗柱；
[0181]用7倍柱床体积的偶联缓冲液(0.01M PBS磷酸盐缓冲液)洗柱；
[0182]用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
[0183]用7倍柱床体积的偶联缓冲液(0.01M PBS磷酸盐缓冲液)洗柱；
[0184] 用3倍柱床体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸)洗脱，得到抗GM抗原多克隆抗体。
[0185] 二、抗体的检测
[0186] 1 · SDS-PAGE 电泳检测
[0187] 对实施例2制得的多克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝 染色。实验结果见附图3(pAb泳道为多抗，Μ泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和 50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。
[0188] 2.效价测定
[0189] 用间接ELISA法对多克隆抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标 记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBS溶液，以抗体溶液的0D值大于阴性对照0D值的2倍为阳性判 定标准。检测结果见附图4。从结果可看出，该抗体效价较高，大于1:1 X 105。
[0190] 实施例3曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)抗原免疫检测试剂盒的制备
[0191] -、制备GM抗原包被的酶标板
[0192] 1.配制GM抗原包被液：
[0193] 采用〇.lm〇l/L Tris-HCl缓冲液将GM抗原稀释至 100ng/mL，pH6.0-pH 9.0。
[0194] 2.配制封闭液：
[0195] 将2%的新生牛血清加入生理盐水中，配制成封闭液。
[0196] 3.包被酶标板：
[0197] 1)将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL包被液；
[0198] 2)上述酶标板置于12_18°C环境下包被6h;
[0199] 3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL封闭液，置于12-18Γ温 箱，2h;
[0200] 4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C恒温2h。
[0201 ]二、配制标准品（定量标准曲线的建立）
[0202] 标准品的制备是将GM抗原用0. lmol/L PBS稀释液配制而成，GM抗原的浓度分别是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0203] 三、配制抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0204] 抗GM抗原多克隆抗体溶液的配制是将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以 1:20000的比例稀释而成。
[0205]四、配制酶标二抗溶液
[0206]酶标二抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗用HRP酶偶联 物稳定剂以1:5000的比例稀释而成。
[0207] 五、样本处理液
[0208] 用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成0.03mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0209]六、浓缩洗液（20X0.01M PBS)
[0210]按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6份，磷酸二 氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份，混合均匀。
[0211] 七、样本稀释液
[0212]含10%脱脂乳粉的CBS稀释液。
[0213] 八、底物溶液
[0214]四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0215] 九、终止液
[0216] 2mol/L硫酸溶液，将浓硫酸与超纯水按1:8比例稀释，配制成终止液。
[0217] 实施例4曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0218] 所述的GM抗原包被液，采用0. lmol/L PBS磷酸盐缓冲溶液将GM抗原稀释至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步骤同实施例3。
[0219] 实施例5曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0220] 所述的GM抗原包被液，采用0.05mol/LCBS碳酸盐缓冲溶液将GM抗原稀释至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步骤同实施例3。
[0221 ]实施例6曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0222] 所述的GM抗原包被液，采用O.lmol/LCBS碳酸盐缓冲溶液将GM抗原稀释至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步骤同实施例3。
[0223] 实施例7曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0224] 所述的GM抗原包被液，采用0.2mol/L CBS碳酸盐缓冲溶液将GM抗原稀释至100ng/ mL，pH6.0-pH9.0，其余步骤同实施例3。
[0225] 实施例8曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0226] 所述的GM抗原包被液，采用生理盐水将GM抗原稀释至100ng/mL，其余步骤同实施 例3〇
[0227]实施例9曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备 [0228] 一、制备GM抗原包被的酶标板
