磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用

磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种磁性氧化石墨烯?纳米金免标记复合物的制备方法及应用，基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA不同的吸附作用，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。通过磁性分离，利用纳米金在可见光区的显色效应，观察上清液中纳米金溶液随小RNA浓度不同所产生的颜色变化，并采用紫外?可见分光光度计进行定量分析，从而实现对小RNA的高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。
【专利说明】
磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种小RNA的检测方法，具体涉及一种磁性氧化石墨稀-纳米金免标记 复合物的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 比色法是一种利用有色物质溶液颜色的深浅，对待测物质含量进行测定的分析方 法，具有操作简便、灵敏度高、准确度高等优点，已广泛应用于生化分析领域。其中，纳米金 由于其独特的光学性质、良好的生物相容性和化学活性，在生物检测领域表现出潜在的应 用价值。目前采用纳米金比色法检测核酸分子的工作，大多是通过Au-S共价键将巯基修饰 的DNA自组装到纳米金表面。这些方法需要对DNA分子进行化学修饰，成本较高，且操作复 杂。此外，利用此方法组装得到的金纳米探针不易精确控制纳米金表面DNA的密度、构象以 及空间取向等。现已发现含有多个连续腺嘌呤的polyA序列对纳米金具有非常强的亲和力， 能够有效的吸附在纳米金表面。此外，采用polyA作为纳米金和DNA之间的连接体可以较好 地控制纳米金表面所连接DNA的空间取向，并且可以通过改变polyA的长度调控金纳米粒子 表面以polyA为介导的DNA的密度分布，同时控制并提高DNA的杂交能力。
[0003] 石墨烯(graphene)是由一层密集碳原子紧密排列而成的二维蜂窝状晶体点阵结 构。氧化石墨稀(graphene oxide，G0)是石墨稀的一种衍生物，其表面含有大量羟基和含氧 基团，同时在其边缘含有大量的羧基和羰基，这些基团使G0具有良好的亲水性，并为G0的功 能化提供了充足的活性位点；同时G0具有较高的比表面积，可以通过非共价作用力，如m 堆叠、氢键以及范德华作用力等进行功能化修饰，为其在生化分析领域的应用提供了优势。
[0004] 目前并没有磁性氧化石墨烯与非巯基核酸相结合制备成为磁性氧化石墨烯-纳米 金免标记复合物在检测小RNA的相关报道。

【发明内容】

[0005] 本发明针对现有技术，提供了一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小 RNA的比色法。
[0006] 本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明的第一个方面，提供一种检测小RNA的中间体，该中间体为免标记生物条形 码金纳米探针，其特点是：在纳米金上吸附DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5~ 10个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别 段;DNA2为5~10个腺嘌呤碱基，用于封闭位点。
[0008] 所述检测小RNA的中间体是通过以下方法制备得到的：向纳米金溶液中加入DNA1 和DNA2,并加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液混合反应2~5min(优选3min)，然后调节反应体系的 pH至中性，在20~30°C继续反应5~10min，再将反应后的混合液离心，洗涤去除未组装的 DNA1和DNA2，得到免标记生物条形码金纳米探针。
[0009] 具体的制备方法如下：
[0010] (1)向纳米金溶液中加入DNA1和DNA2，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5~10个腺嘌 呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段;DNA2 为5~10个腺嘌呤碱基，用于封闭位点；
[0011] (2)向上述混合液中加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液进行反应；
[0012] (3)向步骤(2)中的反应体系中加入PB缓冲液调节体系的pH至中性，继续反应5~ lOmin；
[0013] ⑷将反应后的混合液离心，用PB缓冲液洗涤以除去未组装成功的DNA1和DNA2。
[0014] (5)将洗涤后的生物条形码金纳米探针分散于PBS缓冲液，制备得到免标记生物条 形码金纳米探针。
[0015] 步骤(1)中，所述纳米金的制备为现有技术中的公知常识。根据本发明的实际情况 和研究效果，优先选用以下技术方案，纳米金的制备方法如下：加热四氯金酸溶液至沸腾， 在持续搅拌的条件下，加入柠檬酸三钠，继续煮沸10~20min，反应之后冷却，将溶液过滤， 得到纳米金溶液。
