检测hiv-1抗原用试剂及其检测方法

专利名称：检测hiv-1抗原用试剂及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测HIV-lp24抗原用试剂及其检测方法。
背景技术：
后天性免疫缺陷症候群(AIDS)是感染人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的疾病。历 来，艾滋病的诊断都是靠检测血液中的HIV抗体。然而，在HIV感染初期，血液中存在一段 抗体价不升高的空白期。因此，检测HIV抗体的检查方法有可能忽略HIV初期感染患者。为解决这种问题，检测血液中的HIV抗原的方法已为人所知。而且已知有一种检 测方法可以检测显示稳定抗原性的1型HIV病毒的P24核心蛋白质(以下称“HIV-1P24抗 原”)。这些众所周知的方法比如有登载在美国专利第5173399号公报(专利文献1)、美国 专利第4983529号公报(专利文献2)和美国专利第6432633号公报(专利文献3)等的夹 心检测法。专利文献1 美国专利第5173399号公报专利文献2 美国专利第4983529号公报专利文献3 美国专利第6432633号公报

发明内容
本发明要解决的课题血液中HIV抗原的检测因HIV抗原在血液中仅含有微量，所以要求敏感度很高。以 往的免疫检测法使用小鼠单克隆抗体作为检测HIV-lp24抗原的抗体。以此方法，当样本含 有人抗鼠抗体(HAMA)时，作为试剂含有的小鼠单克隆抗体和样本中的HAMA发生反应，有可 能得出假阳性的结果。因此，本发明的目的是提供一种既能够降低因HAMA造成的假阳性，又能高度敏感 地检测出HIV-lp24抗原的试剂及其方法。解决课题的手段本发明人完成本发明主要是发现了以下两点1)采取运用人单克隆抗体进行夹心免疫检测的方法能够高度敏感地检测出 HIV-lp24抗原；及2)使用人单克隆抗体，即使是含有HAMA的样本也可以降低假阳性。因此，本发明提供，(1) 一种检测HIV抗原用试剂，其含有第一抗体、固相和第二抗体，其中第一抗体 是用标记物标记了的识别HIV-lp24抗原的第一人单克隆抗体，第二抗体是与可结合到上 述固相上的物质结合的识别HIV-lp24抗原的第二人单克隆抗体；(2) (1)所述检测HIV抗原用试剂，它包括含有所述第一抗体的第一试剂、含有作 为所述固相的粒子的第二试剂和含有所述第二抗体的第三试剂；(3) (2)所述检测HIV抗原用试剂，所述标记物是酶，所述试剂还包括含有这种酶的底物的第四试剂；(4) (1) (3)其中之一所述检测HIV抗原用试剂，所述固相可以固定抗生物素蛋 白或链霉亲和素，可以与所述固相结合的物质是生物素；(5) (1) (4)其中之一所述检测HIV抗原用试剂，所述固相是磁性粒子；(6) 一种HIV抗原检测方法，在固相上形成包括样本中所含HIV_lp24抗原、第一抗 体和第二抗体在内的复合物，根据此复合物中所含上述标记物检测HIV抗原。其中，第一抗 体为标记物标记的识别HIV-lp24抗原的第一人单克隆抗体，第二抗体为结合了可与固相 结合的物质的识别HIV-lp24抗原的第二人单克隆抗体；(7) (6)所述HIV抗原检测方法，该方法包括以下步骤混合所述抗原和所述第一 抗体；混合上述混合步骤获得的混合物、所述固相粒子和所述第二抗体，在该粒子上形成所 述复合物；及根据在上述粒子上形成的所述复合物中所含标记物，检测HIV抗原；(8) (6)所述HIV抗原检测方法，该方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述抗 原和所述第一抗体；第二混合步骤，混合第一混合步骤获得的混合物和作为所述固相的粒 子；复合物形成步骤，混合第二混合步骤获得的混合物和所述第二抗体，在上述粒子上形成 所述复合物；检测步骤，根据在上述粒子上形成的所述复合物中所含所述标记物，检测HIV 抗原；(9) (6)所述HIV抗原检测方法，该方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述抗 原和所述第一抗体；第二混合步骤，混合第一混合步骤获得的混合物和所述第二抗体；复 合物形成步骤，混合第二混合步骤获得的混合物和作为所述固相的粒子，在上述粒子上形 成所述复合物；检测步骤，根据在上述粒子上形成的所述复合物中所含标记物，检测HIV抗 原；(10) (6)所述HIV抗原检测方法，该方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述 抗原和所述第一抗体；第二混合步骤，混合作为所述固相的粒子和所述第二抗体；复合物 形成步骤，混合第一混合步骤获得的混合物和第二混合步骤获得的混合物，在所述粒子上 形成所述复合物；检测步骤，根据在上述粒子上形成的所述复合物中所含所述标记物，检测 HIV抗原；(11) (7) (10)其中之一所述HIV抗原检测方法，所述标记物是酶，该方法还有使 该酶的底物与在所述粒子上形成的所述复合物混合的步骤，所述检测步骤根据上述酶与上 述底物的反应检测HIV抗原；(12) (11)所述HIV抗原检测方法，所述底物是发光底物或显色底物，所述检测步 骤是通过检测所述酶与所述底物发生反应所发出的光或显现的颜色来检测HIV抗原；(13) (6) (12)其中之一所述HIV抗原检测方法，所述固相是磁性粒子。本发明的效果本发明的检测HIV抗原用试剂及其检测方法是用人单克隆抗体检测HIV抗原。因 此，即使样本中含有HAMA也可以减少假阳性的结果。而且可以比传统方法更敏感地检测 HIV-lp24。从而可以减少检测HIV抗原所需的样本量。进而即使不对样本进行前处理也可 以提供高精度结果。由此得以减少检查的烦琐。


