一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物及方法
【专利摘要】本发明属于微生物分子分型领域，具体涉及一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物及方法。本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的引物，包括15对结肠弯曲菌引物。本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指数，可以对结肠弯曲菌进行更精确的分型。此外，本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的方法具有操作简便快捷、稳定性和可重复性好的优点，可以有效的辅助结肠弯曲菌感染疾病的临床诊断，是一种较为理想的结肠弯曲菌分型方法。
【专利说明】
一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物分子分型领域，具体涉及一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物 及方法。
【背景技术】
[0002] 弯曲菌属于革兰氏阴性短杆菌，是一类重要的食源性人兽共患病原菌，其广泛分 布于自然界及家畜、家禽的肠道内。自1973年Dekeyser和Butzler从急性肠炎患者奠便分离 得到弯曲菌并首次确定其致病性以来，已至少发现了 16种不同类型的弯曲菌，其中空肠弯 曲菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲菌(Campylobacter coli)是弯曲菌感染中最常 见的两个菌种，约占 99%以上，其中80-90%为空肠弯曲菌，5-10%为结肠弯曲菌，其它常见 的弯曲菌还有海欧弯曲菌(Campylobacter lari)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)和 乌普萨拉弯曲菌(Campylobacter upsaliensis)等。
[0003] 虽然弯曲菌在食物中不容易生长繁殖，但是，它引起发病的感染剂量很低，大约摄 入400-500cfu便可引发肠道感染，这对禽肉食品安全和人类健康造成了严重的威胁。而且 经调查发现，结肠弯曲菌的带菌率比空肠弯曲菌的带菌率更高，其中高达50 %的阳性样品 中同时污染了多株不同型的结肠弯曲菌。因此，结肠弯曲菌的检测对临床诊断具有十分重 要的意义。
[0004] 中国专利CN102268479B公开了一种检测结肠弯曲菌的引物、探针及方法和试剂 盒，该检测方法是通过设计结肠弯曲菌的实时荧光定量PCR引物和探针，从而特异性的检测 出结肠弯曲菌。但是，该检测方法仅可以检测出结肠弯曲菌，不能对结肠弯曲菌进行进一步 的分型，无法满足临床诊断的需求。
[0005] 目前，结肠弯曲菌的基因分型研究主要集中在脉冲场凝胶电泳（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNAJAFO) 等。PFGE方法分辨力高，重复性好，是目前所有分型方法中的金标准，但是其耗时长，费用 高，且对设备具有较高的要求。RFLP技术是采用标准的通用引物，能最大限度的扩增鞭毛基 因的保守序列，经酶切电泳，根据条带的不同可以区分不同的基因型，但是该方法分辨力不 高，检测周期相对较长。RAH)技术是使用一系列具有10个碱基左右的单链随机引物，对全基 因组DNA进行PCR扩增，以检测其多态性，虽然该方法具有成本低，速度快，易于操作的优点， 但是其重复性较差，而且受模板纯度、PCR仪器及操作者等多种因素的影响。
[0006] 扩增基因间片断多态性(Amplified intergenic locus polymorphism，AILP)技 术作为一种最新的分子分型技术在2005年建立。AILP技术对细菌分型仅需知道该菌种的全 基因组或部分基因组序列，粗提DNA即可做为PCR扩增的模板，该技术操作简便，在保证分型 结果具有较好的稳定性、可重复性和较高分辨率的同时可以大大节约时间与成本。但是，目 前，尚未见有利用AILP技术对结肠弯曲菌进行基因分型的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物及方法，以弥补现有 结肠弯曲菌分型技术中的不足。