[0229] 1.配制GM抗原包被液：
[0230] 采用0. lmol/L Tris-HCl缓冲液将GM抗原稀释至5yg/mL，其pH6.0-pH9.0。
[0231] 2 ·配制封闭液：
[0232] 将5%的新生牛血清加入生理盐水中，配制成封闭液。
[0233] 3.包被酶标板：
[0234] 1)将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL包被液；
[0235] 2)上述酶标板置于12-18 °C环境下包被7h;
[0236] 3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL封闭液，置于12-18Γ温 箱，3h;
[0237] 4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C恒温3h。
[0238]二、配制标准品（定量标准曲线的建立）
[0239] 标准品的制备是将GM抗原用0. lmol/L PBS稀释液配制而成，GM抗原的浓度分别是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0240] 三、配制抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0241] 抗GM抗原多克隆抗体溶液的配制是将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以 1:30000的比例稀释而成。
[0242] 四、配制酶标二抗溶液
[0243]酶标二抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗用HRP酶偶联 物稳定剂以1:10000的比例稀释而成。
[0244] 五、样本处理液
[0245] 用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成0.1mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0246] 六、浓缩洗液（20X0.01M PBS)
[0247] 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份，混合均匀。
[0248] 七、样本稀释液
[0249] 含10%脱脂乳粉的CBS稀释液。
[0250] 八、底物溶液
[0251 ]四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB) 〇
[0252] 九、终止液
[0253] 2mol/L硫酸溶液，将浓硫酸与超纯水按1:8比例稀释，配制成终止液。
[0254] 实施例10曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0255] 所述的封闭液，采用生理盐水溶液，将8 %的新生牛血清加入上述溶液中，配制成 封闭液，其余步骤同实施例9。
[0256] 实施例11曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0257] -、制备GM抗原包被的酶标板
[0258] 1.配制GM抗原包被液：
[0259] 采用0· lm〇l/L Tris-HCl缓冲液将GM抗原稀释至 10yg/mL，其ρΗ6·0-pH9·0。
[0260] 2.配制封闭液：
[0261 ]将8%的新生牛血清加入生理盐水中，配制成封闭液。
[0262] 3.包被酶标板：
[0263] 1)将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL包被液；
[0264] 2)上述酶标板置于12_18°C环境下包被8h;
[0265] 3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL封闭液，置于12-18Γ温 箱，4h;
[0266] 4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C恒温4h。
[0267]二、配制标准品（定量标准曲线的建立）
[0268] 标准品的制备是将GM抗原用0. lmol/L PBS稀释液配制而成，GM抗原的浓度分别是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0269] 三、配制抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0270] 抗GM抗原多克隆抗体溶液的配制是将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以 1:40000的比例稀释而成。
[0271] 四、配制酶标二抗溶液
[0272]酶标二抗溶液的配制是将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗用HRP酶偶联 物稳定剂以1:20000的比例稀释而成。
[0273] 五、样本处理液
[0274] 用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成0.12mol/L EDTA溶液，pH 2.0-ρΗΙΟ.Ο。
[0275] 六、浓缩洗液（20X0.01M PBS)
[0276] 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份，混合均匀。
[0277] 七、样本稀释液
[0278] 含10 %脱脂乳粉的CBS稀释液。
[0279] 八、底物溶液
[0280] 四甲基联苯胺（3，3，，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0281] 九、终止液
[0282] 2mol/L硫酸溶液，将浓硫酸与超纯水按1:8比例稀释，配制成终止液。
[0283] 实施例12曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0284] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解蛋白酶K，配制成0.05mol/L蛋白酶K溶 液，其余步骤同实施例11。
[0285] 实施例13曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0286] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解蛋白酶K，配制成0. lmol/L蛋白酶K溶液， 其余步骤同实施例11。