图1为本发明的包含第一试剂、第二试剂和第三试剂的检测HIV抗原用试剂的示 意图；图2为本发明HIV抗原检测方法的反应过程的示意图。
具体实施例方式本发明的检测HIV抗原用试剂含有用标记物标记了识别HIV_lp24抗原的第一人 单克隆抗体的第一抗体、固相和将能与该固相结合的物质结合到识别HIV-lp24抗原的第 二人单克隆抗体的第二抗体。本发明的检测HIV抗原用试剂包含由单一试剂和数种试剂构 成的试剂盒。在本发明的检测HIV抗原用试剂中，第一抗体、固相和第二抗体可以分别含在 各试剂中，也可以第一抗体、固相和第二抗体中任意二个或全部含在同一试剂中。比如有的 试剂盒包括含第一抗体的试剂和含固相及第二抗体的另一种试剂。此时，第二试剂中的第 二抗体也可以与固相结合。也有的试剂第一抗体、固相和第二抗体全都包括。此时，试剂中 的第二抗体也同样可以结合在固相中。本发明的检测HIV抗原用试剂最好是各试剂分别含有第一抗体、固相和第二抗体的 试剂盒。在此，作为包含在试剂中的固相可以列举出后述粒子。即，试剂盒最好包括含有上述 第一抗体的第一试剂、含有上述固相粒子的第二试剂和含有上述第二抗体的第三试剂。图1显示的是该试剂盒的第一试剂、第二试剂和第三试剂的示意图。第一试剂含 有第一抗体，第二试剂含有作为固相的粒子，第三试剂含有第二抗体。本发明使用的识别HIV_lp24抗原的第一和第二人单克隆抗体只要是能够识别 HIV-lp24抗原的人单克隆抗体即可，无特别限定。抗体的类型无特别限定，包含IgG、IgM 等。该抗体只要能识别HIV-lp24抗原，也可以是抗体的片段及其衍生物。作为抗体的片段 可列举出Fab片段、F(ab，)片段、Fab，片段和sFv片段等。这些片段可以通过用诸如胃蛋 白酶(Pepsin)处理等众所周知的传统方法对抗体进行处理获得。识别HIV_lp24抗原的人单克隆抗体可以用本技术领域熟知的方法获得。比如可 以列举出以下方法(1)使感染HIV患者的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。再选择产生目标单克隆 抗体的杂交瘤。用所选杂交瘤培养，获得抗体；(2)用HIV_lp24抗原对能产生人类免疫球蛋白的哺乳动物(如基因小鼠 (XEN0M0USE，注册商标))进行免疫，获得目标抗体；(3)使从HIV感染患者的血液采集的B淋巴细胞感染疱疹病毒(Epstein-Barr virus)。再筛选产生目标抗体的B淋巴细胞。将克隆所筛选B淋巴细胞获得的产生目标抗 体的基因植入CH0(中国仓鼠卵巢)细胞等哺乳动物细胞，获得目标抗体。也可购买市售产品。具体地说有Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86， PP. 1624-1628，1989上登载的识别HIV_lp24抗原的人单克隆抗体和可以从比利时生物医 药公司(BioMARIC，比利时)购买的识别HIV-lp24抗原的人单克隆抗体等。在本发明中最好使用从比利时生物医药公司(BioMARIC，比利时)购买的人单抗 体作为上述第一和第二人单克隆抗体。上述第一和第二人单克隆抗体分别是可以识别抗原不同部位(表位)的抗体。
上述第一抗体用可检出的标记物标记。该标记物无特别限定，是普通免疫测定方 法中可用的标记物即可。比如可以是酶、荧光物质、放射性同位素等。作为酶如有碱性磷酸酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。作 为荧光物质如有异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白质(GFP)、萤光素等。作为放射性同 位素如有125I、14C、32P等。上述标记物最好是酶，尤以碱性磷酸酶(ALP)为宜。标记物标记第一人单克隆抗体的方法用该领域常用的方法即可，如众所周知的用 抗体中的硫醇基(-SH基)使标记物与抗体结合的方法。具体而言，使导入了可与硫醇基 反应的官能基如马来酰亚胺基的标记物与第一人单克隆抗体反应，标记物即可标记上述抗 体。上述第二抗体可与固相结合。第二抗体和固相的结合最好是第二抗体上可结合到 固相的物质(以下有时称“固相结合物”)与固定在固相上的结合物之间的结合。