大豆品种ssr指纹图谱身份证的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于：首先对SSR标记进行初步筛选，然后以多样性指数高低为选择依据，确定大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记，再然后记录核心SSR标记在大豆品种中的整体指纹图谱带型，并对这些带型进行数字编码，最后按照固定的顺序串联核心SSR标记的带型编码，即为大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码。其有效解决传统方法存在的等位变异记录方式容易出现误差、较多数量的SSR标记组合不利于后续比对鉴定及推广应用等技术难题，具有简单明了地区分品种、数据易于存档记录和分析比较等优点，可以为快速准确地鉴定大豆新品种，评价种质资源和解决品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。
【专利说明】
大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，属于农作物品种分子 鉴定技术领域。
【背景技术】
[0002] 品种鉴定作为种子生产中的重要步骤，是保护新品种、防止假冒伪劣品种进入市 场、维护农民利益的重要手段。近年来，随着优异亲本的重复利用以及新种质的匮乏，部分 大豆品种出现血缘关系相近、表型特征相似的情况，然而传统的大豆品种鉴定方法以种子、 幼苗和植株形态特征、农艺性状差异等为依据，虽然简单、经济，但所需周期较长，且表型特 征易受环境影响，鉴别错误时有发生，无法满足当今品种鉴定的需要（中国油料作物学报， 2013/35 (3)//231~239)。随着分子生物学技术的发展，借助SSR分子标记指纹身份证技术直 接检测品种间基因型的差异，已成为比传统的形态学鉴定方法更加准确、高效的品种鉴定 技术。
[0003] 目前，传统大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法存在两个技术难题:第一，在 统计SSR标记扩增片段时，大多依据扩增片段的大小，并对应分子量从大到小，依次记录为 1，2，3，...，η，这种编码方式在SSR扩增条带较多、分布复杂时，容易出现读带误差、统计困 难等问题，这将直接影响后续的数据统计分析结果（麦类作物学报，2006/26(4)//164~ 168);第二，使用的SSR标记组合数量较多，不但增加了指纹图谱身份证的位数，而且在实际 应用过程中大大增加工作量，不利于后续的比对鉴定和推广应用（中国农业科学，2011/44 (10)//2081~2093)。为了给大豆种质资源、品种权的保护与管理提供更有力的技术支撑，这 就需要对现有大豆品种指纹图谱身份证技术体系进行改进和提高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，不但可以 有效解决传统方法存在的等位变异记录方式容易出现误差、较多数量的标记组合不利于后 续比对鉴定及推广应用等技术难题，而且具有简单明了地区分品种、数据易于存档记录和 分析比较等优点，可以为大豆新品种的快速鉴定和准确评价提供科学、准确、有效的技术支 撑。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供了一种大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其 特征在于构建的具体步骤如下： 1)大豆品种基因组DNA的提取:利用改进的CTAB法，将提取液中还原剂β-巯基乙醇的浓 度从1%增加到2.5%，从而有效减少DNA提取过程中组织的褐化降解;在提取液中加入浓度为 5%的聚乙烯吡咯烷酮PVP40,不但能够有效去除色素、脂肪等物质，而且能够提高DNA的完整 性;在用苯酚:氯仿抽提时，使用pH 4.0的苯酚，苯酚在低pH的情况下能促进水相中的蛋白 向有机相分配，从而最大限度的去除蛋白，提高DNA的纯度，即从O.lg大豆幼嫩叶片中提取 基因组DNA，并稀释到10-15 ng/μL，置于-20 °C冰箱保存备用； 2) SSR标记的初步筛选:选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320个SSR标记，通过PCR 扩增与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进行SSR标记的初步筛选，获得12个扩增稳定、条 带清晰、多态性高的SSR标记，这12个SSR标记分别为Satt397、Satt235、Satt422、Sat_128、 Sattl60、Satt367、Satl55、Satt448、Sat-245、Satt494、Sat-288、Sat-351; 3) SSR带型的记录与数据统计分析:根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，记录每 个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带型，并作为一个等位变异，然后将每个SSR标记 在大豆品种上扩增出来的全部带型按从简到繁的次序排列，顺次记录为1，2,3,...，n，最后 的结果是每一种SSR带型都被一个数字所赋值。利用POPGENE 1.31统计软件计算每个SSR 标记的等位变异数和多样性指数;所谓的"每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的全部带型 按从简到繁的次序排列"指的是扩增的条带数量少，带型简单;扩增的条带数量多，带型繁 琐； 4) 大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定：以多样性指数的高低为选 择依据，遂一加入步骤2)初筛获得的SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分开。 