专利名称：多重pcr检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及多重PCR检测食品中肉类来源的引物组 及检测试剂盒。
背景技术：
目前的肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉充猪肉，以猪 肉充牛肉等，用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，这极大的损坏了消费者的利益和健康。由 于国家没有规定统一的肉类检测方法，也没有形成成熟、快速简便的检测肉类来源的行业 方法，目前质监部门主要是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别工 作，这些传统鉴别方法对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用。但是，对于很多 熟肉制品(如香肠)来说，加入的肉经过了粉碎处理，并且添加了香料掩盖了原有的味道， 传统的方法难以进行准确的肉类来源鉴定。目前，市场上经过加工的熟肉制品质量越来越难以鉴定，国家及地方各级质监部 门急需要一种分析食品中的肉类来源的方法能够快速，有效的对肉类开源进行检测。分析 食品中的肉类来源的方法主要有两种应用抗体特异性的ELISA法和基于核酸特异性的 PCR法。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性，导致ELISA法鉴定肉类来源的稳定性较 差，容易出现偏差，且检测步骤复杂，时间长，不利推广。而PCR方法基于核酸的特异性，不 受高温的影响。食品的肉类中含有大量的核酸分子，通过合成种属特异的引物并进行PCR， 可以灵敏，快速的确定肉质中的肉类来源，如果找到一种能同时检测熟肉制品多种来源肉 的种类，将可以大大缩短了检测的时间，提高了检测的效率，更利于应用于实际。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种多重PCR检测食品中肉类来 源的引物组。本发明的第二个目的是提供一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒。本发明的技术方案概述如下一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物 对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序 列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物 分别是序列表中SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引 物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒，该试剂盒包括引物组、PCR管和 2XTaq PCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引 物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID N0. 1、SEQ IDN0. 2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中
3SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是 序列表中SEQ IDN0.5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物 分别是序列表中SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。本发明的引物组可以应用于多重PCR技术检测食品中肉类来源。本发明的试剂盒 可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重PCR方法更是缩短了检测的时间，提高 了检测的效率，将多重PCR方法应用于食品检测领域。
图1应用多重PCR进行肉类来源分析的琼脂糖电泳图。图中第1泳道是marker，第2条泳道是四重PCR结果，第3，4，5，6泳道分别是猪， 牛，羊，鸡的单重PCR结果。
图2应用多重PCR进行市场中香肠肉类来源分析的琼脂糖电泳图。 图中第 1 泳道是 DNAmarker (100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1000bp, 2000bp)，第 2，3，4，5 泳道分别是猪，牛，羊，鸡的单重PCR结果，第6泳道是牛肉肠A的多重PCR检测结果，第7 泳道是牛肉肠B的多重PCR检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1本发明是对于食品中肉类来源的检测，通过PCR反应扩增出来的产物长度分别为 猪136bp，牛705bp，羊199bp，鸡327bp。一.肉制品中DNA的提取样品处理将等质量的猪、牛、羊和鸡肉组织样品研充分磨备用。总DNA的提取取30mg样品用200 μ 1 TE悬浮，加入400 μ 1裂解液(5mol/L CuSCN ；0. 05mol/L Tris-HCl，ρΗ6· 4 ；0. 02mol/L EDTA，pH8. 0 ；1. 3% TritonX-100)，70°C温 浴10分钟，加等量氯仿混勻，离心(10000r/min，5min)，取上层水相，加等量冰乙醇-20°C沉 淀10分钟，离心(lOOOOr/min，5min)，弃上清，用70%乙醇洗涤一次，晾干，用50 μ ITE溶解 沉淀；-20°C下保存待用。二.引物的筛选和验证首先，从GENEBANK查找获得相应的基因序列，针对要进行多重PCR反应的模板序 列进行基因比对，找到特异性序列；然后，将特异性序列进行比对搜索，以确定该序列在所 有物种中的特异性，避免序列出现重复现象，对选定序列两端进行微调，以确定最佳序列； 其次，设计不同物种的PCR长度，至少相差50bp，从而确定上下游的引物序列，并保证所有 引物的Tm值大致相同；最后用Primer软件进行分析，并微调引物序列，以确定引物之间没 有过多的配对，没有二聚体。1.引物筛选结果猪5-ACTACTCATACCCAGCAAGC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 1 所示)5-TAAGGTGACAATAGGTAGTCCT-3 (序列表中 SEQ ID N0. 2 所示)鸡5-TCCTCACTACTGTCATCTT-3 (序列表中 SEQ ID N0. 3 所示)
5-CTGGAAGAAGGAGTGATGGG-3 (序列表中 SEQ ID NO. 4 所示)牛5-AAGCAATCGCTTTGTAACCC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 5 所示)5-CCAATTATTAGCAGGGTCATTG-3 (序列表中 SEQ ID NO. 6 所示)绵羊5-CTGACCCCCTATATAAACCT-3 (序列表中 SEQ ID NO. 7 所示)5-GTAAGGTTGTACTAATGAGGATC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 8 所示)2.引物特异性验证分别提取猪、牛、羊、鸡肉制品的总DNA，将猪肉制品的总DNA、牛肉制品的总DNA、 羊肉制品的总DNA和鸡肉制品的总DNA各1μ 1分别加入到50μ 1的PCR管中，再在每个PCR 管中加入浓度为ΙΟμπιοΙ/L的步骤1获得的四种上下游引物各1 μ 1，然后加入12. 5μ 1的 2 X TaqPCR反应混合试剂后加3. 5 μ 1无离子H2O至25 μ 1体系。将此PCR体系在5000转 /分条件下离心30s。将反应体系放入PCR仪中，设定变性、退火和延伸时间和温度。PCR检测方法的循环参数
