一种检测寄生曲霉菌的lamp引物及包含该引物的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测寄生曲霉菌的LAMP引物W及包含该引物的试剂盒，同时涉 及一种使用包含该引物的试剂盒快速检测寄生曲霉菌的方法。属于食品安全检测及微生物 检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 寄生曲霉菌是曲霉属真菌中常见的腐生菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉 腐的有机物上。黄曲霉毒素是真菌产生的有毒次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和溜 曲霉等霉菌代谢产生，尤其W黄曲霉菌和寄生曲霉菌的研究报道最多。
[0003] 黄曲霉毒素发现于1961年，当时英国发生了数十万只火鸡的突发性死亡事件，最 后确定送种有毒物质是黄曲霉菌产生的次级代谢产物，故名黄曲霉毒素。研究表明，黄曲霉 毒素中的AFB1毒性是祇霜的65倍、氯化钟的10倍，比剧毒农药的毒性大30倍左右，按照 毒性分级标准属于极毒物，1993年被世界卫生组织列为一类致癌物。黄曲霉毒素可W引起 急性中毒，还具有致崎、致癌、致突变等慢性危害，属于强致癌物质，特别是诱发肝癌。曲霉 属真菌所产生的毒素不仅能导致农产品霉败变质、营养物质损失W及产品的品质降低，通 过自然途径少量导入送种毒素还可W引起脊椎动物急性或慢性疾病，通过对人和动物机体 内DNA、RNA、蛋白质和各种酶类的合成抑制W及对细胞结构的破坏而引起真菌毒素中毒。
[0004] 目前我国对产毒真菌的检测都是根据菌体形态和显微镜下特征进行分类与鉴定， 但是该方法鉴定周期长、时效性差，需要有经验的专家或实验人员才能准确分辨，且容易出 现假阳性或假阴性结果，已经远远不能满足高速发展的食品和饲料进出口检测需求。近些 年来，国内和国外已经开始运用生物化学和分子生物学等方法开始对产毒真菌进行检测。 PCR基础上发展而来的环介导等温扩增法（Loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方 法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、 快速、高特异地扩增祀序列。送种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出 现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要 反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条 件下的连续快速扩增，可W在15-60min之内扩增109-1〇1°倍祀序列拷贝。扩增产物检测快 速简单，方法多样，主要有肉眼观察沉淀法、英光染料检测法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪 检测法。LAMP具有扩增效率高，灵敏度强，特异性好的优点，而且不需要昂贵的PCR仪和试 剂，只需要一个恒温加热装置即可，成本低，适用于在基层使用，在普通的实验室具有很好 的应用前景，适用于曲霉属产毒真菌中寄生曲霉的检测。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种检测寄生曲霉菌的LAMP引物，和一种包含该引物的试剂盒，W 及一种使用该试剂盒检测寄生曲霉菌的LAMP方法。可W快速、特异、简便、廉价的检测寄生 曲霉菌，从而弥补现有技术在相关检测方面速度慢、成本高等不足，对农作物、食品、某些药 品及饲料安全检测具有重要作用。
[0006]为解决W上技术问题，本发明是通过下述技术方案来实现的：
[0007] -种检测寄生曲霉菌的LAMP引物，其特征在于，其中包括：
[0008]外侧正向引物F3 ;5 ' -GCGGATTCTACGAGACGGA-3 '；
[0009]外侧反向引物B3 ;5 ' -AGTAGGGAGCATGCCAGA-3 '；及
[0010] 内侧正向引物FIP;5, -TGGCCGATAGCCTATACTCCCA-CCGGACTCGGTCTTTCCAT-3,；
[0011]内侧反向引物BIP;5' -GACGGGCCCGGTAGTGTATTC-TGATTGAAACTCGCGCATCC-3'；
[0012] W及环引物LF;5, -TCCGCTAGGCTTTTGCAG-3,；
[001 引 环引物LB; 5，-TGGTTCACAGCTAAAATGGGG-3，。
[0014] 一种包含上述LAMP引物的检测寄生曲霉菌的试剂盒，包括LAMP引物、BstDNA聚 合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水，其特征在于，其中包括的LAMP引物为上述的LAMP 引物。