[0016] 优选的，所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5个腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金 表面;DNA2为5个腺嘌呤碱基，用于封闭位点。
[0017] 本发明可以通过控制腺嘌呤个数调节金纳米粒子表面以polyA为介导的二嵌段 DNA的密度分布。实验表明，随腺嘌呤个数增多，纳米金表面所连接的二嵌段DNA密度减小。 为构建免标记生物条形码纳米探针，即保证粒径为13nm的纳米金上DNA1 (即识别探针）与 DNA2 (即生物条形码）的比例为1:100，通过优化条件，确定范围为5~10个腺嘌呤，从而达到 封闭位点，减少交叉反应、提高检测灵敏度的目的。
[0018] 优选的，纳米金、DNA1和DNA2混合溶液中，所述纳米金、DNA1和DNA2的浓度比例为 1:1:100。
[0019] 所述生物条形码指的是纳米粒子上结合的大量序列相同、且不与目标物结合的 DNA片段，可以是单链DNA，也可以是双链DNA。本发明中DNA2作为生物条形码为5~10个腺嘌 呤(优选为5个），平铺式吸附在金纳米粒子表面，其作用主要体现在以下两个方面：1)用于 封闭金纳米粒子表面的位点，避免金纳米粒子表面结合多个二嵌段DNA(即DNA1)，有效减少 交叉反应，提高检测灵敏度;2)使吸附在金纳米粒子表面的DNA分子探针的构象更为伸展， 有利于靶分子与二嵌段DNA进行杂交反应。
[0020] 本发明的第二个方面，提供了一种检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复 合物，该复合物通过所述中间体中的DNA1识别段与磁性氧化石墨烯间的31-31堆叠作用，将所 述中间体吸附到磁性氧化石墨烯，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
[0021 ]所述检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合材料的制备方法如下:将所 述中间体和磁性氧化石墨烯混合反应，反应之后将反应体系磁性分离，除去未结合的中间 体，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。
[0022]其具体制备方法如下：
[0023] (1)向制备好的免标记生物条形码金纳米探针溶液中加入磁性氧化石墨烯，20~ 30°C 反应5 ~15min;
[0024] (2)将反应体系磁性分离，除去未结合的金纳米探针，得到磁性氧化石墨烯-纳米 金免标记复合物。
[0025]将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物分散于PBS缓冲液中，即得到磁性氧化石 墨烯-纳米金免标记复合物溶液。
[0026]优选的，所述中间体与磁性氧化石墨烯的体积比例为90~110:1(优选为100:1)。 [0027]其中，所述磁性氧化石墨烯的制备为现有技术中的公知常识。根据本发明的实际 情况和研究效果，优先选用以下技术方案，所述磁性氧化石墨烯的制备方法如下:首先采用 EDC活化氧化石墨烯的羧基，然后将活化后的氧化石墨烯与氨基包被磁性微球(粒径3~4μ m)反应，再进行磁性分离、清洗，得到磁性氧化石墨烯。
[0028]所述氨基包被磁性微球为现有技术中的公知常识，比如:氨基化的核壳式聚苯乙 烯磁性微球，本领域的技术人员可以常规得到，也可购买于天津贝思乐色谱技术开发中心。 [0029]本发明的第三个方面，提供了一种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小 RNA的比色法，基于所述的磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入待测 目标小RNA后，DNA1的识别段与待测目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将 吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中，磁性分离后，通过直接观察上清 液颜色的变化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的比色法检测。
[0030] 本发明所述的小RNA包括微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和与piwi相互作用的 RNA(piRNA)〇
[0031] 具体步骤如下：
[0032] (1)将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物制备成为磁性氧化石墨烯-纳米金免 标记复合物溶液；
[0033] (2)制作标准曲线：将不同浓度的目标小RNA加入到步骤（1)中的溶液中，进行反 应，反应后将反应液磁性分离，测定不同浓度下的紫外-可见吸收光谱，制作标准曲线；
[0034] (3)测定待测目标小RNA:将待测目标小RNA加入到步骤(1)中的溶液，进行反应，反 应后将反应液磁性分离，测定紫外-可见吸收光谱，根据标准曲线计算得到待测目标小RNA 的浓度。
[0035] 优选的，步骤⑵和步骤⑶中，反应温度为30~40°C，反应时间为0.5~1.5h。进一 步优选的，反应温度为37°C，反应时间为lh。
[0036] 本发明的有益效果是：