上述固相结合物与结合物在运用HIV_lp24抗原检测方法的条件下，只要是能特 异性结合的物质组合即可，无特别限定。作为这些组合，如有生物素与亲和素或链霉亲和 素、半抗原和抗半抗原抗体、镍和组氨酸标签、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶等。作为半 抗原和抗半抗原抗体如有二硝基酚(DNP)和抗DNP抗体。上述第二抗体与固相之间的结合最好是生物素与亲和素或链霉亲和素的结合。因 此，固相结合物与结合物的组合最好是生物素与亲和素或链霉亲和素的组合。在此，固相结合物与结合物的组合从可进行上述特异性结合的物质组合中选择即 可，无特别限定。比如，当固相结合物包含生物素时，结合物是亲和素或链霉亲和素。反之， 当固相结合物包含亲和素或链霉亲和素时，结合物是生物素。在此，最好固相结合物含生物 素，结合物是亲和素或链霉亲和素。换言之，最好第二抗体是结合生物素的抗体，固相是固 定有亲和素或链霉亲和素的固相。让上述固相结合物结合到第二人单克隆抗体、获得可与固相结合的第二抗体的方 法在该领域是众所周知的。比如，可以用含有对抗体中的一级氨基(-NH2基)和硫醇基等 有反应的官能基使磁性粒子结合物附加到第二人单克隆抗体上。作为与一级氨基有反应的 官能基如有琥珀酰亚胺基(NHS基)等，作为与硫醇基有反应的官能基如有马来酰胺基等。上述固相材料是免疫测定用的普通固相材料即可，无特别限定。比如可以是胶乳、 橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯 酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸环氧丙酯、丙烯醛一 乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏氟乙烯(PVDF)、硅等聚合物材料；琼脂糖；明胶；红细 胞；硅胶、玻璃、无活性矾土、磁体等无机材料等。也可以将其中的一种或二种以上组合起来 使用。固相的形状只要是用于免疫测定的普通固相形状，无特别限定，可以是微量滴定 板、试管、粒子等。在此，作为试剂中所含的固相最好是粒子。固相是粒子容易添加到试剂 中。作为粒子如有磁性粒子、胶乳粒子、红细胞、明胶粒子等。让上述结合物也可以直接固定到固相上。还可以固定到事先包被在固相表面的物 质上。比如，固相表面有氨基、羧基等亲水基时，通过让结合物以化学反应结合到该亲水基， 即可固定到固相上。当固相表面被聚合物和蛋白质等物质包被时，通过用化学结合和分子间力使结合物结合到该物质即可固定到固相上。本发明的固相最好是磁性粒子。该磁性粒子是以有磁性的材料为基材的粒子。这 种磁性粒子在该技术领域已周知，作为基材已知使用Fe2O3及/或Fe3O4、钴、镍、铁酸盐、磁 铁矿等。作为理想的磁性粒子可列举出以下几种(1)磁性粒子表面被聚合物和蛋白质等包被的磁性粒子；(2)磁性粒子表面露出羧基的磁性粒子；(3)有磁性的基材分散在树脂中的磁性粒子。这些磁性粒子能够轻松地固定上述 结合物。让上述结合物固定在磁性粒子的方法为在该技术领域众所周知的方法。如可采用 物理吸附法、共有结合法、离子结合法和这些方法的组合等。比如，当让亲和素或链霉亲和素固定到磁性粒子时，可以用表面露出羧基的磁性 粒子，通过化学反应使亲和素或链霉亲和素固定在磁性粒子上。更具体地说，在有水溶性碳 二亚胺等脱水缩合剂参与的情况下，使亲和素或链霉亲和素分子中的氨基与露出粒子表面 的羧基反应形成氨基化合物，以此使亲和素或链霉亲和素固定到磁性粒子。当磁性粒子表 面被聚合物和蛋白质等物质包被时，可以用化学结合和分子间力使亲和素或链霉亲和素结 合到该物质来固定到固相上。当磁性粒子的结构是有磁性的基材分散在树脂中时，可以用 化学结合和分子间力使亲和素或链霉亲和素结合到该树脂来固定到固相上。本发明的检测HIV用试剂除第一抗体、固相和第二抗体外，还可以包含不影响 HIV-lp24抗原检测及/或能促进检测的其他成分。所谓其他成份有表面活性剂、防腐剂、血 清蛋白质等。比如当试剂盒包括含第一抗体的第一试剂、含固相粒子的第二试剂和含第二 抗体的第三试剂时，组成试剂盒的各试剂可以包含上述其他成份。本发明的检测HIV用试剂可以将第一抗体、作为固相的粒子和第二抗体与上述其 他成份一起悬浊或溶解在适当溶剂中形成液体的状态。也可以经冷冻干燥等处理将该液体 转为固体状态。本发明的检测HIV用试剂最好是液体。比如当试剂盒包括含第一抗体的第 一试剂、含固相粒子的第二试剂和含第二抗体的第三试剂时，最好试剂盒的第一试剂、第二 试剂和第三试剂均为液体。所谓适当的溶剂只要是不妨碍HIV_lp24检测的溶剂，没有特别限制。比如可 以使用磷酸盐缓冲液(PBS)、三乙醇胺缓冲液(TEA)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 (Tris-HCl)等。第一试剂、第二试剂和第三试剂的pH最好为6. 0 10. 0左右。