稻瘟病抗性基因Pb1功能特异性分子标记及其专用引物、检测方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pb1功能特异性分子标记及其专用引物、检测方法和应用。本发明分子标记为包含Pb1基因编码区上游926bp～1085bp的DNA片段。所述引物中，正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了该分子标记的检测方法及在辅助选择育种中的应用。本发明分子标记检测特异性好，可以应用于水稻稻瘟病抗性育种中Pb1基因分子标记辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率和新品种培育的效率。
【专利说明】
稻瘟病抗性基因 Pb1功能特异性分子标记及其专用引物、检测 方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，尤其涉及检测水稻抗稻瘟病抗性基因的分子标记及 其专用引物、检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻 痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都 造成严重的粮食损失。抗病品种的选育和推广是防治稻瘟病最环保、最经济和最有效的办 法。传统的抗稻瘟病育种依赖于抗性表型鉴定，易受到环境条件和人为误差的影响，目标基 因的选择效率低。随着分子标记技术的应用，抗病基因型的选择越来越容易。
[0003] 稻瘟病分为叶瘟和穗瘟，穗瘟危害最为严重，直接影响水稻穗实粒数、粒重及品 质。到目前为止，国内外利用分子标记技术已鉴定和定位80多个水稻稻瘟病抗性基因，克隆 了叶痕抗性基因：Pia，Pib，Pid2，Pik，Pik_h/Pi54，Pik_m，Pik-p，Pish，Pit，Pita，Piz_t， ?11，？12，？15，？19，？121，？136，？137，？156，？163，卩1(：039等22个，2个穗瘟抗性基因：？125/ Pid3和Pbl基因，并开发了针对？^&、？讣、？丨1^丨1〇11、？丨1^、？丨1、？^、？丨5和？丨25等基因的功 能特异性标记（国家水稻数据中心:http://www.ricedata. cn/gene/) 〇
[0004] 其中，抗性基因 Pbl所介导的抗性是持久抗性，且是成株期抗性(抗穗瘟），Pbl是一 个来自籼稻品种Modan的抗性基因，其编码CC-NBS-LRR蛋白，这种蛋白与之前报道的抗病蛋 白有所不同，它没有P-loop结构，而且一些其他基序也退化了。Pbl位于一个以60-kb为单位 的串联重复序列中。Pbl的转录水平随着含Pbl基因品种的发育过程而增加，这种表达模式 也与它的成株期抗性或抗穗瘟相符合。日本研究者已经开发了与Pbl连锁的RFLP标记。但存 在三个不足:①实验操作繁琐，检测效率低。由于RFLP标记需要用限制性内切酶酶切DNA、凝 胶电泳分开DNA片段、转移滤膜及用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段等步骤，实 验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种。②选择有误差，准确率不 高。由于此标记位于抗性基因 Pbl的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，在减数分裂 过程中选择标记与目标基因可能发生交换，容易出现错选的情况，选择准确率不高。③连锁 标记应用有局限性。连锁标记可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中选择，需对亲本的 多态性进行检测；限制了标记在非多态群体的使用。在随后利用抗性基因 Pbl的研究，也有 报道SSR标记RM26998作为连锁标记，虽实验操作简便，但选择效率不高和应用局限性仍未 得到解决。为了能更准确有效的将抗穗瘟基因 Pbl应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发 抗性基因 Pbl的新型的功能标记。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于基因内部特异性 差异而开发设计的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记，检测准确性高。本发明的另一 个目的是提供了该分子标记的引物、检测方法和应用。
[0006] -种稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记，它为包含Pbl基因编码区上游 926bp ~1085bp 的 DNA 片段。
[0007] 因 Pbl基因位于一个以60kb为单位的串联重复序列中，Pbl与P5基因紧密连锁，且 Pbl基因与P5基因编码的蛋白只有一个谷氨酸的差异，而Pbl发挥功能取决于基因编码区上 游l-2056bp序列，
【申请人】发现P5和Pbl含l-1016bp序列，Nip无;Pbl和Nip含1017-2056bp序 列，而P5无，因此包含Pbl基因编码区上游926bp~1085bp的DNA片段可作为稻瘟病抗性基因 Pb 1特异性的分子标记。
[0008] 进一步的，本发明的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID N0: 3所示，也可以为含有 SEQ ID从):3所示核苷酸序列的0嫩片段。
[0009] SEQ ID N0:3为本发明引物扩增出的159bp片段，扩增区域为Pbl基因编码区上游 926bp~1085bp。
[0010] 本发明还提供了一种扩增稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的引物，正向 引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011] 本发明还提供了一种所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的检测方 法，包括：
[0012] ⑴根据所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的核苷酸序列设计引物；