[0015] 上述的检测寄生曲霉菌的试剂盒，其特征在于，所述含dNTPs的反应缓冲液包含 dNTPs2. 8mmol/L、40mmol/LP册.8 的Tris-HCl、20mmol/LKCl、20mmol/L(NH4)2S〇4、16mmol/ 111拆〇4、0.2%吐温20^及1.6111〇1/1甜菜碱。
[0016] 上述的检测寄生曲霉菌的试剂盒，其特征在于，所述的LAMP引物包括40pmol/ μL引物FIP50μL、40pmol/μL引物BIP50μL、5pmol/μL引物F350μL、5pmol/μL引物 Β350μL、20pmol/μL引物LF50μL、20pmol/μL引物LB50μLo
[0017] 上述的检测寄生曲霉菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中BstDM聚合酶浓度 为8U/μL，含量为50μL，含dNTPs的反应缓冲液含量为ImU去离子水含量为ImL。
[0018] 一种利用所述的试剂盒检测寄生曲霉菌的方法，其特征在于，包括W下步骤：
[001引 （1)提取模板DNA;
[0020] 似W步骤（1)中提取的DNA为模板，采用上述LAMP引物进行LAMP扩增反应； [002。 （3)LAMP扩增结果判定。
[0022] 上述的检测方法，其特征在于，步骤似中寄生曲霉菌LAMP反应体系为25μ1，各 组分含量如下：
[0023] 模板DNA 2μL 40pmol/nL引物FIP ΙμΙ^ 40 pmol^L引物BIP ΙμΙ^ 5ριηο1/μΙ^引物F3 \μL 5 pmol^L引物Β3 1 μL^ 20 pmol^L引物LB I μL^ 20 pmol^L引物LF 1 μL^ 含dNTP的反应缓沖液 12.5μΙ^ 化? DNA聚合酶 ΙμΙ^ ddH2〇 3.5μΙ^。
[0024] 上述的检测方法，其特征在于，步骤似所述LAMP扩增反应的温度为63。时间为 60min。
[0025] 上述的检测方法，其特征在于，步骤（3)利用LA-320C浊度仪进行LAMP扩增反应， 通过程序显示的浑浊度鉴定所述步骤（2)中特异性扩增产物的存在。
[0026] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有W下优点：
[0027] 1.本发明所述的一种检测寄生曲霉菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒，所述 LAMP引物W寄生曲霉菌的组氨酸激酶mRNA基因为祀基因进行扩增；该基因序列具有高度 的特异性，因而可W实现寄生曲霉菌的特异性检测；所述包含该引物的试剂盒中所用的检 测试剂均为市售常见化工试剂，检测便利。
[002引 2.本发明所述的一种检测寄生曲霉菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒，在检 测曲霉属产毒真菌时更加快速和高效，核酸扩增在Ih内即可完成，在llmin开始发生扩增 反应。本发明是专用于检测寄生曲霉菌，对寄生曲霉菌污染的预防和检测具有重要意义。
[0029] 3.本发明所述的LAMP法检测寄生曲霉菌，针对祀序列的6个区域设计了 4种特异 性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，且与其它种属的菌种不发 生扩增反应，因而具有高特异性；同时本方法具有高灵敏度，所需模板拷贝量少，检测下限 约为IX10I2g/uL。
[0030] 4.本发明所述的LAMP反应可操作性强，避免使用昂贵的热循环化只要求简单的 恒温的反应仪器，必要时只准备恒温的水浴加热即可完成此操作；并且产物检测方便，通过 肉眼观察浑浊度就能实现。
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例3中LAMP反应特异性分析的实时浊度检测扩增柱状图，横坐 柄代表反应时间（min),纵坐柄代表浊度。左1为奇生曲霉；左2为黄曲霉；左3为溜曲霉； 左4为烟曲霉；左5为杂色曲霉；；左6为禾谷镶刀菌；左7为茄镶抱菌；左8为岛青霉菌； 右1为鲜绿青霉菌；右2为金黄色葡萄球菌；右3为大肠杆菌；右4为阴性对照。
[0032]图2为本发明实施例3中LAMP反应特异性分析的实时浊度检测扩增曲线图，横坐 标代表反应时间（min),纵坐标代表浊度。图中曲线为寄生曲霉扩增曲线，其它菌种未发生 扩增反应。
[0033] 图3为本发明实施例4中LAMP反应灵敏度分析的实时浊度检测扩增柱状图。横 坐标代表反应时间（min)，纵坐标代表浊度。左1为10 8 ;左2为10 9 ;左3为10 左4为 10 11 ;左 5 为 10 12 ;左 6 为 10 左 7 为 10 14 ;左 8 为 10 15 ;右 1 为 10 16 ;右 2 为 10 右 3 阴性对照。
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