由于7个SSR标记就能够将大豆品种全部区分开，因此将Satt422、Sat_351、Sattl60、Sat_ 128、33丨155、3&?397、33丨_245这7个33財示记确定为大豆品种33財旨纹图谱身份证构建所需 的核心标记;从初选的12个SSR标记中选择出来的，选择的标准是"以多样性指数的高低为 选择依据，遂一加入步骤2)初筛获得的SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分 开； 5) 大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建:记录PCR扩增后步骤4)获得的核心SSR标记在 大豆品种中的整体带型，并将带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2.....n，最 后对于每一个品种，7个核心SSR标记都将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的SSR标记 顺序（依次为 Satt422、Sat_351、Sattl60、Sat_128、Satl55、Satt397、Sat_245)串联这 7 个带 型编码，即可形成一组由7个数字排列成的数据，也就是大豆品种的SSR指纹图谱身份证代 码。
[0006] 本发明的积极效果是： 1、 是一种应用性的遗传种质分析方法，其在指纹图谱的基础上将品种特征数字化，使 每个品种都拥有一个属于自己的字符串形式的代码，比较于传统田间种植鉴定方法，具有 周期短、易操作、稳定性好、重复性高、真实可靠、简单明了、易于存档记录和分析比较等优 点，可以被有效应用于大?品种的真伪鉴定、遗传关系分析和解决品种广权纠纷等方面； 2、 根据每对SSR扩增的带型间的差别，直接对带型进行整体编号，使每个SSR标记在不 同的大豆品种中扩增的不同带型都有一个对应的数字标识，不但简化了 SSR带型的记录方 式，而且提高了 SSR标记扩增条带的可读性，有效避免了人工统计所引起的误差； 3、 在确保数字代码唯一性的前提下，实现了尽量使用较少标记组合来构建大豆品种 SSR指纹图谱身份证的目的，在实际的推广应用过程中能够显著降低工作量，并且便于后续 的品种比对鉴定，不但能够为大豆新品种的快速鉴定和准确评价提供科学、准确、有效的技 术支撑，而且对保护和利用种质资源、鉴定种子质量、保护品种权益均具有重要意义。
【附图说明】
[0007] 图1本发明一种实施例中初筛SSR标记在大豆品种中的等位变异特征。
【具体实施方式】
[0008] 通过以下实施例进一步描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发 明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或 者改变都将落入本发明的权利要求范围内。
[0009] 实施例:吉林省新育成大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建 (1)大?品种基因组DNA的提取 选取吉林省2005-2012年审定的98个大豆品种，利用改进的CTAB法，从O.lg大豆幼嫩叶 片中提取基因组DNA，并稀释到10-15 ng/μL，置于-20°C冰箱保存备用。
[0010] (2)PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 PCR扩增反应体系总的体积为20μ1，其中含有10-15ng基因组DNA，0.25ymol/l上下游引 物，200ymol/l dNTPs，0.5 U Taq酶（TaKaRa)，lXPCR缓冲液（10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8.3; 50 mmol/1 KC1; 1.5 mmol/1 MgCUhPCR扩增反应程序为94°C预变性5min;94°C变 性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环30次;72°C延伸lOmiruPCR扩增反应结束后，在扩增 产物中加入3 μL上样缓冲液(36%甘油，30 mmol/1 EDTA，0.05%溴酚蓝，0.035%二甲苯青）， 取2.5μ1在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中恒压电泳分离，硝酸银染色显影检测。
[0011] (3)SSR标记的初步筛选 根据SoyBase网站提供的SSR标记引物序列，选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320 个SSR标记，先利用20个大豆品种进行SSR标记的初步筛选，获得12个扩增稳定、条带清晰、 多态性高的标记（图 1)，这12 个 SSR 标记为 Satt397、Satt235、Satt422、Sat_128、Sattl60、 Satt367、Sat 155、Satt448、Sat_245、Satt494、Sat_288、Sat_351。利用P0PGENE 1 · 31 统计 软件计算每个SSR标记的等位变异数和多样性指数(表1)。
[0012 ] (4 )大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定 为了达到用最少SSR标记区分最多品种的目的，以初筛获得的12个SSR标记的多样性指 数高低为选择依据，首先从多样性指数最高的标记Satt422开始筛选品种，但无任何品种能 够被区分开;再加入多样性指数第二高的标记Sat_351，结果发现能够区分开10个品种;再 加入多样性指数第三高的标记Sattl60,结果有49个品种能够被区分开;再加入多样性指数 第四高的标记Sat_128,结果发现能够区分开72个品种;再加入多样性指数第五高的标记 Satl55,结果发现能够区分开84个品种;再加入多样性指数第六高的标记Satt397,结果发 现能够区分开94个品种;最后加入多样性指数第七高的标记Sat_245,结果发现全部98个品 种都能够被区分开(表 2)。因此，将 Satt422、Sat_351、Sattl60、Sat_128、Satl55、Satt397、 Sat_245这7个SSR标记确定为大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需的核心标记。
