一组绵羊毛用性状相关snp的筛选及应用
【专利摘要】一组绵羊毛用性状相关SNP的筛选及应用属家畜分子标记辅助选择育种技术领域，本发明利用单核苷酸多态性标记分析预测绵羊毛用性状，用SEQ ID NO:2和3或SEQ ID NO:4和5所示引物，对不同绵羊个体总DNA进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自5’端起第336位、513位和572位碱基为C或T，含有由336位突变所构成的CC和CT基因型个体，羊毛拉伸长度显著提高；由513位和572位TT构成的N单倍型纯合型NN或杂合型NM个体，产毛量和拉伸长度显著大于M单倍型纯合型MM个体；本发明可作为超细型细毛羊早期选种的诊断标记，能缩短品种选育周期，降低对后裔测定的依赖程度，在降低常规育种成本的同时能加快育种进程。
【专利说明】
一组绵羊毛用性状相关SNP的筛选及应用
技术领域
[0001] 本发明属于家畜分子标记辅助选择(Marker assisted selection,MAS)育种技术 领域，具体涉及绵羊毛用性状功能基因角蛋白关联蛋白13 . 1 (keratin-associated protein 13.1，KAP13.1)基因功能性SNP筛选与应用。
【背景技术】
[0002] 羊毛是养羊业的主要产品之一，羊毛品质是其经济价值的决定因素，毛用性能的 提升是绵羊育种的重要目标。毛用性状除受环境、营养等因素影响外，更主要的由遗传因素 所决定。毛纤维主要结构蛋白角蛋白（Keratin，KRT)和角蛋白相关蛋白（Keratin-associated protein ，KAP) 作为主效基因 ，影响着毛纤维直径 (WFD) ， 毛纤维直径变异系数 (CVFD)和毛长(SL)等多个性状指标。迄今为止研究发现哺乳动物共含有27个KAP家族，按氨 基酸含量可分为尚硫角蛋白相关蛋白（半脫氣酸含量少于30%)，超尚硫角蛋白相关蛋白 (半胱氨酸含量少于30%)和高甘氨酸-酪氨酸角蛋白相关蛋白（甘氨酸和酪氨酸含量在35-60%)三类。KAP13家族属于高硫角蛋白相关蛋白，包含KAP13.1~KAP13.4四个家族成员。包 括绒山羊、绵羊在内的多个物种中KAP13.1基因存在丰富的多态性，与产绒性状密切相关。 与纤维直径更大的羊毛比较，纤维直径小的羊毛中KAP13.1蛋白的含量显著上升。提示 KAP13.1基因多态性完全有成为用于绵羊分子标记辅助育种标志物的潜质。
[0003] 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP)标记主要是指在基因 组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是所有生物体可遗传的变异中 最常见的一种，占所有已知多态性的90 %以上。SNP被誉为"第二代DNA遗传标记"，在传统数 量性状座位(Quantitative Trait Locus，QTL)区起到关键性作用的SNP位点，被称为数量 性状核苷酸(Quantitative Trait Nucleotides，QTN)。目前利用基因组重测序技术或高密 度SNP芯片技术所进行的研究是基于全基因组范围SNP位点检测为目标，由此开发出的全基 因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)技术，极大推动了SNP位点的筛选 的效率及预测结果的准确性，在由微效多基因控制的复杂性状功能基因或功能位点挖掘领 域成效尤为明显。但由于检测成本的限制，高通量的筛选方法尚未广泛开展。目前主流的 SNP筛选技术仍然是以PCR-SSCP，PCR-RFLP，HRM等传统技术为主流，共同特点是以基因组特 定一小段区域，甚至单SNP位点为检测目标，范围小但准确性高。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一组绵羊SNP标记，在SEQ ID N0:1所示序列自5'端起第336位、513 位和572位碱基为C或T。