[0287] 实施例14曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0288] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解蛋白酶K，配制成0.2mol/L蛋白酶K溶液， 其余步骤同实施例11。
[0289] 实施例15曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0290] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解DMS0,配制成5%DMS0溶液，其余步骤同 实施例11。
[0291] 实施例16曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0292] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解DMS0，配制成15 %DMS0溶液，其余步骤同 实施例11。
[0293] 实施例17曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0294] 样本处理液的配制方法为：用超纯水溶解DMS0，配制成30 %DMS0溶液，其余步骤同 实施例11。
[0295] 实施例18曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备
[0296] -、制备GM抗原包被的酶标板
[0297] 1.配制GM抗原包被液：
[0298] 采用0· lm〇l/L Tris-HCl缓冲液将GM抗原稀释至 10yg/mL，其ρΗ6·0-pH9·0。
[0299] 2 ·配制封闭液：
[0300]将5%的新生牛血清加入生理盐水中，配制成封闭液。
[0301] 3.包被酶标板：
[0302] 1)将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL包被液；
[0303] 2)上述酶标板置于12-18 Γ环境下包被8h;
[0304] 3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100yL封闭液，置于12-18Γ温 箱，4h;
[0305] 4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25 °C恒温4h。
[0306]二、配制标准品（定量标准曲线的建立）
[0307] 标准品的制备是将GM抗原用0. lmol/L PBS稀释液配制而成，GM抗原的浓度分别是 5ng/mL，2·5ng/mL，1ng/mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL 〇
[0308] 三、配制标记酶的抗GM抗原多克隆抗体溶液
[0309]将辣根过氧化物酶标记的抗GM抗原多克隆抗体用HRP酶偶联物稳定剂以1: 20000 的比例稀释而成。
[0310] 四、样本处理液
[0311] 用超纯水溶解乙二胺四乙酸二钠，配制成O.lmol/L EDTA溶液，pH 2.0-PH10.0。 [0312]五、浓缩洗液（20X0.01M PBS)
[0313] 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份，混合均匀。
[0314] 六、样本稀释液
[0315]含10%脱脂乳粉的CBS稀释液。
[0316]七、底物溶液
[0317]四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB)。
[0318] 八、终止液
[0319] 2mol/L硫酸溶液，将浓硫酸与超纯水按1:8比例稀释，配制成终止液。
[0320]实施例19曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测步骤
[0321] 一、样本的处理
[0322] 1)将待检样本与样本处理液以1:1的体积比混合后沸水浴lmin。
[0323] 2)将水浴后的混合液1，000g离心lmin。
[0324] 3)离心后上清液用于检测。
[0325] 二、检测步骤
[0326] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0327] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液(20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0328] 3)样本混合:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0329] 标准曲线组:各标准曲线点（GM抗原标准品a-e浓度分别为5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0330] 待测样本组:处理后的待测样本
[0331] 将两组样本分别与兔源抗GM抗原多克隆抗体等体积混合，转移至酶标板孔中，每 孔加入60yL，在37°C下孵育60min;
[0332] 4)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗涤液，静置40s后拍干，重复 上述洗涤操作，共洗涤3次；
[0333] 5)加入酶标二抗：洗涤结束后，每孔加入酶标羊抗兔二抗60yL，在37°C下孵育 20min；
[0334] 6)洗涤：同步骤4);
[0335] 7)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液60yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0336] 8)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0337] 9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中GM抗原的浓度值。
[0338] 实施例20曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测步骤
[0339] 一、样本的处理
[0340] 1)将待检样本与样本处理液以3:1的体积比混合后沸水浴5min。
[0341] 2)将水浴后的混合液5,000g离心5min。
[0342] 3)离心后上清液用于检测。