[0037] (1)本发明提供的检测小RNA的中间体具有以下优点：该中间体为免标记生物条形 码金纳米探针，特点是在纳米金上吸附DNA1和DNA2,所述DNA1为二嵌段DNA，一段为5~10个 腺嘌呤碱基，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段； DNA2为5~10个腺嘌呤碱基，作为生物条形码序列，用于封闭位点，有效减少交叉反应。采用 多个腺嘌呤碱基作为封闭试剂，使得上述免标记生物条形码金纳米探针作为检测小RNA的 磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的中间体，为准确、高效检测小RNA提供了良好基础。
[0038] 该中间体利用连续的腺嘌呤碱基与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条 形码金纳米探针。克服了传统方法中基于Au-S共价键相互作用，将巯基化的DNA固定于纳米 金表面所引起的不易精确控制纳米金表面所修饰的寡核苷酸的构象和空间取向、与靶DNA 杂交能力较弱等缺点。
[0039]经过大量实验验证与分析，本发明检测小RNA中间体的制备方法，使得到的核酸与 纳米金偶联后的中间体产物性质更加优异。
[0040] (2)本发明提供的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物具有以下优 点:通过DNA1识别段与氧化石墨烯间的31-31堆叠作用，将所构建的生物条形码金纳米探针吸 附到磁性氧化石墨烯表面，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨 烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，利用比色法实现高效、准确、特异检测目标小RNA。 现有技术中存在氧化石墨烯和纳米金的复合物，比如中国专利201510271333.2,但是两者 检测对象和检测的机理完全不同。
[0041 ]经过大量实验验证与分析，本发明的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制 备方法操作简单，实用，使得到的磁性复合物的性质更加优异，稳定性好，可以实现高效、准 确、尚特异性、尚灵敏性检测目标小RNA。
[0042] (3)本发明研究采用磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法， 该方法利用连续的腺嘌呤碱基与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条形码金纳米 探针。同时，利用氧化石墨烯表面的羧基与包被于磁性微球表面的氨基发生酰胺反应，制备 得到磁性氧化石墨烯。通过生物条形码金纳米探针识别段DNA与氧化石墨烯间的31-31堆叠作 用，构建磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA 吸附能力的差别，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA 双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。磁性分离后，通 过直接观察上清液颜色的变化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的 高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。该方法操作简便，成本低廉，检测结果直观，无需复 杂仪器设备，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0043] 图1:基于磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物比色法检测小RNA示意图。
[0044] 图2:加入不同浓度目标小RNA(miRNA-210)，磁性分离后，上清液颜色变化的照片。 m i RNA-210 的浓度（自左到右）：0，1 nM，2nM，4nM，6nM，8nM，1 OnM。
[0045] 图3:加入不同浓度目标小RNA(miRNA-210)，磁性分离后，上清液的紫外-可见光谱 图。miRNA-210的浓度（自下到上）：0，1 nM，2nM，4nM，6nM，8nM，1 OnM。
[0046] 图4:加入不同miRNA，磁性分离后，上清液在520nm处的紫外-可见吸光度的比较。
【具体实施方式】
[0047] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另行定义，文中所使用 的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相 似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0048] 实施例1
[0049] -、实验原理：