[0005] 本发明还提供了利用SNP标记预测绵羊毛用性状的引物，其序列如SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
[0006] 本发明还提供了绵羊SNP标记在绵羊毛用性状预测中的应用，具体是用上述的引 物对待测绵羊个体外周血DNA进行PCR扩增，然后再对PCR产物进行SSCP检测，确定自序列表 中SEQ ID NO: 1中自5'端起第336位、513位和572位碱基是T还是C，其中336位突变构成TT、 TC和CC三种基因型，513位C碱基和572位C碱基;Τ碱基和Τ碱基紧密连锁，分别构成CC单倍型 和ΤΤ单倍型两种类型，CC纯合命名为单倍型MM，CCTT杂合命名为单倍型ΜΝ，ΤΤ纯合命名为单 倍型ΝΝ，其中CC和CT基因型个体羊毛拉伸长度，显著高于ΤΤ基因型个体;ΝΝ和ΜΝ个体在产毛 量和拉伸长度指标中，显著高于ΜΜ个体。
[0007] 本发明所描述的SNP检测方法为聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、高分 辨率熔解曲线、等位基因特异性寡核苷酸探针和DNA测序方法。
[0008] 本发明还提供了含有序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID Ν0:4和SEQ ID NO: 5所示引物的SNP预测羊毛性状的检测试剂盒，该试剂盒包括血液提取试剂盒、PCR扩增 试剂盒和SSCP检测试剂盒三部分。
[0009] 还包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs及灭菌双蒸水。
[0010] 本发明利用绵羊KAP13.1基因的336位、513位和572位点存在的SNP位点进行基因 型快速分型，新吉细毛羊群体存在这些多态位点上的基因型频率和等位基因频率存在显著 差异，利用SPSS19.0软件，采用一般线性模型对新吉细毛羊个体上述突变位点所构成的基 因型与毛用性状进行关联分析，结果发现上述3个基因 SNP位点所构成的两种基因型与毛用 性状密切相关，其中CC和CT基因型个体羊毛拉伸长度显著高于TT基因型个体(P〈0.05)，NN 和ΜΝ单倍型型个体在产毛量和拉伸长度指标中显著高于MM个体(P〈0.05) IAP13.1基因多 态位点的检出，不仅为分子育种提供了新的素材，同时为绵羊毛用性状的标记辅助选择，提 供了科学依据和辅助手段。
[0011] 本发明可作为超细型细毛羊早期选种的诊断标记，缩短超细型细毛羊品种选育或 毛用性能提高的选育周期，降低对后裔测定的依赖程度，在降低常规育种成本的同时加快 育种进程。
【附图说明】
[0012] 图1为P2引物PCR扩增产物SSCP检测结果聚丙烯酰胺凝胶电泳图
[0013] 图2为P3引物PCR扩增产物SSCP检测结果聚丙烯酰胺凝胶电泳图
[0014] 图3为P2引物PCR扩增不同基因型产物克隆测序结果示意图
[0015] 图4为P3引物PCR扩增不同基因型产物克隆测序结果示意图
【具体实施方式】
[0016] 若未特别指出，本实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段。
[0017]实施例！皮肤组织DNA提取
[0018] (1)用手术剪将0 · 3g绵羊皮肤组织样品充分剪碎，置于1 · 5mL离心管中，加入500yL 组织DNA提取液。
[0019] (2)在上述离心管中加入RNA酶溶液至终浓度为20yg/mL，充分混匀，至37 °C水浴箱 消化lh。
[0020] (3)在上述离心管中加入蛋白酶K至终浓度为150yg/mL，充分混匀，至55°C水浴摇 床消化12-24h。
[0021] (4)在上述离心管中加入等体积的Tris饱和酚，上下缓慢颠倒直至充分混匀。4°C， 1200rpm离心10min，然后将上清液移至新的离心管中，重复步骤(4)一次。
[0022] (5)加入等体积的酸:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混勾，4 <€，1200印111离心1〇111；[11。