[0343] 二、检测步骤
[0344] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0345] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液（20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0346] 3)样本混合:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0347] 标准曲线组:各标准曲线点（GM抗原标准品a-e浓度分别为5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0348] 待测样本组:处理后的待测样本
[0349] 将两组样本分别与兔源抗GM抗原多克隆抗体等体积混合，转移至酶标板孔中，每 孔加入80yL，在37°C下孵育90min;
[0350] 4)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗涤液，静置40s后拍干，重复 上述洗涤操作，共洗涤3次；
[0351] 5)加入酶标二抗：洗涤结束后，每孔加入酶标羊抗兔二抗80yL，在37°C下孵育 40min；
[0352] 6)洗涤：同步骤4);
[0353] 7)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0354] 8)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0355] 9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中GM抗原的浓度值。
[0356] 实施例21曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测步骤
[0357] 一、样本的处理
[0358] 1)将待检样本与样本处理液以5:1的体积比混合后沸水浴lOmin。
[0359] 2)将水浴后的混合液10，OOOg离心1 Omin。
[0360] 3)离心后上清液用于检测。
[0361] 二、检测步骤
[0362] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0363] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液（20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0364] 3)样本混合:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0365] 标准曲线组:各标准曲线点（GM抗原标准品a-e浓度分别为5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0366] 待测样本组:处理后的待测样本
[0367] 将两组样本分别与兔源抗GM抗原多克隆抗体等体积混合，转移至酶标板孔中，每 孔加入100yL，在37°C下孵育120min;
[0368] 4)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗涤液，静置40s后拍干，重复 上述洗涤操作，共洗涤3次；
[0369] 5)加入酶标二抗：洗涤结束后，每孔加入酶标羊抗兔二抗100yL，在37°C下孵育 60min；
[0370] 6)洗涤：同步骤4);
[0371] 7)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液100yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0372] 8)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0373] 9)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中GM抗原的浓度值。
[0374] 实施例22曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测步骤
[0375] 一、样本的处理
[0376] 1)将待检样本与样本处理液以3:1的体积比混合后沸水浴5min。
[0377] 2)将水浴后的混合液5,000g离心5min。
[0378] 3)离心后上清液用于检测。
[0379] 二、检测步骤
[0380] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0381] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液(20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0382] 3)样本混合:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0383] 标准曲线组:各标准曲线点（GM抗原标准品a-e浓度分别为5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0384] 待测样本组:处理后的待测样本
[0385] 将两组样本分别与标记酶的抗GM抗原多克隆抗体等体积混合，转移至酶标板孔 中，每孔加入80yL，在37°C下孵育90min;
[0386] 4)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗涤液，静置40s后拍干，重复 上述洗涤操作，共洗涤3次；
[0387] 5)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0388] 6)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0389] 7)结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中GM抗原的浓度值。
[0390]实施例23曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒检测步骤
[0391] 一、样本的处理
[0392] 1)将待检样本与样本处理液以3:1的体积比混合后沸水浴5min。
[0393] 2)将水浴后的混合液5，000g离心5min。
[0394] 3)离心后上清液用于检测。