[0008] 本发明提供了一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物，包括以下15对结肠弯曲菌引 物：针对murD基因的上游引物CCF1:5 ' -GGACCCGACTAACCCTACG-3 '（SEQ ID N0· 1)和下游引 物CCR1:5 ' -GGAGCGAATAGAAGTGAGCAT-3 '（ SEQ ID N0 · 2);针对tpx基因的上游引物(^?2:5'-ATTTACAGGAGCAGCAGGAT-3 '（SEQ ID N0 · 3)和下游引物CCR2:5 ' -CCAATGGGGCTACTTTCTT-3 ' (SEQ ID N0.4);针对proB基因的上游引物CCF3:5'-CCCATCACTCACCCCACTA-3'（SEQ ID N0.5)和下游引物CCR3: 5'-ATTTGTCCACCCATTTTGC-3'（SEQ ID N0.6);针对ybjZ基因的上 游引物CCF4 : 5 ' -ATGGTTTTAGGTGGTTGGG-3 '（ SEQ ID N0 · 7 )和下游引物(^尺4:5'-TGTTTTCGGTTCATTTGGA-3'（SEQ ID N0.8);针对 msrA 基因的上游引物(^卩5:5'_ GCAGATGACAACGAAGAAGTG-3 '（SEQ ID N0 · 9)和下 3'（SEQIDN0·10)针对purB基因的上游引物CCF6:5'-AGCCATTACAGCACTTACACC-3'（SEQID N0· 11)和下游引物CCR6:5 '-AGGCAAAACAAAACAGACAAA-3 '（SEQ ID N0 · 12);针对moeA-3基因 的上游引物CCF7:5'-ATAGCGGCAGAGTGGTAAGG-3'（SEQ ID Ν0· 13)和下游引物CCR7:5'_ GGAGCGGGAAACGAGATT-3'（SEQ ID NO · 14 );针对 mpg基因的上游弓| *CCF8:5'_ ATAGCAAACTCGCACATTCTT-3 '（ SEQ ID N 0 · 1 5 )和下游弓| *CCR8:5'_ AAAACACCCTTTACAACCTCA-3'（SEQ ID NO. 16);针对 rplW 基因的上游引物(^卩9:5'_ GTATGGATTGTGGGGTAGCA-3 '（SEQ ID NO · 17)和下游引物CCR9:5 ' -AGTAAAGAGCGGTTGGGTG-3 ' (SEQIDN0·18);针对proP基因的上游引物CCF10:5'-TCTTGCGGTTGGTTATTTATT-3'（SEQID NO · 19)和下游引物CCR10:5 ' -GACCTGGACCCTCTTTGCT-3 '（ SEQ ID NO · 20);针对typA基因的 上游引物CCF11:5 ' -CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3 '（ SEQ ID NO · 21)和下游引物0：1?11:5'-TCCCAGTTCGGATTGTTCT-3'（SEQ ID N0.22);针对 mutY 基因的上游引物(^卩12:5'-GGAGATGGCTGAGTGGTCG-3'（SEQ ID 勵.23)和下游引物(：0?12:5'-八八(：1'1'7^(：1'111^611^6八1'-3'（SEQ ID N0.24);针对glnP基因的上游引物CCF13:5'-CGGCATAGGAGGTTCTGG-3'（SEQ ID NO · 25)和下游引物CCR13:5 ' -GACCCTTTCGTCTAGTGGC-3 '（ SEQ ID NO · 26);针对rluD基因的 上游引物CCF14:5'-GAGTCCTGCTAAATCCACCA-3'（SEQIDN0·27)和下游引物CCR14 :5'-AGTCCAAAATACCCATAAACAA-3'（SEQ ID N0.28);针对typA基因的上游引物0^15:5'-GGTAAACAGTCGGGAGGGA-3'（SEQIDN0·29)和下游引物CCR15 :5'-CGTCGTCAAGAGGGAAACAA-3'（SEQ ID NO.30)。
[0009 ]进一步地，所述结肠弯曲菌的上游引物与下游引物的浓度比为1:1。
