检测绿豆糕成分的pcr引物组及用该引物组的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子检测领域，具体涉及检测绿豆糕成分的PCR引物组及用该引物组的检测方法。
【背景技术】
[0002]绿豆糕香甜爽口，营养丰富，是我国深受广大消费者欢迎的传统时令美食。绿豆糕产生产在我国自古有之，所谓绿豆糕一般是指以绿豆为主要原料，加入白糖、面粉等作为配料，制作而成的糕点。日前部分媒体报道称一些非法绿豆糕生产企业生产的绿豆糕存在掺杂使假现象。部分绿豆糕生产企业依靠减少绿豆比例或完全不添加绿豆，采用更加廉价的豌豆等低价豆类替代价格较高的绿豆，降低生产成本，偷工减料，质量检验控制不严格或者根本不进行产品质量检验。但针对绿豆糕等产品还没有直接相关的国家标准或行业标准方法可用于对其中绿豆成分进行检测，这也是目前针对绿豆糕产品质量监管方面存在的棘手问题。本发明采用分子生物学方法对绿豆糕中的绿豆、豌豆等成分进行检测分析，为食药、工商等部门整顿绿豆糕生产行业，打击绿豆糕生产掺假行为提供技术手段，保护了消费者权益，健全了绿豆糕生产行业。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测绿豆糕成分的PCR引物组及用该引物组的检测方法，通过设计特异性引物，利用PCR方法从待检样品中的DNA中扩增出特异性条带，可以快速准确地检验出是否含有绿豆、豌豆及其它成分，该方法速度快，特异性强，灵敏度高，稳定可靠。
[0004]本发明提供的技术方案是:
[0005]1.提取待检绿豆糕样品中混合植物成分DNA;
[0006]2.设计植物通用引物、绿豆和豌豆特异性引物
[0007]植物通用引物:
[0008]U-F:5 ’-TAGACGCTACGGACTTA-3’
[0009]U-R:5，-GGGATAGAGGGACTTGA-3’
[0010]所述植物通用引物扩增片段范围在300-700bp，使用该通用引物扩增绿豆、美国豌豆、红豆、黄豆、豌豆、玉米、小麦DNA，扩增产物长度分别为5956卩、51扑卩、5936卩、602匕卩、498bp、538bp、685bp；
[0011]绿豆特异性引物:
[0012]Lv-F:5’-GTGAGTGAGAATAACAATCCAAGT-3，
[0013]Lv-R:5’-CAAGGGGTTACTACCG-3’
[0014]所述绿豆特异性引物扩增产物片段长度分别为469bp;
[0015]豌豆特异性引物:
[0016]W-F:5 ’-GCAAGATAATCATAAATACTAG-3，
[0017]W-R:5 ’-AACCTGATGTGAGATTCTT-3，
[0018]所述豌豆特异性引物扩增产物片段长度分别为108bp;
[0019]3.以从绿豆糕样品中提取的DNA为模板，利用设计并合成的植物通用引物、绿豆和豌豆特异性引物进行PCR扩增；
[0020]4.对获得的PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据电泳结果进行判断:
[0021]将提取制备的待测样品DNA模板和植物通用引物使用扩增体系进行PCR扩增，将扩增物进行毛细管电泳检测，对照毛细管电泳检测结果，从结果中出现条带的长度，初步判断待测样品中所含成分，重点观察是否含有绿豆和豌豆成分；
[0022]将提取制备的待测样品DNA模板和绿豆特异性引物(Lv-F/R)进行扩增，若所述的电泳结果在469bp处有显示特异性条带，则判断待检绿豆糕样品含有绿豆成分;反之，则判断待检绿?糕样品不含有绿?成分；
[0023]将提取制备的待测样品DNA模板和豌豆特异性引物(W-F/R)进行扩增，若所述的电泳结果在108bp处有显示特异性条带，则判断待检绿豆糕样品含有豌豆成分;反之，则判断待检绿?糕样品不含有婉?成分；
[0024]所述的绿豆特异性引物(Lv-F/R)进行扩增体系为:2XPCR Mix 10ul,10uM Lv-F引物lul，lOuM Lv-R引物lul，待检样品DNA模板lul，补充去离子水至20ul。
[0025]所述的豌豆特异性引物(W-F/R)进行扩增体系为:2 XPCR Mix 10ul,10uM W-F引物lul，10uM W-R引物lul，待检样品DNA模板lul，补充去离子水至20ul。