[0395] 二、检测步骤
[0396] 1)取出已预包被抗原的96孔酶标板；
[0397] 2)配制工作洗涤液:浓缩洗液稀释20 X (1份浓缩洗液(20X0.01M roS)加19份的 无菌去离子水或超纯水）；
[0398] 3)样本混合:分别设标准曲线组、待测样品组，其中
[0399] 标准曲线组:各标准曲线点（GM抗原标准品a-e浓度分别为5，2.5，1，0.5,0.25ng/ mL)
[0400] 待测样本组:处理后的待测样本
[0401] 将两组样本分别与兔源抗GM抗原多克隆抗体等体积混合，在37°C下孵育90min;
[0402] 4)样本转移:将步骤3)的混合液转移至酶标板孔中，每孔加入80yL，在37°C下孵育 40min；
[0403] 5)洗涤:甩掉反应液，每孔每次加入不少于300yL的洗涤液，静置40s后拍干，重复 上述洗涤操作，共洗涤3次；
[0404] 6)加入酶标二抗：洗涤结束后，每孔加入酶标羊抗兔抗体80yL，在37°C下孵育 30min；
[0405] 7)洗涤：同步骤5);
[0406] 8)显色:洗涤结束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0407] 9)终止:每孔内加入50yL终止液，混匀后，在0D450nm处读数；
[0408] 10)结果判断:在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算 软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中GM抗原的浓度值。
[0409] 实施例24曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的临床应用
[0410] 取实施例9的试剂盒，按照实施例20的检测步骤进行试剂盒的临床应用检测。
[0411] 1.绘制标准曲线
[0412] 取实施例9的试剂盒，按实施例20的检测步骤，得到各标准曲线点（5，2.5，1，0.5和 0.25ng/mL)的测量值如表4所示，利用表4数据，以样品中GM抗原的浓度的对数值为横轴(X 轴），以450nm处测得的吸光度值为纵轴(y轴），作标准曲线如图5所示，得到标准曲线方程 为:y = -0.156 In (x )+0.9279,线性相关度R2 = 0.9976,标准曲线方程拟合良好。
[0413] 表4检测标准曲线
[0415] 2. GM抗原免疫检测试剂盒参考值的确定
[0416] 临床确诊为曲霉菌感染阳性样本30例，正常人样本200例，将样本处理后，取实施 例9的试剂盒按照实施例20的检测步骤测定0D450值，根据标准曲线(表4,图5)计算GM抗原 浓度值，如表5所不。
[0417] 表5 GM抗原免疫检测试剂盒参考值的确定ELISA临床检测结果
[0418]
[0419] 注表示与正常人比较Ρ〈0·01;
[0420] 根据标准曲线的结果计算检测GM抗原的浓度，通过检测200例正常人样本，取95% 置信区间的抗原的浓度值为Cut-off下限：?(平均值）+2s(标准偏差）= 0.45+2*0.10 = 0.65,通过检测30例阳性病人，取95 %置信区间的抗原的浓度值为Cut-off上限：? (平均 值）一 2s (标准偏差）=1.55 - 2*0.35 = 0.85，抗原的浓度值在0.65即/1^-0.85即/1^之间为 疑似病人。即得到GM抗原免疫检测试剂盒的判断标准参考值如表6所示。
[0421] 表6 GM抗原免疫检测试剂盒判断标准参考值
[0422]
[0423] 如果样本的检测结果落在可疑区间，则需要进行第二次检测。
[0424] 实施例25试剂盒的方法学考察
[0425] 取实施例9的试剂盒按照实施例20的检测步骤进行试剂盒方法学考察(敏感性实 验、特异性实验、回收率实验、重复性实验、稳定性实验）。
[0426] 1.敏感性实验
[0427] 收集临床确诊样本20例进行检验。
[0428] 诊断敏感性=阳性样本检出例数/阳性样本总例数X 100%，实验结果见表7,由结 果可知，本实验的敏感性在85%以上。
[0429] 表7敏感性检测实验结果
[0431] 2.特异性实验
[0432] 检测20例健康人样本。
[0433] 特异性=阴性样本检出例数/阴性样本总例数X 100%，实验结果见表8,由结果可 知，本实验的特异性在90%以上。
[0434] 表8特异性检测实验结果
[0436] 3 ·回收率实验
[0437] 选择正常人血液添加曲霉半乳甘露聚糖抗原2yg/L、lyg/L后检测，计算真实值与 期望值的比值，得到回收率，见表9。回收率介于80-120%之间认为合格。由实验结果说明本 实验的回收率介于80%-120%之间，回收率良好。
[0438] 表9回收率结果实验
[0441] 4.重复性实验
[0442] 1)批间精密度
[0443] 合格标准:将同一标本每天一次测试，连续11个工作日，计算其均值M、标准差SD与 变异系数CV，变异系数CVS 25%为合格，结果见表10。结论:本产品批间精密度(即变异系数 CV)为10%，小于25%，符合标准，证明本产品批间精密度良好。
[0444] 表10批间精密度结果实验
[0447] 2)批内精密度
[0448] 合格标准:将同一标本在同一批次实验中平行测定10组数据。计算其均值M、标准 差SD与变异系数CV，变异系数CV < 15%为合格，见表11。本产品批内精密度（即变异系数CV) 为8%，小于15%，符合标准，验证合格。
[0449] 表11批内精密度结果实验
[0451 ] 5.稳定性实验
[0452] 将组装好的试剂盒在37 °C环境中放置，每天做标准曲线检测已知浓度的抗原溶 液，连续检测5天，检测值变化率（即变异系数CV)小于20%，结果参见表12,证明试剂盒稳 定。其结果显示5天的变异系数CV < 20%，说明本发明稳定性良好。
[0453] 表12稳定性试验结果
[0454]
[0455] 实施例26不同GM抗原包被液对试剂盒检测重复性的影响
[0456] 分别取实施例3-8制备的试剂盒，按照实施例20的检测步骤对同一待测样本进行 批间精密度检测，将同一标本每天一次测试，连续10个工作日，考察不同GM抗原包被液对试 剂盒检测的影响，检测结果参见下表13。
[0457] 表13
[0459]
[0460] 由表13中数据可知，各试剂盒对样本的检测结果的CV值均小于7%，表明各试剂盒 对样品的检测结果的离散程度较小，重复性较好，均可用于GM抗原的免疫检测;且实施例4 制备的试剂盒的检测样本浓度的变异系数CV值最小，表明实施例4中包被液较优。
[0461 ]实施例27不同封闭液对试剂盒检测重复性的影响