上述第一抗体和第二抗体，当然也因所用抗体的种类不同而各异，但这些抗体与 样本中可能存在的抗原发生反应时，最好对于该抗原来说数量过剩。即，与抗原反应时的第 一和第二抗体的浓度以0.01 lOyg/ml为宜，最好是0. 1 Syg/ml。当上述检测HIV用试剂中的固相为磁性粒子时，检测HIV用试剂以含有0. 1 20mg/ml的磁性粒子为宜，最好含有1 10mg/ml磁性粒子。当标记上述第一抗体的标记物是酶时，本发明的检测HIV用试剂最好是有含该酶 相应底物的其他试剂的试剂盒。比如当试剂盒包括含第一抗体的第一试剂、含固相粒子的 第二试剂和含第二抗体的第三试剂时，最好还有含该酶相应底物的第四试剂。该酶相应 的底物可根据上述作为标记物例示的酶，使用一直为人所知的化学发光底物和生物发光碱性磷酸酶为上述酶时，作为底物如有AMPPD(注 册商标)(3- (2，-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3，，-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧环乙烷)、 CDP-star (注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2，-(5，-氯)三环 [3.3. 1. I3'7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠)、CSPD (注册商标)(3-(4_甲氧基螺{1，2_ 二氧 杂环丁烷_3，2-(5，-氯)三环[3. 3. 1. I3'7]癸烷}-4_基)苯基磷酸二钠)等化学发光底 物和P-硝基苯基磷酸盐、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、碘硝基 四唑(INT)等显色底物。本发明的检测HIV用试剂还可以含有清洗液。比如当试剂盒包括含第一抗体的 第一试剂、含固相粒子的第二试剂和含第二抗体的第三试剂时，最好作为另一试剂还含有 清洗液。该清洗液最好是PH6.0 10.0左右的缓冲液，如有2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液 (MES)、磷酸盐缓冲液(PBS)等。本发明还提供检测HIV_lp24抗原的方法(以下也简称为“检测方法”)。本发明的检测方法是在固相上形成包括样本中所含的HIV_lp24抗原、第一抗体 和第二抗体的复合物，根据此复合物中所含有的标记物检测HIV抗原，其中第一抗体是用 标记物标记能识别HIV-lp24抗原的第一人单克隆抗体形成的抗体，第二抗体是将能与固 相结合的物质结合到识别HIV-lp24抗原的第二人单克隆抗体形成的抗体。即，本发明的检 测方法只要能运用第一抗体和抗原及在固相上形成的第二抗体和抗原的利用抗原_抗体 反应的夹心检测法检测目标抗原(HIV-lp24抗原)即可，无特别限定。比如当检测所用试剂盒包括含第一抗体的第一试剂、含固相粒子的第二试剂和含 第二抗体的第三试剂时，可能含HIV-lp24抗原的样本、第一试剂、第二试剂和第三试剂按 各种顺序混合皆可。本发明的检测方法最好先进行混合HIV_lp24抗原和第一抗体的步骤。上述抗原 和第一抗体在此步骤中接触，形成由HIV-lp24抗原和第一抗体构成的复合物。然后再用第 二抗体在固相上形成包括HIV-lp24抗原、第一抗体和第二抗体的复合物，根据该复合物所 含上述标记物检测HIV抗原。按此顺序检测HIV抗原，可以更敏感地检测出目标抗原。图 2示意性地显示了按此顺序用第一和第二抗体捕捉HIV抗原的过程。比如，当使用的试剂盒有含第一抗体的第一试剂、含固相粒子的第二试剂和含第 二抗体的第三试剂时，理想的检测方法包括以下步骤(a)步骤混合HIV_lp24抗原和第一试剂，形成由HIV_lp24抗原和第一抗体构成 的复合物；(b)步骤用第三试剂中所含的第二抗体使在(a)步骤获得的复合物形成到第二 试剂中所含的固相粒子上；(c)步骤检测出在(b)步骤在上述粒子上形成的上述复合物中第一抗体的标记 物。用此检测方法可以更敏感地检测HIV抗原。关于混合抗原和第一抗体步骤之后进行的用上述第二抗体在固相上形成包括 HIV-lp24抗原、第一抗体和第二抗体的复合物的步骤，可以列举出以下(1) (4)种(1)混合在混合步骤中获得的混合物、上述作为固相的粒子和上述第二抗体在混合步骤获得的混合物中包括第一抗体_抗原构成的复合物(以下有时称“第 一抗体_抗原复合物”)。在(1)的情况下，第一抗体_抗原复合物同时与第二抗体和粒子