[0023] (6)将上清液移至新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1)，充分混匀，4 °C，1200rpm离心 lOmin。
[0024] (7)将上清液移至新的离心管中，加入1/10体积的pH值为5.2的3M NaAc溶液，充分 混匀后加入2倍体积的冰冷无水乙醇，上下缓慢颠倒直至白色絮状DNA析出。
[0025] (8)将DNA沉淀挑出移至新的离心管中，75%乙醇洗涤两次。
[0026] (9) DNA沉淀自然干燥后，加入适量TE溶液溶解，-20 °C保存。
[0027]共提取不同年度，不同羊场476个新吉细毛羊成年羊(4-5岁）个体皮肤组织DNA，每 只羊当年产毛生产数据包括产毛量(kg)，毛细度(μπι)，拉伸长度(cm)和体重(kg)等相关指 标进行详细记录。
[0028] 实施例2基因组PCR扩增
[0029]目前尚无绵羊KAP13.1基因组序列信息，同时考虑到KAP家族基因均为单外显子基 因，因此以绵羊KAP13-1样mRNA预测序列(XM_004002776.3)为模板设计PCR-SSCP引物，引物 信息见下表所示。
[0030] 表1. 3对KAP13.1基因特异性引物序列、退火温度及目的片段长度
[0031]
[0032] 在PCR管中加入： 模板 DNA (50 μ g/ mL) 1, Ο μ L 引物 F(10ymol/mL) 2, 0 μ L
[0033] 引物 R(l〇y]nol/niL) 2,0 μ L 10 mM dNTP mix 2. Ο μ L 10 X PCR 缓冲液
[0034] TaqDNA 聚合酶 〇. 3 μ L ddH20 补至
[0035] PCR扩增温度的设置：
[0036] 预变性 95°C3min
[0037] 35 个循环：变性 94°C，30sec
[0038] 退火温度参加表1，30sec
[0039] 延伸 72°C，30sec
[0040] 延伸 72°C，10min [0041 ] 降温至12Γ保存
[0042] 用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。电泳检测表明KAP13.1基因 2对引物PCR 产物均为特异性扩增，片段大小与预期一致，无非特异性扩增条带，扩增产物可直接进行 SSCP分析。
[0043] 实施例3 PCR产物SSCP分析
[0044] (1)用洗涤剂将玻璃板清洗干净，蒸馏水反复冲洗晾干备用。
[0045] (2)将玻璃板装入胶框，用2.5%琼脂糖凝胶封闭，参照标准配方制备12%聚丙烯 酰胺凝胶，充分混合后倒入玻璃板内，插入齿梳室温静止30min以上使凝胶充分凝固。
[0046] (3)确认凝胶充分凝固后，小心拔掉齿梳，蒸馏水清洗点样孔、吸水纸吸干后将玻 璃板放入电泳槽上，加入适量1 X ??Ε电泳液，确认无漏液现象发生后300V，60mA预电泳 lOmin左右。
[0047] (4)取2yL PCR产物，加入8yL变性缓冲液，瞬时离心后98°C变性lOmin，不待样品降 温，立即取出置于冰上快速降温至少5min。
[0048] (5)用点样器将变性样品按顺序加入上样孔底部，4°C，150V电泳过夜（12-14h左 右)。
[0049] (6)电泳结束后，取出凝胶，用蒸馏水快速冲洗后，至于20 %乙醇中固定1 Omin。 [0050] (7)蒸馏水反复清洗3次，加入1 %的硝酸溶液氧化3min，蒸馏水反复清洗3次，加入 0.1 %硝酸银溶液，室温下置于摇床染色30min。
[0051] (8)蒸馏水反复清洗3次，加入银染显色液，置于摇床显色，待条带清晰后，快速去 除显色液，加入适量4 %乙酸终止显色。
[0052] (9)用凝胶成像系统拍照以备不同个体基因型分析。
[0053] (10)选择纯合子基因型个体或特殊基因型个体进行目的片段克隆测序，确定突变 位点。