[0462] 分别取实施例9-10制备的试剂盒，按照实施例20的检测步骤对同一待测样本进行 批间精密度检测，将同一标本每天一次测试，连续10个工作日，考察不同封闭液对试剂盒检 测重复性的影响，检测结果参见下表14。
[0463] 表14
[0466] 由表14中数据可知，各试剂盒对样本的检测结果的CV值均小于7%，表明各试剂盒 对样品的检测结果的离散程度较小，重复性较好，均可用于GM抗原的免疫检测;且实施例9 制备的试剂盒的检测样本浓度的变异系数CV值最小，表明实施例4中封闭液较优。
[0467] 实施例28不同样本处理液对试剂盒检测重复性和回收率的影响
[0468] 分别取实施例11-17制备的试剂盒，按照实施例20的检测步骤对同一待测样本(浓 度已知，为1.43ng/mL)进行批间精密度和回收率检测，将同一标本每天一次测试，连续10个 工作日，考察不同样本处理液对试剂盒检测重复性和回收率的影响，检测结果参见下表15。
[0469] 表15
[0471]
[0472] 由表15中数据可知，各试剂盒对样本的检测结果的CV值均小于7%，表明各试剂盒 对样品的检测结果的离散程度较小，重复性较好，均可用于GM抗原的免疫检测;且实施例11 制备的试剂盒的检测样本浓度的变异系数CV值最小，且回收率接近100%，表明实施例11中 处理液较优。
[0473] 上述参照【具体实施方式】对该一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其 制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出 若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之 内。
【主权项】
1. 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括GM抗原包被的固相 载体、抗GM抗原多克隆抗体和GM抗原标准品，所述GM抗原标准品包括至少三种已知浓度的 GM抗原溶液，所述GM抗原标准品的浓度在0-50ng/mL范围内。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述GM抗原由下述方法得到： 将曲霉菌采用固体培养基培养至培养基长满绿色孢子;过滤除去菌丝，灭活菌体及孢 子;离心后，收集孢子并洗涤;孢子经破碎后过滤除去孢子碎片;将滤液经醇沉、洗涤后，得 到GM抗原粗提物;将GM抗原粗提物经脱色、超滤后得到所述GM抗原； 所述抗GM抗原多克隆抗体，可与GM抗原特异性结合，用SDS-PAGE显示为均一抗体产物， 用GM抗原包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1 X 105,所述抗GM抗原多克隆抗体由 下述方法得到： 用GM抗原作为免疫原免疫动物，对得到的血清进行分离纯化，得到所述抗GM抗原多克 隆抗体;其中，免疫采用皮下注射、足垫注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注射，免疫剂量为 0.01 -0. lmg，所述动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，所述纯化方法为饱和硫酸 铵盐析沉淀法和亲和层析法。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述固相载体为酶标板、微孔板、试管或微 孔滤膜，优选的，所述固相载体为酶标板。4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述抗GM抗原多克隆抗体为标记酶的抗GM 抗原多克隆抗体;或者， 所述抗GM抗原多克隆抗体为未标记酶的抗GM抗原多克隆抗体，所述试剂盒还包括酶标 二抗，所述酶标二抗可与抗GM抗原多克隆抗体相结合。5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述GM抗原标准品包括GM抗原标准品a，GM 抗原标准品b，GM抗原标准品c，GM抗原标准品d，GM抗原标准品e，其中，所述GM抗原标准品a 的浓度为5ng/mL、GM抗原标准品b的浓度为2.5ng/mL、GM抗原标准品c的浓度为Ing/mL、GM抗 原标准品d的浓度为0.5ng/mL、GM抗原标准品e的浓度为0.2 5ng/mL。6. 如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括样本处理液、 浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液，所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底 物溶液和终止液的组分及配比如下： 样本处理液：选自以下蛋白变性溶液：〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0 · 18mol/LEDTA 溶液；5-30 %DMSO 溶液； 浓缩洗液:按重量份数计为:氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6 份，磷酸二氢钾2.8份，吐温-200.2份，ProCl in3002份，超纯水1000份； 样本稀释液:含10 %脱脂乳粉的CBS稀释液； 底物溶液:TMB; 终止液:2mol/L的硫酸溶液。7. -种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下： 1)制备GM抗原包被的固相载体 配制GM抗原包被液:采用缓冲溶液将GM抗原稀释至lOOng/mL-lOyg/mL;所述缓冲溶液 选自：Tris-HCl缓冲液，PBS缓冲液，CBS缓冲液或生理盐水； 配制封闭液:将2%-8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲溶液 选自：Tris-HCl缓冲液，PBS缓冲液，CBS缓冲液或生理盐水； 包被固相载体:将配制的GM抗原包被液加入固相载体中；将固相载体置于12-18 °C恒温 包被;将配制的封闭液加入固相载体中，置于12-18Γ恒温;弃去固相载体中的封闭液，置于 20-25 °C f旦温，即得； 2) 配制标准品 用roS缓冲液配制至少三种已知浓度的GM抗原溶液，使GM抗原标准品的浓度在0-50ng/ mL范围内； 3) 制备抗GM抗原多克隆抗体 将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成。