9接触。第二抗体与该复合物结合形成由第一抗体-抗原-第二抗体构成的复合物(有时称 “第一抗体-抗原-第二抗体复合物”)后，与粒子结合。或者第二抗体与粒子结合后，与第 一抗体_抗原复合物结合。结果在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。(2)将在混合步骤获得的混合物和上述作为固相的粒子混合后，再混入第二抗 体在(2)的情况下，混合物中的第一抗体-抗原复合物先与粒子接触。第一抗体-抗 原复合物没有与粒子的结合位点。因此，第一抗体-抗原复合物不与粒子结合。接着让第 二抗体与抗原_第一抗体复合物和粒子接触。于是，第二抗体与抗原_第一抗体复合物结 合，形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物后，与粒子结合。或者，第二抗体与粒子结合后， 与抗原_第一抗体复合物结合。从而在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。(3)将在混合步骤获得的混合物和上述第二抗体混合后，再混入上述作为固相的 粒子在(3)的情况下，混合物中的第一抗体-抗原复合物先与第二抗体接触。以此形成 第一抗体_抗原_第二抗体复合物。然后，第一抗体_抗原_第二抗体复合物再与粒子接 触。以此第一抗体-抗原-第二抗体复合物与粒子结合。结果在粒子上形成第一抗体-抗 原-第二抗体复合物。(4)将上述作为固相的粒子和上述第二抗体混合后形成的混合物与混合步骤获得 的混合物混合在(4)的情况下，首先第二抗体与粒子接触。从而，第二抗体与粒子结合。再让混 合物中的第一抗体-抗原复合物与结合在粒子上的第二抗体接触。以此结合在粒子上的第 二抗体与第一抗体一抗原复合物。结果在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。 有时未结合到粒子的第二抗体与抗原_第一抗体复合物结合，形成第一抗体_抗原一第二 抗体复合物后，在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。当检测方法所用试剂盒包括含第一抗体的第一试剂、含作为固相的粒子的第二试 剂和含第二抗体的第三试剂时，上述步骤(b)或者采取(bl)方式，即混合在步骤(a)形成 的复合物、第二试剂和第三试剂；或者采取(b2)方式，即混合在步骤(a)形成的复合物和第 二试剂后再混入第三试剂；或者采取(b3)方式，即混合在步骤(a)形成的复合物和第三试 剂后，再混入第二试剂；或者采取(b4)方式，即混合第二试剂和第三试剂后再混入在步骤 (a)形成的复合物。上述各种情况下可出现的反应如下当采取(bl)方式混合在步骤(a)形成的复合物、第二试剂和第三试剂时在步骤(a)形成的抗原-第一抗体复合物与第三试剂中的第二抗体和第二试剂中 的粒子同时接触。第二抗体与抗原-第一抗体复合物结合形成第一抗体-抗原-第二抗体 复合物后，与粒子结合。或者第二抗体与粒子结合后，与抗原-第一抗体复合物结合。结果 可在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。当采取(b2)方式混合在步骤(a)形成的复合物和第二试剂后再混入第三试剂 时在步骤(a)形成的抗原-第一抗体复合物先与粒子接触。此时，第一抗体和抗原 都没有与粒子的结合位点。因此，抗原-第一抗体复合物不与粒子结合。接着让含在第三
10试剂中的第二抗体与抗原-第一抗体复合物和粒子接触。于是，第二抗体与抗原-第一抗 体复合物结合，形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物后，与粒子结合。或者，第二抗体与 粒子结合后，与抗原_第一抗体复合物结合。从而得以在粒子上形成第一抗体-抗原-第 二抗体复合物。当采取(b3)方式混合在步骤(a)形成的复合物和第三试剂后，再混入第二试剂 时在步骤(a)形成的抗原-第一抗体复合物先与第三试剂中的第二抗体接触。以此 形成第一抗体-抗原-第二抗体复合物。然后，再让第二试剂中所含的粒子与第一抗体-抗 原_第二抗体复合物接触。结果能够在粒子上形成第一抗体_抗原_第二抗体复合物。当采取(b4)方式混合第二试剂和第三试剂后再混入在步骤(a)形成的复合物 时先让第三试剂中的第二抗体与第二试剂中的粒子接触，于是，第二抗体的全部或 部分与粒子结合。再让在步骤(a)形成的抗原-第一抗体复合物与第二试剂和第三试剂的 混合物混合。以此结合在粒子上的第二抗体与该复合物结合，在粒子上形成第一抗体-抗 原_第二抗体复合物。或者，未结合到粒子的第二抗体与抗原_第一抗体复合物结合，形成 第一抗体_抗原_第二抗体复合物，此复合物与粒子结合。结果也能在粒子上形成第一抗 体-抗原-第二抗体复合物。在本发明的方法中，上述第一抗体和第二抗体虽然因所用抗体的种类不同而各 异，但最好对于样本中可能含有的抗原以过剩量发生反应。即，与抗原反应时第一抗体和第 二抗体的浓度以0. 01 10 μ g/ml为宜，最好是0. 1 5 μ g/ml。上述检测HIV用试剂最好 含有的第一和第二抗体的浓度能够满足如此量的抗体。当上述固相为磁性粒子时，磁性粒子的浓度以0. 1 20mg/ml为宜，最好以1 10mg/ml的浓度存在。根据上述标记物检测HIV抗原的方法可依标记物种类适当选择。即，标记物是放 射性同位素时，可以用测定放射能的方法，该方法应用闪烁计数器等众所周知的仪器。