[0013] (2)以被检测水稻的基因组DNA作为模板进行PCR扩增；
[0014] (3)判断PCR扩增产物中是否存在所述的分子标记。
[0015] 步骤⑴，所述引物中，正向引物的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，反向引物的碱基 序列如SEQ ID N0.2所示。
[0016] 步骤(2)，PCR扩增的体系为：1·5μ1基因组DNA，0.5yl 2mM上游引物，0·5μ1 2mM下 游引物，1·2μ1 lOXTaq Buffer，0.3yl ImM dNTP，0.1yl 1000U Taq DNA聚合酶，ddH20补 足至10μ1。
[0017] PCR扩增的程序为:95 °C预变性5min; 94°C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，运 行33个循环;最后72°C延伸10min。
[0018] 本发明还提供了所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记在辅助选择育种 中的应用。
[0019] 本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助选择育种中，本领域技术人员可以 理解，比如通过检测水稻基因组中是否存在本发明的分子标记来筛选水稻是否具有以Pbl 基因主导的穗瘟抗性。检测是否含本发明的分子标记可以是PCR的方法，具体的，可以采用 上述的检测方法，也可以通过测序方法进行。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0021] (1)本发明中Pbl分子标记位于基因启动子区，弥补了连锁标记容易错选的不足， 准确率高，不受遗传背景的限制，在不同的群体中选择，不需对亲本的多态性进行检测。另 外，可采用PCR的方法进行分子标记的检测，操作简单，检测效率高。
[0022] (2)本发明分子标记可特异性检测Pbl基因。因 Pbl基因位于一个以60-kb为单位的 串联重复序列中，Pbl与P5基因紧密连锁，且Pbl基因与P5基因编码的蛋白只有一个谷氨酸 的差异，而Pbl发挥功能取决于基因编码区上游l_2056bp序列，
【申请人】发现P5和Pbl含1- 1016bp序列，Nip无;Pbl和Nip含1017-2056bp序列，而P5无，因此在Nip和P5序列的边界处设 计引物，可特异扩增Pb 1片段，检测的准确性高。
[0023] (3)本发明设计的引物特异性好，采用该引物扩增出的SEQ ID N0:3所示分子标记 片段大小为159bp，可直接用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标条带，成本低，操作简便，适 合于大规模的分子育种。
【附图说明】
[0024] 图1为Pbl与P5基因编码区上游l-1016bp序列比对(框代表后引物位置）；
[0025] 图2为Pbl基因编码区上游1017-2056bp与对应的Nip基因组序列比对(框代表前引 物位置）；
[0026]图3为镇稻88系谱图；
[0027]图4为镇稻11号、15号、18号系谱图；
[0028]图5为江苏省审定品种中Pbl基因检测电泳图；
[0029]图6为2015年江苏省28份预试材料检测Pb 1基因的电泳图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0031] 本发明分子标记Pbl-Ι的具体应用包含纯实验室技术部分和对含有Pbl基因的育 种群体水稻材料的检测。它的应用不限于以下实施例。
[0032] 实施例1分子标记的开发及引物设计
[0033] Pbl 基因：genebank 登录号为 AB570371 · 1 ;P5 基因：genebank 登录号 AB570370.1。 [0034] Pbl位于一个以60kb为单位的串联重复序列中，且Pbl位于第二个重复序列中，与 第一个重复序列中的P5相对应。P5编码的蛋白只比Pbl多了一个谷氨酸，Pbl与P5都具有穗 瘟抗性，但Pbl抗穗瘟能力显著高于P5,两个基因抗穗瘟的差异并不是这个谷氨酸的差异造 成的，而是Pbl的基因表达水平明显高于P5。通过比对Pbl与P5基因编码区上游启动子区发 现，基因编码区上游l〇16bp的启动子序列完全匹配（图1)，而感病品种（以Nip即日本晴为 例）不含这段序列；基因编码区上游l〇17bp-2056bp处，Pbl与Nip序列大部分匹配（图2)，而 P5不含这段序列。l-1016bp和1017-2056bp序列同时存在，Pbl才能发挥功能。因此，我们将 前引物SEQ ID N0:1设计在1017-2056bp之间，后引物SEQ ID N0:2设计在l-1016bp之间，能 够特异检测Pbl基因。
[0035] 设计引物时，考虑引物退火温度处于50°C_55°C，扩增片段大小为100_200bp。
[0036] 正向引物（即前引物）：ATCAACGCTACCTTCCC
[0037] 反向引物（即后引物）：GTGCCATCACAATTTCTTC [0038]实施例2 Pbl检测的实验流程
[0039]对江苏省审定品种中镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁9108、镇稻19号、 镇稻18号、镇稻14号进行检测。
[0040]步骤一、DNA 提取(SDS法）：
[00411 1、将2cm长的叶片剪碎置2ml的离心管中，加上钢珠，然后放入装液氮的保温瓶中 速冻，快速捞取放在48孔模具上，盖好盖子置于磨样机上震动30s，取下离心管，倒出钢珠。
[0042] 2、在含有液氮磨碎的叶片的2ml离心管中，加入SDS(0.1M Tris-Hcl，PH 8.0; 0.025M EDTA，PH 8.0;29.25g/l Nacl;12g/1 SDS)600yl，放置65°C水浴锅中，30min。
[0043] 3、加入 150μ1 KAc(PH 4.8)，放置-2(TC冰箱，30min。
[0044] 4、加入与SDS等体积的氯仿:异戊醇(体积比为24:1)溶液，放置振荡器充分摇匀， 20min〇
[0045] 5、离心，12000rpm，4min，转移200μ1上清液置1.5ml离心管中。
[0046] 6、在上清液中加入2倍体积-20 °C预冷的无水乙醇，置于-20 °C冰箱，20min。
[0047] 7、离心，12000rpm，4min，弃上清，风干，加入200μ1 ddH2〇溶解，此为DNA母液。