[0026]所述的绿豆特异性引物(Lv-F/R)进行扩增条件:95°C/5min，95°C/5sec，53°C/45sec，72°C/45sec，72°C/10min，其中95°C/5sec 至 60°C/45sec 过程进彳丁 30 个循环；
[0027]所述的豌豆特异性引物(W-F/R)进行扩增条件:95°C/5min，95°C/5sec，60°C/45sec，72°C/45sec，72°C/10min，其中95°C/5sec 至 60°C/45sec 过程进彳丁 30 个循环；
[0028]本发明的有益效果:本发明为绿豆糕掺假提供了一种快速、准确有效的检测方法，能对绿豆糕中含有的植物源性成分进行分析和确认，目前关于绿豆糕掺假检测的方法和专利还未见报道。
【附图说明】
[0029]图1，绿豆引物特异性验证结果。
[0030]图2，豌豆引物特异性验证结果。
[0031]图3，植物通用引物对绿豆糕样品(1-4)进行PCR扩增电泳图。
[0032]图4，植物通用引物对绿豆糕样品(5-8)进行PCR扩增电泳图。
[0033]图5，植物通用引物对绿豆糕样品(9-12)进行PCR扩增电泳图。
[0034]图6，植物通用引物对绿豆糕样品(13-14)进行PCR扩增电泳图。
[0035]图7，绿豆特异性弓丨物PCR扩增电泳图(1 -11)。
[0036]图8，绿豆特异性弓I物PCR扩增电泳图(12-14)。
[0037]图9，豌豆特异性引物对绿豆糕样品(1-8)进行PCR扩增电泳图。
[0038]图10，豌豆特异性引物对绿豆糕样品(9-14)进行PCR扩增电泳图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
[0040]实施例1
[0041]引物组的设计:本发明分别设计了三对引物，第一对引物为植物成分通用检测引物，能扩增绿豆、红豆、豌豆、玉米、大豆(黄豆)、小麦面粉、美国豌豆等植物成分，且各成分检测的PCR产物片段存在一定差异，通过电泳能起到初步筛查样品中成分种类的作用。第二对和第三对引物分别是特异性检测绿豆成分和豌豆成分的特异性引物，可以对第一步初筛可能含有绿豆或者豌豆成分的样品进行成分确证，该发明解决了绿豆糕掺假到目前为止没有相关检测方法和手段的空白，建立了有效的PCR方法来检测绿豆糕成分。
[0042]1.实验用材料如绿豆、红豆、豌豆、玉米、大豆(黄豆)、小麦面粉、美国豌豆等均购自市场，14个绿豆糕样品购自超市。
[0043]2.验证绿豆和豌豆引物的特异性
[0044]首先验证绿豆和豌豆引物的特异性。图1表明绿豆特异性引物具有较好的的特异性，仅能扩增绿豆和红豆基因，不能扩增豌豆、玉米、大豆、小麦等基因，且绿豆与红豆PCR产物目的片段长度也有差异，绿豆为469bp，红豆508bp。图2表明豌豆引物有很好的特异性，仅能扩增豌豆基因，不能扩增绿豆、红豆、玉米、大豆、小麦等基因，可作为豌豆成分的检测。
[0045]3.采用植物通用引物对14个绿豆糕样品进行检测
[0046]从图3-6可以看出，植物通用引物可以扩增绿豆、豌豆、红豆、玉米、大豆、小麦、美国豌豆，且不同种植物PCR扩增产物片段长度存在差异，因此可以初步通过PCR扩增产物片段长度差异将样品中的植物成分推断出来。从图3-6可以看出，样品1-4、样品6、样品8-11、样品14均含有一条与豌豆PCR目的片段十分接近的条带，这表明这些样品中可能主要成分是豌豆。
[0047]4.采用绿豆特异性引物对14个绿豆糕样品进行检测
[0048]实验结果图7-8表明，仅有样品5和样品12扩出目的产物，其他12个样品均未扩出目的片段，样品1-样品3、样品5-样品11、样品13-样品14中均不含绿豆成分。
[0049]5.采用豌豆引物对14个样品进行检测
[0050]从图9-10中可以看出，样品1-4、样品6-10、样品12、样品14均检出豌豆成分。
[0051]检测结果:(1)样品5和样品12(共2个绿豆糕样品)检出绿豆成分；
[0052](2)样品1-4、样品6-10、样品12、样品14(共11个绿豆糕样品)均检出豌豆成分。
【主权项】