[0050] 基于磁性氧化石墨可以快速磁分离及其对单、双链DNA吸附作用不同的特点，结合 连续腺噪呤碱基(polyA)免标记修饰金纳米粒子技术以及纳米金在可见光区的显色效应， 建立了一种基于磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法。实验原理如图 1所示，首先利用P〇lyA与纳米金之间极强的吸附力，制备免标记生物条形码金纳米探针，即 在纳米金上吸附两种DNA(DNA1和DNA2,二者比例为1:100)，其中DNA1为二嵌段DNA，一段为5 个腺嘌呤碱基(A 5)，用于将DNA1固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识 别段;DNA2为5个腺嘌呤碱基(A 5)，作为生物条形码序列，用于封闭位点，有效减少交叉反 应。同时，利用氧化石墨烯表面的羧基与包被于磁性微球表面的氨基发生酰胺反应，制备得 到磁性氧化石墨烯。将制备好的生物条形码金纳米探针与磁性氧化石墨烯混合，通过DNA1 识别段与氧化石墨烯间的堆叠作用，将生物条形码金纳米探针吸附于磁性氧化石墨烯 表面，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。基于磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链 DNA吸附能力的差别，加入目标小RNA后，DNA1的识别段与目标小RNA特异性结合，形成DNA/ RNA双链结构，从而将吸附在磁性氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中。通过磁性分 离，利用纳米金在可见光区的显色效应，观察上清液中纳米金溶液随小RNA浓度不同所产生 的颜色变化，实现对小RNA的高灵敏度、高特异性的快速比色法检测。
[0051] 二、实验步骤：
[0052]表1所用寡核苷酸序列
[0054](一)磁性氧化石墨烯的制备
[0055] 1、将一定量的氧化石墨烯片置于烧杯中，加入二次水溶解，超声分散得到棕色溶 液，6000rpm离心1 Omin制得终浓度为lmg/mL的氧化石墨稀悬浮液；
[0056] 2、取600yL上述制备的氧化石墨烯悬浮液，向其中加入600yL EDC，37°C条件下振 荡活化lh;
[0057] 3、取300yL氨基包被磁性微球（粒径约为3~4μπι)，用咪唑-HC1缓冲液（1Μ，ρΗ = 6.8，现配现用)清洗三次，备用。
[0058] 4、向上述活化好的氧化石墨烯溶液中加入清洗完全的氨基包被磁性微球，37°C振 荡反应12h。
[0059] 5、将制备好的磁性氧化石墨烯进行磁性分离，用二次去离子水清洗三次，将清洗 后的磁性氧化石墨烯分散于二次水中，4°C保存备用。
[0060] (二)纳米金的制备
[0061 ] 1、将100mL 0.01%的四氯金酸溶液（取lmL 1%的四氯金酸溶液于100mL容量瓶 中，定容)加入三口烧瓶中，快速搅拌下加热至沸腾。
[0062] 2、在持续搅拌的条件下，迅速加入2.5mL柠檬酸三钠（1 % )，将此溶液继续煮沸 15min，移去热源，继续搅拌至整个反应系统自然冷却至室温。
[0063] 3、将冷却至室温的纳米金溶液通过微孔滤膜（0.22μπι)过滤，最终得到粒径约为 13nm的纳米金溶液，4 °C保存备用。
[0064](三)免标记生物条形码金纳米探针的制备
[0065] 1、向纳米金溶液（10nM)中加入DNA1和DNA2，浓度分别为10nM和ΙμΜ;
[0066] 2、向上述混合液中加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液(500mM，pH=2)，室温下反应3min。
[0067] 3、向反应体系中加入1?缓冲液(200mM，pH=7.6)调节体系的pH至中性(每50yL纳 米金溶液加入3yL PB缓冲液），室温下继续反应5~lOmin;
[0068] 4、将反应后的混合液离心（转速为12000rpm)，用1?缓冲液（1 OOmM，pH = 7.6)洗涤 三次以除去未组装成功的DNA1和DNA2。
[0069] 5、将洗涤后的生物条形码金纳米探针分散于PBS缓冲液（1 OOmM，pH = 7.6)，4°C保 存备用。
[0070] (四）磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备
[0071] 1、向5mL制备好的免标记生物条形码金纳米探针溶液中加入50yL磁性氧化石墨 稀，室温反应lOmin;
[0072] 2、将反应体系磁性分离，除去未结合的金纳米探针。将磁性复合物分散于200yL PBS缓冲液中，即得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液。
[0073](五）目标小RNA的检测
[0074] 1、选择miRNA-210作为目标小RNA。将100yL不同浓度的miRNA-210(浓度依次为:0， InM，2nM，4nM，6nM，8nM，1 OnM)分别加入到300yL上述制备的磁性氧化石墨稀-纳米金免标记 复合物溶液中，37°C反应lh;
[0075] 2、将反应液磁性分离，观察上清液颜色变化，并测定其紫外-可见吸收光谱。
[0076](六)特异性检测
[0077] 1、取五份300yL磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液，分别加入100yL PBS 缓冲液（空白样品）、错配小RNA(miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-21)、目标小RNA(miRNA-210)，37°C反应lh(所加入的小RNA浓度均为4nM);
[0078] 2、将反应液磁性分离，观察上清液颜色变化，并测定其紫外-可见吸光度。
[0079]三、实验结果与讨论