当标 记物为荧光物质时，可以使用用化学发光酶标仪等众所周知的仪器测定荧光的方法。最好 上述标记物是酶，使该酶与上述第四试剂中的酶的底物发生反应，检测所得发光或显色。发 光或显色的检测可以用分光光度计、化学发光酶标仪等众所周知的仪器进行。当上述标记物是酶时，上述检测方法还具有将该酶的底物和在粒子上形成的第一 抗体_抗原_第二抗体复合物混合的步骤。上述检测步骤根据上述酶和上述底物发生的反 应检测HIV抗原。在此，作为底物有上述发光底物和显色底物。当用发光底物或显色底物 作为底物时，通过检测酶与底物反应产生的发光或显色即可检测出HIV抗原。在此，所谓检测是一种也包含测定的概念。与标准物检测一样，标记物的测定也可 以根据标记物的种类使用众所周知的传统装置进行。用测定的值通过从含有已知浓度的 HIV-lp24抗原的溶液获得的标准曲线，也可以定量样本中的HIV-lp24抗原含量。
实施例下面用实施例进一步详细说明本发明的内容，但本发明不受以下实施例限制。先就实施例1 7以及比较例1中所用试剂的制备方法进行说明。
(1)生物素标记抗p24人单克隆抗体的制备从比利时生物医药公司(BioMARIC，比利时)购买了识别位点不同的二种抗p24人 单克隆抗体。使所购两种抗P24人单克隆抗体中的一种与按传统方法制备的生物素_马来 酰亚胺反应，获得生物素标记抗P24人单克隆抗体。(2)生物素标记抗p24鼠单克隆抗体的制备从比利时生物医药公司(BioMARIC，比利时)购买抗p24鼠单克隆抗体。将抗p24 鼠单克隆抗体与按常法制备的生物素_马来酰亚胺反应，获得生物素标记抗P24鼠单克隆 抗体。(3)碱性磷酸酶(ALP)标记抗p24人单克隆抗体的制备将购自比利时生物医药公司(BioMARIC，比利时)的识别位点不同的两种抗p24人 单克隆抗体中与在(1)中进行生物素标记的抗体不同的另一抗P24人单克隆抗体与按常法 制备的ALP-马来酰亚胺反应，获得ALP标记抗p24人单克隆抗体。(4)碱性磷酸酶(ALP)标记抗p24Fab，的制备将与上述(3)为进行ALP标记而选择的抗体相同的抗p24人单克隆抗体按常法 进行胃蛋白酶消化，制备Fab’后，和(3) —样与ALP-马来酰亚胺反应，获得ALP标记抗 p24Fab'。按以下三种测定顺序，用夹心检测法测定HIV-1P24抗原。在以下步骤中，抗体经抗体缓冲液(0. IM MES (2-氮氧六环乙磺酸)(ρΗ 6. 0)U% 牛血清白蛋白、0. 15M氯化钠(NaCl), 0. 叠氮化钠)稀释。测定顺序11)在反应容器中加入碱性磷酸酶(ALP)标记抗p24单克隆抗体或ALP标记抗 p24Fab，(0. lU/mL) 50 μ L作为标记物标记的第一抗体，加入HIV_lp24抗原溶液(浓度0或 325pg/mL、BioMARIC公司制)50 μ L作为试样，42°C反应2分钟。2)添加链酶亲和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸钠缓冲液(ρΗ 7. 5)中 浓度为5mg/mL)30y L，42°C反应2. 5分钟。3)作为能与磁性粒子结合的第二抗体添加上述生物素标记抗p24人单克隆抗体 (0. 8μ g/mL)50y L，42°C反应2. 5分钟后，进行磁分离。4)加入清洗液(0.01M 2-氮氧六环乙磺酸(ρΗ 6. 5)、0. 1 %叠氮化钠)100 700 μ L搅拌，进行磁分离。此清洗操作共进行4次。5)加入分散液(0.01Μ 2-氮氧六环乙磺酸(ρΗ 6. 5)、0. 1 %叠氮化钠)50 μ L搅
拌，分散链酶亲和素磁性粒子。6)加入发光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 搅拌，42°C反 应5分钟，用化学发光酶标仪测定发光强度。测定顺序21)在反应容器中，作为能与磁性粒子结合的第二抗体添加生物素标记抗p24人单 克隆抗体(0. 8 μ g/mL) 50 μ L，加入HIV_lp24抗原溶液(浓度0或325pg/mL) 50 μ L作为试 样，42°C反应2分钟。2)添加链酶亲和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸钠缓冲液(ρΗ 7. 5)中 浓度 5mg/mL) 30 μ L，42°C 反应 2. 5 分钟。