1.检测绿豆糕成分的PCR引物组，其特征在于，包括植物通用引物: U-F:5 ’-TAGACGCTACGGACTTA-3’ U-R:5 ’-GGGATAGAGGGACTTGA-3， 所述植物通用引物扩增片段范围在300-700bp，使用该通用引物扩增绿豆、美国豌豆、红豆、黄豆、豌豆、玉米、小麦DNA，扩增产物长度分别为595bp、514bp、593bp、602bp、498bp、538bp、685bp； 绿豆特异性引物: Lv-F:5，-GTGAGTGAGAATAACAATCCAAGT-3， Lv-R:5’-CAAGGGGTTACTACCG-3， 所述绿豆特异性引物扩增产物片段长度分别为469bp; 豌豆特异性引物: W-F:5，-GCAAGATAATCATAAATACTAG-3， W-R:5 ’-AACCTGATGTGAGATTCTT-3’ 所述豌豆特异性引物扩增产物片段长度分别为108bp。2.—种使用权利要求1所述的PCR引物组检测绿豆糕成分的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、提取待测样品DNA，制备DNA模板； 步骤2、制备权利要求1所述的引物组: 植物通用引物: U-F:5 ’-TAGACGCTACGGACTTA-3’ U-R:5 ’-GGGATAGAGGGACTTGA-3， 绿豆特异性引物: Lv-F:5，-GTGAGTGAGAATAACAATCCAAGT-3， Lv-R:5’-CAAGGGGTTACTACCG-3， 豌豆特异性引物: W-F:5，-GCAAGATAATCATAAATACTAG-3， W-R:5 ’-AACCTGATGTGAGATTCTT-3’ 步骤3、将步骤1制备的待测样品DNA模板和步骤2中制备的所述的植物通用引物使用扩增体系进行PCR扩增，将扩增物进行毛细管电泳检测，对照毛细管电泳检测结果，从结果中出现条带的长度，初步判断待测样品中所含成分，重点观察是否含有绿豆和豌豆成分； 步骤4、将步骤1制备的待测样品DNA模板和步骤2中制备的所述的绿豆特异性引物进行PCR扩增，将扩增物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果，判断待测样品中是否含有绿豆成分； 如果步骤3中初步判断含有豌豆成分，将步骤1制备的待测样品DNA模板和步骤2中制备的所述的豌豆特异性引物进行PCR扩增，将扩增物进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测结果，确定待测样品中是否含有豌豆成分。3.根据权利要求2所述的检测绿豆糕中绿豆成分掺假的方法，其特征在于，所述步扩增体系为:2XPCR Mix 10ul，10uM上游引物lul，10uM下游引物lul，待检样品DNA模板lul，补充去尚子水至20ul。4.根据权利要求2所述的检测绿豆糕中绿豆成分掺假的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为:95°C/5min，95°C/5sec，53°C/45sec，72°C/45sec，72°C/10min，其中95°C/5sec至60°C/45sec过程进行30个循环。
【专利摘要】本发明公开了一种检测绿豆糕成分的PCR引物组及用该引物组的检测方法，检测绿豆糕成分的PCR引物组包括植物通用引物、绿豆特异性和豌豆特异性引物；检测方法具体步骤：提取待测样品DNA，制备DNA模板；制备植物通用引物、绿豆和豌豆特异性引物：首先通过植物通用引物，利用PCR方法从待检样品中的DNA中扩增出特异性条带，判断待检样品的大致含有的成分；再使用绿豆特异性引物检验待测样品是否含有绿豆成分，使用豌豆特异性引物检验待测样品是否含有豌豆成分；该方法速度快，特异性强，灵敏度高，稳定可靠。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105463091
【申请号】CN201510968950
【发明人】宗凯, 李云飞, 周莉质, 姚剑, 孙娟娟, 陈雪娇, 周安安, 余晓峰, 郑海松, 吕侠影, 王满满
【申请人】安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月17日