反应变性 退火术口循环数第-一个反应94 0C, 3min1第:二个反应94°C, 30s 60°C，30s72 "C, Imin30第:Ξ个反应72 "C ’ 5min1反应完毕后将PCR产物取出，在4°C下短期保存，备用。3.多重PCR反应提取含有猪、牛、羊、鸡四种肉的混合肉制品的总DNA，取4μ1加入50μ1 PCR管 中，再各取浓度为ΙΟμπιοΙ/L的步骤1制备的四种上下游引物各Iy 1加入同一 PCR管，然 后加入12. 5 μ 1的2 X Taq PCR反应混合试剂后加0. 5 μ 1无离子H2O至25 μ 1体系。将此 PCR体系在5000转/分条件下离心30s。将反应体系放入PCR仪中，设定变性、退火和延伸 时间和温度。PCR检测方法的循环参数
反应变性 退火Φ入 水口循环数第--个反应940C, 3min1第二二个反应94°C, 30s 60°C, 30s72 °C，Imin30第三三个反应72°C, 5min1反应完毕后将PCR产物取出，在4°C下短期保存，备用。此步骤用时约90分钟。三.PCR产物的电泳分析 PCR产物检测可以用电泳法或者序列分析法。序列分析法可精确得到扩增序列，但 此方法要有专门的技术设备，不适合推广；而电泳的方法简单易操作，在不需要准确得到扩 增序列的情况下，普遍用于PCR产物的检测。此方法可根据实验情况灵活掌握实验条件，
5比如以下即为一种检测PCR产物的具体操作。将已配置的1. 5%琼脂糖凝胶加热溶解，使溶液澄清透亮。在50°C左右将溶液倒 入插好梳子的凝胶灌制模具中，约0. 3 0. 4cm厚。静置，待凝胶完全凝固。电泳槽中加满0. 5XTBE电泳缓冲液。凝胶完全凝固后，小心拔出梳子，将模具取 出，连同凝胶一起放入电泳槽中间的平板上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧 要朝向电泳槽负极。取PCR的产物10 12 μ 1放入100 μ 1无菌离心管中，另加入2 3 μ 1 6 X loading buffer。轻敲管底部，使混合均勻。吸取6 μ 1混合好的样品加入凝胶加样孔 中。另吸取DNA marker (标准分子)加入相邻的样品孔中。恒压电泳，使PCR产物在琼脂 板上展开。将已形成谱带的琼脂放入EB (溴化乙啶)染色液中染色20 40分钟，将凝胶取出 放入紫外光下观察。见图 1，图中 Lane 1. DNA marker (lOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp)Lane 2.猪，牛，羊，鸡的四重PCR结果，Lane 3.猪的单重PCR结果Lane 4.牛的单 重PCR结果，Lane 5.羊的单重PCR结果，Lane 6.鸡的单重PCR结果。此步骤用时约70 100分钟。实施例2一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒，该试剂盒包括引物组、PCR管和 2XTaqPCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引 物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中 SEQ IDN0.3、SEQ IDN0. 4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序 列表中SEQ ID N0. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物 分别是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。实施例3一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒的应用样品DNA提取、PCR及电泳方法与实施例1相同。 将多重PCR应用于市场熟肉制品的检测，从市场中购买各种熟肉制品，并记录其 标签所标识的肉质种类，提取总DNA，进行多重PCR反应，检测其中的真实组分。用本发明的试剂盒对于市场中获取的30组样品进行了检测，其中28个是合格产 品，但有两组的多重PCR检测结果与食品标签有所不同，如图2所示，一个在标签上注明是A 品牌牛肉肠，实际的检测结果是牛肉与猪肉的混合产品；另一个注明的是B品牌牛肉肠，多 重PCR的结果是猪肉，牛肉，鸡肉的混合。图2中，Lane 1. DNA marker (100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1000bp,2000bp) ；Lane 2.猪的单重 PCR 反应；Lane 3.牛的单重 PCR 反应；Lane4. 羊的单重PCR反应；Lane 5.鸡的单重PCR反应；Lane 6.牛肉肠A的多重PCR检测结果； Lane 7.牛肉肠B的多重PCR检测结果。本发明的方法应用于食品检测将具有广阔的前景。
权利要求
一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，其特征是由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
2.一种多重PCR检测食品中肉类来源的的试剂盒，其特征是该试剂盒包括引物组、PCR 管和2XTaq PCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛 肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ IDNO. USEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表 中SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别 是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游 引物分别是序列表中SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒，多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，本发明的引物组可以应用于多重PCR技术检测食品中肉类来源。本发明的试剂盒可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重PCR方法更是缩短了检测的时间，提高了检测的效率，将多重PCR方法应用于食品检测领域。
文档编号C12N15/11GK101962675SQ201010239180
公开日2011年2月2日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者乔建军, 关丛笑, 孙艳华, 张智禹 申请人:天津大学