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3)添加碱性磷酸酶(ALP)标记抗p24单克隆抗体或ALP标记抗p24Fab’ (0. IU/ mL) 50 μ L作为标记物标记的第一抗体，42°C反应2. 5分钟后，进行磁分离。4)加入清洗液100 700μ L搅拌，进行磁分离。此清洗操作共进行4次。5)加入分散液50 μ L搅拌，分散链酶亲和素磁性粒子。6)加入发光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 搅拌，42°C反 应5分钟，用化学发光酶标仪测定发光强度。测定顺序31)在反应容器中，作为能与磁性粒子结合的第二抗体添加生物素标记抗p24单克 隆抗体(0. 8 μ g/mL) 50 μ L，加入HIV_lp24抗原溶液(浓度0或325pg/mL) 50 μ L作为试样， 42 °C反应2分钟。2)添加链酶亲和素磁性粒子(平均粒子2 μ m、在20mM磷酸钠缓冲液(pH 7. 5)中 浓度为5mg/mL) 30 μ L，42°C反应2. 5分钟后，进行磁分离。3)加入清洗液100 700μ L搅拌，进行磁分离。此清洗操作共进行4次。4)添加ALP标记抗ρ24单克隆抗体或ALP标记抗p24Fab，(0. lU/mL) 50 μ L作为 标记物标记的第一抗体，42°C反应2. 5分钟后，进行磁分离。5)加入清洗液100 700μ L搅拌，进行磁分离。此清洗操作共进行4次。6)加入分散液50 μ L搅拌，分散链酶亲和素磁性粒子。7)加入发光底物液(CDP-Star, Applied Biosystems 公司)100 μ L 搅拌，42°C反 应5分钟，用化学发光酶标仪测定发光强度。实施例1用上述(1)制备的生物素标记抗p24抗原人单克隆抗体(0. 8 μ g/mL)和上述(3) 制备的ALP标记抗p24抗原人单克隆抗体按测定顺序1进行测定。比较例1用上述⑵制备的生物素标记抗p24鼠单克隆抗体(0. 8,4. 0,8.0 μ g/mL)取代实 施例1的生物素标记抗P24抗原人单克隆抗体，按测定顺序1测定。根据上述实施例1和比较例1获得的结果，求出用含HIV_lp24抗原的试样(抗原 溶液)获得的结果(特异性信号)与不含HIV-lp24抗原的试样获得的结果(非特异性信 号)之比(信/噪比；S/N比)。结果见表1。[表1]比较例1实施例1p24抗原浓 度 (p g/mL)抗体用量(μ g/mL)8 4 0.80.8发光强度发光强度发光强度发光强度02,0442,0252,0502,387325320,192643,855232,6171,220,458S/N比157318113511从上述结果得知，按照本发明使用抗p24人单克隆抗体，在抗体用量同样 (0. 8 μ g/mL)的情况下，HIV-lp24抗原测定中的S/N比及特异性信号比抗p24鼠单克隆抗 体高出近5倍。还可以看出，连抗p24鼠单克隆抗体表现出最高特异性信号的4. 0 μ g/mL其 特异信号都在一半以下，因此，使用抗P24人单克隆抗体可以高敏感度地检测出HIV-lp24 抗原。实施例2用与实施例1同样的抗体、即上述(1)制备的生物素标记抗P24人单克隆抗体和 上述⑶制备的ALP标记抗p24人单克隆抗体(以下称“ IgG-ALP”)按测定顺序1进行测定。实施例3用与实施例2同样的抗体，按测定顺序2进行测定。实施例4用与实施例2同样的抗体，按测定顺序3进行测定。实施例5用上述⑷制备的ALP标记抗p24Fab，(Fab，-ALP)取代实施例2的ALP标记抗 P24人单克隆抗体，按测定顺序1进行测定。实施例6用与实施例5同样的抗体，按测定顺序2进行测定。实施例7用与实施例5同样的抗体，按测定顺序3进行测定。根据上述实施例2 7所得结果，求出用含HIV_lp24抗原的试样(抗原溶液)获 得的结果(特异性信号)与不含HIV-lp24抗原的试样获得的结果(非特异性信号)之比 (信/噪比；S/N比)。结果见表2和表3。[表2]
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[表 3] 从上述结果得知，按照本发明，使用抗p24人单克隆抗体，无论以测定顺序1 3 的哪一种反应顺序，也无论抗体是IgG-ALP还是Fab’ -ALP，都能看到特异性信号。还可以 知道，其中使用测定顺序1，S/N比更高，使用IgG-ALP可以比使用Fab’ -ALP更敏感地检测 抗原。实施例8及比较例2用上述(4)制备的ALP标记抗p24抗原人单克隆抗体作为第一抗体、上述(1)制备 的生物素标记抗P24抗原人单克隆抗体(0. 8 μ g/mL)作为第二抗体、市售HIV血清转化盘 样本[HIV Seroconversion panel BB(PRB925) (BBI 公司)]，按测定顺序 1 检测 HIV_lp24 抗原。按照实施例8的顺序检测HIV抗原的结果见表4。作为比较例2，用市售HIV_lp24 抗原检测用试剂LumipulseI HIV_lp24(注册商标，富士 REBIO公司制)，测定上述HIV 血清转化盘样本，结果如LumipulseI HIV_lp24的附属文件上所述。在此，LumipulseI HIV-lp24作为检测HIV-lp24抗原用抗体使用的是抗p24抗原鼠单克隆抗体。而且，在运 用Lumipulsel HIV_lp24时，试样的前处理是在试剂中添加含表面活性剂聚氧乙烯辛基苯 酚醚(Polyoxyethylene octyl phenol ether)的样本处理液进行搅拌。[表 4] 正如从表4看出，在运用LumipulseI HIV_lp24时，从初次采血起的第10天检测 出HIV-lp24抗原。与此相比，用本发明的抗p24人单克隆抗体检测HIV抗原时，从初次采 血的第7天即可检测出HIV-lp24抗原。即，使用本发明的抗p24人单克隆抗体检测HIV抗 原可以比Lumipulsel HIV_lp24早3天检测出HIV_lp24抗原。显然，在本发明的检测HIV 抗原中，即使不像Lumipulsel HIV_lp24那样进行试样的前处理也可以高敏感度地检测出 HIV-lp24 抗原。本申请与2007年12月28日申请的日本国专利申请特愿2007-340370号相关，此 专利要求范围、说明书、附图及摘要均可作为本说明书的参考。
