一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于酶催化与传感检测技术领域，涉及一种蛋白模拟酶的制备方法，具体 涉及一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及其在常见食品中H202速测中的应 用。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶作为一种高效、特异的生物催化剂，能催化机体内众多生物反应，并被广泛 应用于功能催化和生物检测等领域。然而，天然蛋白酶也有诸多缺点，例如，易被降解、成本 高、储存困难，特别是其活性易受外部环境条件(PH，温度和抑制剂等)影响而变性失活等。 同时，常见蛋白酶(如过氧化氢酶、过氧化物酶、肌红蛋白和血红蛋白）的催化活性中心是血 红素。近年来，研究人员致力于研发基于血红素的蛋白模拟酶，如细胞色素 P450模拟酶和丝 氨酸蛋白酶模拟物，其中，尤以过氧化物模拟酶因被应用于过氧化氢和葡萄糖等检测而引 起了人们的广泛关注。
[0003] 血红素本身作为一种铁卟啉能够通过催化H202氧化反应底物产生颜色变化，表现 出了类过氧化物酶的活性;此外，它作为基于可逆的F e(III)/Fe(II)氧化还原电对的电子 给予体，对亚硝酸盐、氧气、氧化氮、L-酪氨酸、过氧化氢等小分子表现出很强的电催化性 能。然而，将血红素直接应用于各种催化领域仍然面临很大的挑战：（1)血红素本身催化活 性低且不溶于水；（2)水溶液中易聚集成活性很低的二聚体；（3)氧化性媒介中其结构易于 被破坏而使催化活性减弱。为了解决这些问题，一些研究工作者尝试采用对血红素进行化 学修饰或固定化以改良其催化性能，特别是，随着纳米制备技术的高速发展，纳米材料也被 广泛用于改善蛋白酶及其模拟物的催化活性。例如，纳米金颗粒被用于修饰辣根过氧化物 蛋白酶以提高其催化活性，但均收效甚微。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中存在的上述不足，通过模拟天然蛋白酶的结构和催化原理，提 供了一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，制备出一种具有高催化活性的 AuNCs@dBSA-Hem蛋白模拟酶。
[0005] 同时，本发明还提供了上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶 (即AuNCs@dBSA-Hem蛋白模拟酶）的应用。
[0006] 本发明技术方案如下： 一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，其特征在于:首先采用尿素使牛 血清白蛋白（BSA)变性，然后采用1，4-二巯基苏糖醇(DTT)还原剪切牛血清白蛋白得到含巯 基的链状牛血清白蛋白（dBSA)，通过与氯化血红素(Hem)交联制得含巯基的链状牛血清白 蛋白-氯化血红素（dBSA-Hem)骨架复合物，进而将其作为稳定剂和还原剂合成纳米金簇 (AuNCs)，并得到基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（即AuNCs@dBSA-Hem蛋白模拟酶）。
[0007] 上述基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，步骤为： 1) 室温下，将牛血清白蛋白（BSA)、尿素、EDTA和水混合，搅拌20 min，得浓度分别为7-1〇11^/1^牛血清白蛋白、5-8 1尿素和1.8-3.2 1111^^的混合液，随后向混合液中加入1，4-二巯基苏糖醇(DTT)至浓度为0.08-0.2 mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用去离子 水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白（dBSA)溶液，备用； 2) 室温下，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、氯化血红素和水混合，得浓度分别为90-120 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺盐酸盐、70-100 mM N-羟基琥珀酰亚胺和1.5-3.0 mg/mL氯化血红素的混合液，20-25 °(：搅拌活化lh，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1:10加入步骤 1)制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在35-40°C下搅拌l_3h，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素(dBSA-Hem)溶液； 3) 将步骤2)制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与8-12 mM的四氯金 酸(HAuC14)水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10 min，然后加入1.0 Μ的NaOH水溶液调节 混合溶液pH值为10-12,并在37°C下继续搅拌8-10h，再用去离子水透析10-14h，得基于血红 素和纳米金簇的蛋白模拟酶。
[0008] 步骤1)中，所述的牛血清白蛋白、尿素、EDTA与1，4_二巯基苏糖醇的优选浓度依次 为8.0 mg/mL，6 M ，2.0 mM，0.10 mM; 步骤1)中，所述去离子水透析时间优选12h; 步骤2)中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与 氯化血红素的优选浓度依次为100 mM，80 mM，2.0 mg/mL; 步骤2)中，加入步骤1)制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液后，搅拌温度优选37 °〇,搅拌时间优选2h; 步骤2)中，所述去离子水透析时间优选12h; 步骤3)中，所述的四氯金酸水溶液优选10 mM; 步骤3)中，所述的调节混合溶液pH值优选12。
[0009] 步骤3)中，所述的37°C下继续搅拌时间优选8 h。
[0010]步骤3)中，所述去离子水透析时间优选12h; 制备方法中，所述室温为20-25Γ ;所述的溶液如无特别说明，均为水配;所述的透析采 用规格为14 KDa的透析袋。
[0011] 本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶（即AuNCsO dBSA-Hem蛋白模拟酶）的应用：用于食品中H 2〇2含量的速测，测试方法为比色法或电分析法。 所述的电分析法是利用生物相容性的壳聚糖将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶固定 于电极表面，然后用于食品中H 2〇2含量的速测。
[0012] 本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶，采用比色法对 食品中H202含量的速测时，方法为： 1)建立标准曲线:室温条件下，将上述制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟 酶配制为10 yL 2.0 yg/mL的水溶液，然后加入到200yL含0.69 mM TMB的柠檬酸缓冲溶液 中，然后分别加浓度梯度范围为0.0030 - 0.21 mM的H2〇2,静置20 min，在波长652nm下分别 测定吸光度值，建立浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程； 2)待测样品检测：将待测样品预处理得稀释液，将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟 酶配制为2.0 yg/mL的水溶液，滴入到稀释液中进行显色反应，在波长652nm下测定吸光度 值，然后结合浓度-吸光度标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度； 步骤1)中所述柠檬酸缓冲溶液，pH为7.40，浓度为0.1M。
[0013] 本发明基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶采用比色法速测食品中h2〇2含量时， 可测定的H 2〇2浓度范围为:3.0 X 10-6-2.1 X 10-4mol/L，检测限为 1.0 X 10-6mol/L。
[0014] 本发明上述方法制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶，采用电分析法 对食品中H2〇2含量的速测时，方法为： 1) 建立标准曲线：向浓度为1.0 mM的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶水溶液中 加入0.5wt%的壳聚糖，混合均匀配制为电极修饰液，取5yL电极修饰液滴加到已清洗干净的 玻碳电极表面，室温下干燥成膜，得修饰电极;然后用pH 7.4的PBS缓冲溶液，配制一系列 浓度梯度的H2〇2-PBS溶液，H2〇 2浓度范围在0.0020 -0.22 mM，采用线性扫描(CV)的方法，用 修饰电极分别测定不同浓度H2〇2-PBS溶液的响应电流，建立浓度-响应电流标准曲线，得标 准曲线方程； 2) 待测样品检测： 将待测样品预处理得稀释液，然后取O.lmL稀释液与5 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液混 合，得待测样品-PBS溶液;将基于