[0010] 进一步地，所述murD靶基因间隔片断的长度为117bp，tpx靶基因间隔片断的长度 为465bp，pr〇B靶基因间隔片断的长度为760bp，yb jZ靶基因间隔片断的长度为1155bp，msrA 靶基因间隔片断的长度为1306bp，pUrB靶基因间隔片断的长度为1638bp，m〇eA-3靶基因间 隔片断的长度为1910bp，mpg靶基因间隔片断的长度为2210bp，rplW靶基因间隔片断的长度 为2777bp，pr 〇P靶基因间隔片断的长度为3251bp，typA靶基因间隔片断的长度为212bp， mutY靶基因间隔片断的长度为263bp，glnP靶基因间隔片断的长度为838bp，rluD靶基因间 隔片断的长度为922bp，typA靶基因间隔片断的长度为967bp。
[0011]另外，本发明还提供了一种用于结肠弯曲菌快速分型的方法，包括如下步骤：
[0012 ] si应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测标本中的细菌基因组DNA;
[0013 ] S2以待测标本中的细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的15对结肠弯曲菌 引物分别进行PCR扩增；
[0014] S3将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0015] 进一步地，所述步骤S1中待测标本中的细菌基因组DNA提取后的浓度为10-200ng/ μ1〇
[0016] 进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括:阶段1:94°C 5min;阶段2:94°C 3〇8;阶段3:521€3〇8;阶段4:72 1€21^11;阶段5:721€71^11;阶段2至阶段4循环35次 ;在4°(：贮 存。
[0017]除此之外，本发明还提供了所述的用于结肠弯曲菌快速分型的引物在制备用于快 速分型结肠弯曲菌试剂盒中的应用。
[0018] 本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的方法:是利用结肠弯曲菌全基因组核酸 序列基因间隔片断中相似度较低的基因间隔区域为靶序列，根据所有引物间的退火温度差 在3 °C以内，PCR产物长度为100-3500bp，分别设计出15对结肠弯曲菌引物。使用这15对结肠 弯曲菌引物分别对待测菌株进行PCR扩增，依据所有扩增产物琼脂糖凝胶电泳后呈现条带 的数目及位置的多态性可达到对结肠弯曲菌分型的目的。
[0019] 本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型方法的结果判定方法是:对PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳图的条带数目和产物DNA片段长度进行分析，对于不同株的结肠弯曲菌15组 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图完全一致的判断为相同的基因型。
[0020] 本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的引物具有更好的分型能力和更高的分 辨指数，可以对结肠弯曲菌进行更精确的分型。将本发明提供的15对结肠弯曲菌引物采用 相同的扩增反应条件，可一次性完成15个不同引物对的PCR反应，观察凝胶电泳图呈现条带 的数目及位置可达到对结肠弯曲菌的分型，该方法具有操作简便快捷、特异性好和准确度 高的优点，可以有效的辅助结肠弯曲菌感染疾病的临床诊断。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型 的引物具有更好的分型能力和更高的分辨指数，可以对结肠弯曲菌进行更精确的分型。此 外，本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的方法具有操作简便快捷、特异性好的优点，可 以有效的辅助结肠弯曲菌感染疾病的临床诊断，是一种较为理想的结肠弯曲菌分型方法。
【具体实施方式】
[0022] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
[0023]实施例1、引物
[0024] 本发明提供的用于结肠弯曲菌快速分型的引物。
[0025] 表1本发明提供的引物
[0027]
[0028] 实施例2、结肠弯曲菌各靶基因间隔片断的长度