[0080]将 100yL不同浓度的目标小RNA(miRNA-210)(浓度依次为：0，InM，2nM，4nM，6nM， 8nM，10nM)加入到300yL磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物溶液中，37°C反应lh后，将反 应液磁性分离，磁性氧化石墨烯上清液颜色变化如图2所示，上清液呈现出纳米金溶液的红 色，且红色随着加入目标小RNA浓度的增大逐渐加深。说明加入目标小RNA后，吸附在磁性氧 化石墨烯表面的生物条形码金纳米探针被成功解离下来，所解离下来的金纳米粒子的浓度 与加入的目标小RNA的浓度呈正相关。进一步，测定其上清液的紫外-可见吸光度。粒径约为 13nm的金纳米粒子在520nm处出现最大紫外-可见吸收。如图3所示，随加入的目标小RNA浓 度的增大，其对应的上清液在520nm处的紫外-可见吸光度升高，进一步说明解离下来的金 纳米探针的浓度与加入的目标小RNA的浓度呈正相关，从而实现对小RNA的定量检测。
[0081 ]为了评价该方法对目标小RNA检测的特异性，向所制备的磁性氧化石墨烯-纳米金 免标记复合物溶液中分别加入PBS缓冲液(空白样品）、错配小RNA(miRNA-155、miRNA-l96a、 miRNA-21)、目标小RNA(miRNA-210)，37°C反应lh后，将反应液磁性分离，取上清液，测定其 紫外-可见吸光度。结果如图4所示，体系中加入错配小RNA(miRNA-155、miRNA-196a、miRNA-21)后，其上清液在520nm处的紫外-可见吸光度与空白样品相比，没有明显变化；当加入目 标小RNA(miRNA-210)后，其上清液在520nm处的紫外-可见吸光度明显增大，表明该方法可 以尚特异性的检测目标小RNA。
【主权项】
1. 一种检测小RNA的中间体，所述中间体为免标记生物条形码金纳米探针，其特征是： 在纳米金上吸附DNAl和DNA2,所述DNAl为二嵌段DNA，一段为5~10个腺嘌呤碱基，用于将 DNAl固定于纳米金表面，另一段为与目标小RNA特异性杂交的识别段;DNA2为5~10个腺嘌 呤碱基，用于封闭位点。2. 权利要求1所述的检测小RNA的中间体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：向纳米 金中加入DNAl和DNA2，并加入柠檬酸盐-盐酸缓冲液混合反应2~5min，然后调节反应体系 的pH至中性，在20~30°C继续反应5~IOmin，再将反应后的混合液离心，洗涤去除未组装的 DNAl和DNA2，得到免标记生物条形码金纳米探针。3. 如权利要求2所述的检测小RNA的中间体的制备方法，其特征是:所述纳米金、DNAl和 DNA2混合溶液中，所述纳米金、DNAl和DNA2的浓度比例为1:1:100。4. 一种检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物，其特征是：该复合物通过 权利要求1所述中间体中的DNAl识别段与磁性氧化石墨烯间的31-31堆叠作用，将所述中间体 吸附到磁性氧化石墨烯，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。5. 权利要求4所述的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方法， 其特征是，包括以下步骤:将所述中间体和磁性氧化石墨烯混合反应后，将反应体系磁性分 离，除去未结合的中间体，得到磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物。6. 如权利要求5所述的检测小RNA的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物的制备方 法，其特征是:所述中间体与磁性氧化石墨烯的体积比例为(90~110): 1。7. -种磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物检测小RNA的比色法，其特征是:基于权 利要求4所述的磁性氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA吸附能力的差别，加入待测目标小RNA 后，DNAl的识别段与待测目标小RNA特异性结合，形成DNA/RNA双链结构，从而将吸附在磁性 氧化石墨烯表面的金纳米探针解离到溶液中，磁性分离后，通过直接观察上清液颜色的变 化并运用紫外-可见分光光度计进行定量分析，实现对小RNA的比色法检测。8. 如权利要求7所述的比色法，其特征是，包括以下步骤： (1) 将磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物制备成为磁性氧化石墨烯-纳米金免标记 复合物溶液； (2) 制作标准曲线：将不同浓度的目标小RNA加入到步骤（1)中的溶液中，进行反应，反 应后将反应液磁性分离，测定不同浓度下的紫外-可见吸收光谱，制作标准曲线； (3) 测定待测目标小RNA:将待测目标小RNA加入到步骤⑴中的溶液，进行反应，反应后 将反应液磁性分离，测定紫外-可见吸收光谱，根据标准曲线计算得到待测目标小RNA的浓 度。9. 如权利要求8所述的比色法，其特征是步骤（2)和步骤（3)中，反应温度为30~40°C， 反应时间为0.5~1.5h。10. 下述任一应用： 权利要求1所述的中间体在检测小RNA的应用； 权利要求4所述的磁性氧化石墨烯-纳米金免标记复合物在检测小RNA的应用； 权利要求7~9中任一项所述的比色法在检测小RNA的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105886611SQ201610209399
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】毕赛, 岳淑珍, 王宗花, 张立学, 龚世达
【申请人】青岛大学