[0013] (5)大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建 记录7个核心SSR标记在98个大豆品种中PCR扩增后获得的整体带型，并对这些带型进 行数字编码。以Satt422标记为例，其具有3个等位变异(表1)，即PCR扩增后其在大豆品种中 具有3种带型，这3种带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2、3。以同样方式，对其 他核心SSR标记扩增后的整体带型进行数字编码。
[0014] 对于每一个大豆品种，7个核心SSR标记将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的 SSR 标记顺序（依次为 Satt422、Sat_351、Satt 160、Sat_l 28、Sat 155、Satt397、Sat_245 )串联 这7个带型编码，即可形成一组由7个数字排列成的数据，也就是各品种指纹图谱身份证代 码(表3)。以表3中的吉育202为例，其指纹图谱身份证代码为3213311，其表示第1个SSR核心 标记（Satt422)的扩增带型为3号带型，第2个SSR核心标记（Sat_351)的扩增带型为2号带 型，第3个SSR核心标记(Sattl60)的扩增带型为1号带型，第4个SSR核心标记(Sat_128)的扩 增带型为3号带型，第5个SSR核心标记(Satl55)的扩增带型为3号带型，第6个SSR核心标记 (Satt397)的扩增带型为1号带型，第7个SSR核心标记(Sat_245)的扩增带型为1号带型。 [0015] 所述的12个SSR标记(含7个核心SSR标记)的引物序列如下：
表3 98个大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码
【主权项】
1. 大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于构建的具体步骤如下： 1) 大豆品种基因组DNA的提取:利用改进的CTAB法，从0.1 g大豆幼嫩叶片中提取基因组 0嫩，并稀释到10-15即/^1，置于-20°(：冰箱保存备用； 2. SSR标记的初步筛选:选取均匀分布在大豆20个连锁群上的320个SSR标记，通过PCR 扩增与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，进行SSR标记的初步筛选； 3. SSR带型的记录与数据统计分析:根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，记录每 个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带型，并统计分析每个SSR标记的多样性指数； 4) 大豆品种SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记的确定：以多样性指数的高低为选 择依据，遂一加入步骤2)获得的初筛SSR标记，直至标记组合能够将大豆品种全部区分开； 5) 大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建:记录步骤4)获得的核心SSR标记在大豆品种中 PCR扩增后获得的整体带型，并对这些带型进行数字编码，再按照固定的SSR标记顺序串联 带型编码，即可形成大豆品种的指纹图谱身份证代码。2. 根据权利要求1所述的大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于所述 SSR标记初步筛选时，可获得12个扩增稳定、条带清晰、多态性高的SSR标记，这12个SSR标记 分别为Satt397、Satt235、Satt422、Sat_l 28、Satt 160、Satt367、Sat 155、Satt448、Sat_245、 Satt494、Sat_288、Sat_351。3. 根据权利要求1所述的大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于所述 SSR带型进行记录与数据统计分析时，可记录每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的整体带 型，并作为一个等位变异，然后将每个SSR标记在大豆品种上扩增出来的全部带型按从简到 繁的次序排列，顺次记录为1、2.....n，最后的结果是每一种SSR带型都被一个数字所赋值。4. 根据权利要求1所述的大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于所述 SSR指纹图谱身份证构建所需核心标记进行确定时，可依据SSR标记多样性指数的高低，首 先从多样性指数最高的标记开始筛选大豆品种，再加入多样性指数第二、第三、……高的标 记，最后发现7个SSR标记即可将大豆品种全部区分开，因此将Satt422、Sat_351、Sattl60、 3&1128、33丨155、3&?397、33丨_245这7个33財示记确定为大豆品种33財旨纹图谱身份证构建 所需的核心标记。5. 根据权利要求1所述的大豆品种SSR指纹图谱身份证的构建方法，其特征在于所述对 大豆品种SSR指纹图谱身份证进行构建时，可记录PCR扩增后7个核心SSR标记在大豆品种中 的整体带型，并将带型按从简单到复杂次序排列，依次被编码为1、2.....n，最后对于每一 个品种，7个核心SSR标记都将赋予该品种7个带型编码，再按照固定的SSR标记顺序(依次为 Satt422、Sat_351、Sattl60、Sat_128、Satl55、Satt397、Sat_245)串联这7个带型编码，SP可 形成一组由7个数字排列成的数据，也就是大豆品种的SSR指纹图谱身份证代码。
【文档编号】C12Q1/68GK105886613SQ201610241841
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】陈亮, 王曙明, 范旭红, 孟凡凡, 郑宇宏, 孙星邈, 张云峰, 王明亮
【申请人】吉林省农业科学院