[0029]本发明提供的murD靶基因间隔片断的长度为117bp，tpx靶基因间隔片断的长度为 465bp，proB靶基因间隔片断的长度为760bp，yb jZ靶基因间隔片断的长度为1155bp，msrA靶 基因间隔片断的长度为1306bp，pUrB靶基因间隔片断的长度为1638bp，m 〇eA-3靶基因间隔 片断的长度为1910bp，mpg靶基因间隔片断的长度为2210bp，rplW祀基因间隔片断的长度为 2777bp，pr 〇P靶基因间隔片断的长度为3251bp，typA靶基因间隔片断的长度为212bp，mutY 靶基因间隔片断的长度为263bp，glnP靶基因间隔片断的长度为838bp，rluD靶基因间隔片 断的长度为922bp，typA靶基因间隔片断的长度为967bp。
[0030]表2结肠弯曲菌各靶基因间隔片断的长度
[0032]实施例3、一种用于结肠弯曲菌决速分型的方法 [0033] 1、结肠弯曲菌基因组DNA的提取：
[0034] 取待测的44株结肠弯曲菌，分别在血琼脂平板培养基上密集划线，置于5%02、 10 % % N2的微需氧条件下，37 °C增菌培养24-48h后，刮取培养基上全部菌落至2ml ddH2〇中，祸旋振荡混勾后再于lOOOOrpm离心2min，弃其上清液，按照Takara公司的细菌基 因组DNA小量纯化试剂盒进行操作，分别提取44株结肠弯曲菌基因组DNA，提取后的DNA浓度 为10-200ngAU。所得的基因组DNA在检测前于-20°C保存备用。
[0035] 2、待测菌株不同基因间隔片断的PCR扩增：
[0036] 以本发明实施例1提供的结肠弯曲菌基因分型的15对结肠弯曲菌引物，分别对44 株待测菌株中的15个靶基因间隔片断进行PCR扩增：
[0037] 2.1、扩增体系为25μ1:在PCR反应管中分别加入反应液22μ1，其组成均包括:2.5μ llOXTaq DNA Polymerase Buffer,0.5μ1 lOmM dNTPs,0.15yl 5U/yl Taq DNA Polymerase，17.85μ1 ddH2〇和ΙμL待检模板;然后再于相应管中分别加入10μΜ的两条引物 各1·5μ1;
[0038] 2.2、将上述各PCR管混匀稍离心后置于PCR仪上进行以下反应：①94°C预变性 5min，②94°C变性30s，③52°C退火30s，④72°C延伸2min，⑤72°C延伸7min，其中②-④步循 环35次。
[0039] 3、PCR产物的电泳检测：
[0040]将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取3μ1扩增产物与0.5μ1上样缓冲液混匀后点样 于含0.5mg/L GoldView的1.5%琼脂糖凝胶孔中，100V电泳45min后置于凝胶成像系统中成 像，观察PCR扩增产物条带情况，以实施例2的靶基因间隔片断的长度进行结果判断。结果如 表3所示：
[00411表3 44株结肠弯曲菌PCR产物及基因型
[0043]
[0044] 如表3所示:0代表没有出现扩增产物，1代表扩增产物长度与靶基因间隔片断预期 长度相同，la-lh分别代表扩增产物电泳条带为1条，但产物长度与靶基因间隔片断预期长 度不相同，且相互之间也不相同。2a_2i分别代表扩增产物电泳条带为2条，其中一个条带呈 现的序列长度与靶基因间隔片断预期长度相同，另一个条带呈现的序列长度互不相同。3a_ 3d分别代表扩增产物电泳条带为3条，其中一个条带呈现的序列长度与靶基因间隔片断预 期长度相同，另外两个条带呈现的序列长度各不相同。4a代表扩增产物电泳条带为4条，其 中一个条带呈现的序列长度与靶基因间隔片断预期长度相同，另外三个条带呈现的序列长 度各不相同。
[0045] 4、扩增产物的基因测序鉴定：
[0046] 对出现电泳条带的菌株，采用上述方法重新进行PCR扩增，扩增体系按比例扩大至 50ul，将PCR产物全部点样进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后切取凝胶上的条带，按照Takara公 司的DNA凝胶回收试剂盒进行操作，分别回收所有PCR产物。将纯化的PCR产物分别与pGEM-T克隆质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌E. col iDH5a，挑取白色菌落进行PCR扩增鉴定，增 菌后送广州英骏生物技术有限公司测序。按照表3的结果所示，将显示为1的PCR产物测序结 果与美国国立卫生研究院GenBank数据库(DNA序列数据库）中的基因序列进行比对，结果与 相应的靶基因间隔片断序列完全相同。将表3中显示为其它相同字符的PCR产物测序结果分 组比对，同源性均达100%。显示了本发明提供的结肠弯曲菌引物的准确性。