8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述的制备方法具体步骤如下： 1) 制备GM抗原包被的酶标板 配制GM抗原包被液:采用缓冲溶液将GM抗原稀释至lOOng/mL-lOyg/mL;所述缓冲溶液 选自：0 · lmo 1/LTris-HCl缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/LPBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0 ; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理盐水； 配制封闭液:将2%-8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲溶液 选自：0 · lmol/LTris-HCl缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/L PBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理盐水； 包被酶标板:将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150yL包被液； 酶标板置于12-18Γ环境下包被6-8h;将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150μΙ^?闭液，置于12-18Γ恒温箱，2-4h;从恒温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25Γ恒温 2 -4h，即得； 2) 配制标准品 将GM抗原用0. lmol/L PBS缓冲液配制，使GM抗原的浓度分别是5ng/mL，2.5ng/mL，lng/ mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL; 3) 配制标记酶的抗GM抗原多克隆抗体溶液 采用过碘酸盐氧化法或戊二醛交联法将酶标记在抗GM抗原多克隆抗体上，将标记酶的 抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成； 4) 配制样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液 所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如下： 样本处理液：选自以下蛋白变性溶液：〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0· 18mol/L EDTA溶液;5-30%DMS0溶液； 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6份， 磷酸二氢钾2.8份，吐温-20 0.2份，ProCl in300 2份，超纯水1000份，混合均匀； 样本稀释液:含10 %脱脂乳粉的CBS稀释液； 底物溶液:TMB; 终止液:2mol/L的硫酸溶液。9. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述的制备方法具体步骤如下： 1)制备GM抗原包被的酶标板 配制GM抗原包被液:采用缓冲溶液将GM抗原稀释至lOOng/mL-lOyg/mL;所述缓冲溶液 选自：Ο · lmol/LTriS-HC1 缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · Ο; Ο · lmol/L PBS缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · Ο; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理盐水； 配制封闭液:将2%-8%的新生牛血清加入缓冲溶液中，配制成封闭液;所述缓冲溶液 选自：0 · lmol/LTris-HCl缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · lmol/L PBS缓冲液，其ρΗ6 · 0-pH9 · 0; 0 · 05-0 · 2mol/L CBS缓冲液，其pH6 · 0-pH9 · 0;或生理盐水； 包被酶标板:将配制的GM抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150yL包被液； 酶标板置于12-18Γ环境下包被6-8h;将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-150μΙ^?闭液，置于12-18Γ恒温箱，2-4h;从温箱取出酶标板后弃去封闭液，20-25Γ恒温2-4h，即得； 2) 配制标准品 将GM抗原用0. lmol/L PBS缓冲液配制，使GM抗原的浓度分别是5ng/mL，2.5ng/mL，lng/ mL，0·5ng/mL，0·25ng/mL; 3) 配制抗GM抗原多克隆抗体溶液 将抗GM抗原多克隆抗体用酶偶联物稳定剂以1:20000-1:40000的比例稀释而成； 4) 配制酶标二抗溶液 将酶标二抗用酶偶联物稳定剂以1:5000-1:20000的比例稀释而成； 5) 配制样本处理液、浓缩洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液 所述的样本处理液、浓缩洗液，样本稀释液、底物溶液和终止液的组分及配比如下： 样本处理液：选自以下蛋白变性溶液，〇 . 05-0.2mg/mL蛋白酶1(;?!121!110 0.03-0· 18mol/L EDTA溶液;5-30%DMS0溶液； 浓缩洗液:按重量份数计氯化钠160.0份，氯化钾4.0份，十二水合磷酸氢二钠31.6份， 磷酸二氢钾2.8份，吐温-20 0.2份，ProCl in300 2份，超纯水1000份，混合均匀； 样本稀释液:含10 %脱脂乳粉的CBS稀释液； 底物溶液:TMB; 终止液:2mol/L的硫酸溶液。10.如权利要求1-6任一项所述的试剂盒或如权利要求7-9任一项所述制备方法得到的 试剂盒在检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原中的应用，所述应用采用竞争ELISA法。
【文档编号】G01N33/569GK105866407SQ201610261024
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】刘春龙, 彭洁, 张舟, 李宁, 粟艳, 周泽奇
【申请人】丹娜（天津）生物科技有限公司