[0048] 8、将母液稀释10倍即为DNA工作液。
[0049] 9、取1.5μ1用于PCR扩增反应。
[0050] 步骤二、PCR扩增：
[0051 ] PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0052] 1、反应体系如下：
[0053] 总体积：10μl。DNAl·5μl;2mMSEQIDN0:l上游引物0·5μl ;2mMSEQIDN0:2下 游引物0.5yl;10XTaq Buffer(GENERAY，捷瑞公司）1·2μ1，1πιΜ dNTP 0·3μ1，100〇υ Taq DNA聚合酶(GENERAY)O. ΙμL，加 ddH20补足至 10μ1。
[0054] 2、PCR的扩增程序如下：
[0056] 步骤三、PCR产物检测：
[0057]用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，取扩增好的PCR产物2μl，以DNAMarker (100bp-I DNAladder)作为分子量对照，在240V恒压下电泳1小时。银染显示DNA条带，通过 比对DNA Marker找到目标条带，根据片段大小判断抗感基因：用引物对SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2检测，159bp为含Pbl，不含Pbl则扩增不出条带。
[0058]结果如图5,样品顺序（从左到右）为：镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁 9108、镇稻19号、镇稻18号、镇稻14号，Μ代表Marker。在这8个水稻品种中，镇稻88、镇稻11 号、镇稻15号和镇稻18号检测到Pbl基因，其余水稻品种未检测到Pbl基因。
[0059] 实施例3江苏省审定品种Pbl基因检测
[0060] Pb 1基因来自籼稻品种Modan，而镇稻88由Modan衍生而来（图3)，镇稻88田间穗瘟 抗性好，通过Pbl基因的功能标记检测发现其含有Pbl。而镇稻11号、15号、18号皆由镇稻88 衍生而来(图4)，这三个品种也检测到了Pbl基因，与其田间抗穗瘟表型相一致。
[0061]实施例4稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记在辅助选择育种的用途。
[0062]从江苏省2015年预试材料中选取了 28份材料(来源详见表1 )，其中17份田间鉴定 表现出穗瘟抗性，经Pbl分子标记检测发现，这17份材料中含有Pbl基因（图6)。
[0063] 图6中，Μ代表Marker，R代表抗病，S代表感病。品种顺序(从左到右)为南粳44008、 仪糯1073、盐稻13448、皖垦粳157、泰粳1413、武4844、中江粳15-145、苏3087、苏2110、镇稻 548、镇稻448、JF004、扬粳4336、华稻1603、扬农粳14-105、中江粳K5、福粳1508、振稻24315、 98-26、苏秀867 (国审稻2011029 )、华丰1503、苏1267、武粳135、泗稻14-58、瑞诚稻1号、金稻 14-153、武粳004、靖丰 4313。
[0064]表1预试水稻材料来源
[0067]以上列举的仅限于本发明具体实施例，事实上还应有许多变形，若本领域的相关 人员能从本发明公开的内容直接导出或引申出的所有变形，均应为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记，其特征在于，它为包含Pbl基因编码 区上游926bp~1085bp的DNA片段。2. 根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因 Pb 1功能特异性分子标记，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;或者其为含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA片段。3. -种扩增稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的引物，其特征在于，正向引物的 喊基序列如SEQ ID NO. 1所不，反向引物的喊基序列如SEQ ID NO.2所不。4. 一种根据权利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的检测方 法，其特征在于，包括： (1) 根据权利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的核苷酸序列 设计引物； (2) 以被检测水稻的基因组DNA作为模板进行PCR扩增； (3) 判断PCR扩增产物中是否存在所述的分子标记。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述引物中，正向引物的碱基序列如 SEQ ID NO.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增的体系为：1.5μ1基因组DNA， 0·5μ1 2mM上游引物，0·5μ1 2mM下游引物，1·2μ1 IOXTaq Buffer，0.3yl ImM (1ΝΤΡ，0·1μ1 1000U Taq DNA聚合酶，CldH2O补足至 10μ1。7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增的程序为:95°C预变性5min; 94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，运行33个循环；最后72 °C延伸IOmin。8. 根据权利要求1或2所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记在辅助选择育种 中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105886631SQ201610305124
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】孙立亭, 林添资, 龚红兵, 景德道, 余波, 钱华飞, 曾生元, 李闯, 姚维成, 盛生兰, 周义文
【申请人】江苏丘陵地区镇江农业科学研究所