权利要求
一种检测HIV抗原用试剂，包括第一抗体，用标记物标记的识别HIV 1p24抗原的第一人单克隆抗体抗体；固相；第二抗体，与能结合到所述固相上的物质结合的识别HIV 1p24抗原的第二人单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测HIV抗原用试剂，其特征在于还包括含有所述第一抗 体的第一试剂、含有作为所述固相的粒子的第二试剂和含有所述第二抗体的第三试剂。
3.根据权利要求2所述的检测HIV抗原用试剂，其特征在于所述标记物是酶，所述试 剂还包括含有所述酶的底物的第四试剂。
4.根据权利要求1所述的检测HIV抗原用试剂，其特征在于所述固相能够固定抗生 物素蛋白或链霉亲和素，能够与所述固相结合的物质是生物素。
5.根据权利要求1所述的检测HIV抗原用试剂，其特征在于所述固相是磁性粒子。
6.一种HIV抗原检测方法，其特征在于在固相上形成包含有第一抗体、第二抗体和样 本中所含的HIV-lp24抗原的复合物，其中所述第一抗体为标记物标记的识别HIV-lp24抗 原的第一人单克隆抗体，所述第二抗体为结合了能与所述固相结合的物质的识别HIV-lp24 抗原的第二人单克隆抗体；根据所述复合物中所含的所述标记物检测HIV抗原。
7.根据权利要求6所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤混合所述抗原和所述第一抗体；混合所述混合步骤获得的混合物、所述固相粒子和所述第二抗体，在所述粒子上形成 所述复合物；及根据在所述粒子上形成的所述复合物中所含的所述标记物，检测HIV抗原。
8.根据权利要求6所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述抗原和所述第一抗体；第二混合步骤，混合所述第一混合步骤获得的混合物和作为所述固相的粒子； 复合物形成步骤，混合所述第二混合步骤获得的混合物和所述第二抗体，在所述粒子 上形成所述复合物；检测步骤，根据在所述粒子上形成的所述复合物中所含的所述标记物，检测HIV抗原。
9.根据权利要求6所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述抗原和所述第一抗体； 第二混合步骤，混合所述第一混合步骤获得的混合物和所述第二抗体； 复合物形成步骤，混合所述第二混合步骤获得的混合物和作为所述固相的粒子，在所 述粒子上形成所述复合物；检测步骤，根据在所述粒子上形成的所述复合物中所含的所述标记物，检测HIV抗原。
10.根据权利要求6所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述检测方法包括以下步骤第一混合步骤，混合所述抗原和所述第一抗体；第二混合步骤，混合作为所述固相的粒子和所述第二抗体；复合物形成步骤，混合所述第一混合步骤获得的混合物和所述第二混合步骤获得的混 合物，在所述粒子上形成所述复合物；检测步骤，根据在所述粒子上形成的所述复合物中所含的所述标记物，检测HIV抗原。
11.根据权利要求7所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述标记物是酶，所述检 测方法还包括使所述酶的底物与在所述粒子上形成的所述复合物混合的步骤，所述检测步 骤根据所述酶与所述底物的反应检测HIV抗原。
12.根据权利要求11所述HIV抗原检测方法，其特征在于所述底物是发光底物或显 色底物，所述检测步骤是通过检测所述酶与所述底物发生反应所发出的光或显现的颜色来 检测HIV抗原。
13.根据权利要求6所述的HIV抗原检测方法，其特征在于所述固相是磁性粒子。
全文摘要
本发明提供一种检测HIV抗原用试剂，其含有第一抗体、固相和第二抗体，其中第一抗体是用标记物标记了的识别HIV-1p24抗原的第一人单克隆抗体，第二抗体是与可结合到上述固相上的物质结合的识别HIV-1p24抗原的第二人单克隆抗体。
文档编号G01N33/543GK101910843SQ20088012273
公开日2010年12月8日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月28日
发明者大木卓, 宫地峰辉 申请人:希森美康株式会社