[0054] 通过对SSCP电泳结果分析发现引物KAP13.1-P2和KAP13.1-P3扩增产物存在基因 型多态性。克隆测序分析发现KAP13.1-P2扩增产物基因型多态性由T336C构成，基因型命名 为CC，CT和ΤΤΙΑΡΠ .Ι-Ρβ扩增产物基因型多态性由C513T和T572C构成，其中C和C，T和T分 别紧密连锁，由此形成CC或TT单倍型(Haplotype)，CC纯合命名为单倍型MM，CCTT杂合命名 为单倍型MN，TT纯合命名为单倍型NN。
[0055] 米用SPSS19.0(Statistical Product and Service Solutions 19.0，SPSS19.0) 软件，一般线性模型分析方法对新吉细毛羊群体个体的毛用性状及KAP13.1基因型或单倍 型数据进行关联分析，根据毛用性状的影响因素，分析是采用以下固定模型：
[0056] YijkimnP = y+Breedi+Agej+Genotype/Haplotypek+Litteri+Sexm+Yearn+FarmP+ θ?jklmnp
[0057] 其中：Yijkimnp-个体毛用性状记录;μ-毛用性状的群体平均值;Breedi-父本的品种 效应;Agej-年龄效应;Genotype/Haplotypek-候选基因基因型或等位基因效应;Li tteri-胎 产羔数效应;Sexm_性别效应;Yearn-年份效应;FarmP_农场效应;e ijki胃-随机效应。
[0058] KAP13.1基因 KAP13.1-P2和KAP13.1-P3区基因型频率、等位基因频率及多态信息 含量参见表2。经X2检验表明新吉细毛羊上述两个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(p> 0.05)〇
[0059] 表2 KAP13.1基因型频率、基因频率与多态信息含量
[0060]
[0061]采用一般线性模型分析基因型/单倍型与毛用性状的关联性。C336T所构成的3种 基因型与毛用性状关联分析结果见表3。结果发现3种基因型个体在羊毛拉伸长度指标上存 在显著差异(P〈〇.〇5)，其中CC和CT基因型个体显著高于TT基因型个体(p〈0.05)，C(^PCI^ 因型个体间并未表现出显著差异( ？>〇.〇5)。513位和572位点突变所构成的单倍型与毛用性 状关联分析结果见表4。结果发现3种单倍型个体在产毛量和羊毛拉伸长度指标上存在显著 差异(p〈0.05)其中NN和Ml单倍型个体在产毛量和羊毛拉伸长度两项指标上均显著高于TT 基因型个体(？〈0.05)，顺和匪单倍型个体间并未表现出显著差异(？>0.05)。
[0062]表3 KAP13.1基因 T291C位点不同基因型与经济性状之间的相关分析
[0065]注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
[0066] 表4 KAP13.1基因 C469、528T位点不同基因型与经济性状之间的相关分析
[0068] 注：同行数字后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
【主权项】
1. 一组绵羊单核苷酸多态性标记，其特征在于：在SEQ ID NO:1所示序列自5'端起第 336位、513位和572位碱基为C或T。2. -种用单核苷酸多态性标记预测绵羊毛用性状的引物，其特征在于:所述引物的序 列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示。3. 权利要求1所述的绵羊单核苷酸多态性标记在绵羊毛用性状预测中的应用。4. 一种单核苷酸多态性检测方法，其特征在于:所述的方法为聚合酶链反应-单链构象 多态性、高分辨率熔解曲线、等位基因特异性寡核苷酸探针和DNA测序方法。
【文档编号】C12Q1/68GK105886615SQ201610247375
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】张立春, 孙福亮, 张明新, 金海国, 朴庆林, 曹阳, 于永生
【申请人】吉林省农业科学院