[0047] 5、AILP基因分型能力的比较：
[0048]根据前期基因分型金标准PFGE分型的结果，待测的44株结肠弯曲菌分为27个基因 型，如表3所示，根据表3中琼脂糖凝胶电泳图的条带数目和产物DNA片段长度，44株菌株中， 15组PCR产物琼脂糖凝胶电泳图完全一致的判断为相同的基因型。
[0049]本发明提供的AILP分型方法可将44株结肠弯曲菌菌株分为40个基因型，其中CC7 和CC9，CC20和CC21，CC28和CC29，CC35和CC36分别为相同的型，其它菌株型别均不同。而 PFGE分型方法将这44株菌株分为27个基因型，其中型别相同的菌株有CC1、CC3和CC4，CC7、 CC8、CC9 和 0：10,0：14、0：15、0：16、0：17和0：19,0：20、0：21、0：24、0：25和0：26,0：28和0：29， CC39和CC40，CC43和CC44，CC35和CC36。表明了本发明提供的基因分型方法分型能力远优于 PFGE方法。
[0050] 6、AILP基因分型的分辨指数：
[0051 ]米用Hunter-Gaston分辨指数（Hunter-Gaston discriminatory index，HGDI)评 价AILP基因分型对结肠弯曲菌菌株的分辨能力，公式如下：
[0053] 其中，N为实验菌株总数，S代表不同基因型的数目，nj代表第j个基因型的菌株数。
[0054] 采用上述公式分别计算本发明提供的结肠弯曲菌基因分型检测引物组所对应的 15个靶基因间隔位点、各种不同位点组合及PFGE基因分型的分辨指数，并综合分析分型个 数和分辨指数两个指标，从每类位点个数相同的组合中选出最优的位点组合，如表4所示。
[0055] 表4不同位点组合及PFGE基因分型分辨能力比较
[0056]
[0057] 由表4可知，本发明提供的结肠弯曲菌基因分型检测引物组所对应的15个位点可 将44株结肠弯曲菌分为40个基因型，分型指数为0.996;表4第3行所示的9个位点也可将44 株空肠弯曲菌分为40个基因型，分型指数同为0.996;表3第4-10行所示的2-8个位点可将 44株空肠弯曲菌分为13-39个基因型，分型指数为0.883-0.995;单个位点呈现多态性最好 的是proP，分型指数为0.681。证明本发明提供的AILP分型检测引物组分辨指数极高，最低 优选4对引物对应的4个位点就可实现与PFGE分型相同甚至更高的分辨指数。。
[0058] 7、AILP基因分型检测重复性的评价：
[0059]将待测44株结肠弯曲菌的AILP基因分型试验分别由不同的操作者使用不同的PCR 仪重复3次，结果与表3显示的结果完全一致。证明本发明提供的分型方法具有很好的稳定 性和重复性。
【主权项】
1. 一种用于结肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，包括以下15对结肠弯曲菌引物： 针对murD基因的上游引物CCFl: 5 ' -GGACCCGACTAACCCTACG-3 '和下游引物CCRl: 5 ' -GGAGCGAATAGAAGTGAGCAT-3 ' ；针对tpx基因的上游引物CCF2:5 ' -AITTACAGGAGCAGCAGGAT-3 ' 和下游引物CCR2 : 5 ' -CCAATGGGGCTACTTTCTT-3 ' ；针对proB基因的上游引物CCF3 : 5 ' -CCCATCACTCACCCCACTA-3 ' 和下游引物CCR3:5 ' -ATTTGTCCACCCATTTTGC-3 ' ；针对yb jZ基因的 上游引物 CCF4:5 ' -ATGGTTTTAGGTGGTTGGG-3 ' 和下游引物 CCR4:5 ' -TGTTTTCGGTTCATTTGGA-3 ' ；针对msrA基因的上游引物CCF5:5 ' -GCAGATGACAACGAAGAAGTG-3 ' 和下游引物CCR5:5 ' -CGTGAAAAGCCTGTGAATAAA-3 ' ；针对purB基因的上游引物CCF6:5 ' -AGCCATTACAGCACTTACACC-3 ' 和下游引物CCR6:5 ' -AGGCAAAACAAAACAGACAAA-3 ' ；针对moeA-3基因的上游引物CCF7:5 ' -ATAGCGGCAGAGTGGTAAGG-3 ' 和下游引物CCR7:5 ' -GGAGCGGGAAACGAGATT-3 ' ；针对mpg基因的 上游引物CCF8:5'-ATAGCAAACTCGCACATTCTT-3'和下游引物CCR8:5'_ AAAACACCCTTTACAACCTCA-3 ' ；针对rplW基因的上游引物CCF9:5 ' -GTATGGATTGTGGGGTAGCA-3 ' 和下游引物CCR9:5 ' -AGTAAAGAGCGGTTGGGTG-3 ' ；针对proP基因的上游引物CCFlO: 5 ' -TCTTGCGGTTGGTTATTTATT-3 ' 和下游引物CCRlO: 5 ' -GACCTGGACCCTCTTTGCT-3 ' ；针对typA基 因的上游引物CCFl I : 5 ' -CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3 ' 和下游引物CCRl 1 : 5 ' -TCCCAGTTCGGATTGTTCT-3 ' ；针对mutY基因的上游引物CCFl2:5 ' -GGAGATGGCTGAGTGGTCG-3 ' 和下游引物CCR12:5'-AACTTTTACTTCGGGTTGGAT-3' ；针对glnP基因的上游引物CCF13:5'-CGGCATAGGAGGTTCTGG-3'和下游引物CCR13:5'-GACCCTTTCGTCTAGTGGC-3' ；针对rluD基因的 上游引物(^卩14:5'-6八61'(：(^6(^八八八1'(：〇八(：〇八-3'和下游引物(：〇1?14 :5'-AGTCCAAAATACCCATAAACAA-3' ；针对typA基因的上游引物CCF15:5' -GGTAAACAGTCGGGAGGGA-3 ' 和下游引物CCRl5:5 ' -CGTCGTCAAGAGGGAAACAA-3 '。2. 如权利要求1所述的用于结肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述结肠弯曲菌 的上游引物与下游引物的浓度比为1:1。3. 如权利要求1所述的用于结肠弯曲菌快速分型的引物，其特征在于，所述murD靶基因 间隔片断的长度为117bp，tpx靶基因间隔片断的长度为465bp，pr 〇B靶基因间隔片断的长度 为760bp，ybjZ靶基因间隔片断的长度为1155bp，msrA靶基因间隔片断的长度为1306bp， purB靶基因间隔片断的长度为1638bp，m〇eA-3靶基因间隔片断的长度为1910bp，mpg靶基因 间隔片断的长度为2210bp，rplW靶基因间隔片断的长度为2777bp，pr 〇p靶基因间隔片断的 长度为3251bp，typA靶基因间隔片断的长度为212bp，mutY靶基因间隔片断的长度为263bp， glnP靶基因间隔片断的长度为838bp，rluD靶基因间隔片断的长度为922bp，typA靶基因间 隔片断的长度为967bp。4. 一种用于结肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，包括如下步骤： Sl应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测标本中的细菌基因组DNA; S2以待测标本中的细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的15对结肠弯曲菌引物 分别进行PCR扩增； S3将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。5. 如权利要求4所述的用于结肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步骤Sl中待 测标本中的细菌基因组DNA提取后的浓度为10-200ngAU。6. 如权利要求4所述的用于结肠弯曲菌快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S2中的 PCR扩增反应条件包括：阶段1:94°C 5min;阶段2 :94°C 30s ;阶段3 : 52 °C30s ;阶段4: 72°C 2min;阶段5:72 °C 7min;阶段2至阶段4循环35次;在4 °C贮存。7.如权利要求1所述的用于结肠弯曲菌快速分型的引物在制备用于快速分型结肠弯曲 菌试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/04GK105886623SQ201610272807
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】毕水莲, 罗永文
【申请人】广东药学院