草木犀药材指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及本发明涉及中药材指纹图谱的构建方法，尤其是草木犀药材高效液相 色谱（HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。本发明属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群 体特征的图谱或图像。中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的质量控制手段，可提供比单 一指标成分更全面的信息。目前，美国FDA、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加 拿大药用植物协会等均接受指纹图谱的指控方法，中国药品监督管理局也颁发了《中药注 射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》。中药材、中成药指纹图谱技术已经成为牵动行业 全面进步、带动中药现代化、推动中药走向世界的关键技术之一。
[0003] 草木犀，又写作草木樨,为豆科植物草木犀属（Melilotus Mill.) -年生或二年生 草本。以全草入药，生于沙丘、山坡、草原、海边，分布于我国大部分省区，又名辟汉草、省头 草、野苜蓿及铁扫把，目前栽培的多为白花草木犀和黄花草木犀。黄花草木犀由于其自身的 生长优势和化学成分适宜，在中国被用作很好的香料原料。民间以叶、花制成软膏，用作外 用药，或煎服用于治疗浮肿、腹痛、疟疾等证。
[0004] 本专利中提供了一种草木犀药材指纹图谱的构建方法，该方法简单、快速、有效。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种草木犀药材指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的草木犀标 准指纹图谱。所述方法前处理比较简单，并且获得的指纹图谱出峰数目多，各峰分离度较 好，在线分析时间短，构成了草木犀药材的指纹特征，可作为草木犀药材的标准指纹图谱。
[0006] 本发明的草木犀药材高效液相色谱指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0007] 1)称取草木犀药材粉末，加入体积百分浓度为30~70%的甲醇水溶液，超声震荡 提取，将提取液过滤得到滤液，即得到待测溶液；
[0008] 2)将步骤1)获得的待测溶液进行高效液相色谱分析，用十八烷基硅烷键合硅胶 为填充剂；以乙腈为流动相A，以质量百分浓度为0. 05~0. 2 %磷酸水溶液为流动相B，进 行线性梯度洗脱得到草木犀药材的指纹图谱，其中，流速为〇. 8~1. 2ml/min ;
[0009] 检测波长为275nm。
[0010] 所述方法中，所述步骤2)中梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置进行：
[0011]
[0012] ，即所述步骤2)中梯度洗脱程序如下：
[0013] 梯度1 :第0_5min进行等度洗脱，流动相A的体积百分浓度为3~10%，流动相B 的体积百分浓度为97~90% ;
[0014] 梯度2 :第5-45min进行线性梯度洗脱，流动相A的体积百分浓度由3~10%线性 增至22~25%，流动相B的体积百分浓度由97~90 %线性降至78~75% ;
[0015] 梯度3 :第45-60min进行线性梯度洗脱，流动相A的体积百分浓度由22~25%线 性降至3~10%，流动相B的体积百分浓度由78~75 %线性升至97~90%。
[0016] 在本发明一个技术方案中，所述步骤2)中梯度洗脱程序以如下体积比浓度配置 进行：
[0017]
[0018] ，即所述步骤2)中梯度洗脱程序如下：
[0019] 梯度1 :第0_5min进行等度洗脱，流动相A的体积百分浓度为3%，流动相B的体 积百分浓度为97% ;
[0020] 梯度2 :第5-45min进行线性梯度洗脱，流动相A的体积百分浓度由3%线性增至 22%，流动相B的体积百分浓度由97 %线性降至78% ;
[0021] 梯度3 :第45-60min进行线性梯度洗脱，流动相A的体积百分浓度由22%线性降 至3 %，流动相B的体积百分浓度由78 %线性升至97 %。
[0022] 所述方法中，所述步骤2)中十八烷基硅烷键合硅胶为YMC J'sphere 0DS-M80、 YMC-Pack 0DS-A或Agilent Eclipse Plus C18;流动相B为质量百分浓度为0.1 %的磷酸 水溶液；流速为1. 〇ml/min。
[0023] 在本发明一个技术方案中，所述步骤2)中所述高效液相色谱分析的柱温25~ 45°C，优选为 30°C。
[0024] 在本发明一个技术方案中，所述方法还包括配制香豆素对照品溶液，并将其进行 高效液相色谱分析，然后以香豆素对照品溶液的指纹图谱为参照，以香豆素峰为参照，根据 相对保留时间标定供试品溶液的指纹特征的步骤。
[0025] 在本发明一个技术方案中，所述步骤1)中，所述超声振荡的时间为30~40min，优 选为30min。
[0026] 在本发明一个技术方案中，所述步骤1)中，还包括将滤渣重复添加体积百分浓度 为30~70%的甲醇水溶液，超声震荡提取，过滤，将滤液合并，并定容至250ml，作为待测溶 液；其中，所述草木樨药材粉末或者滤渣与体积百分浓度为30~70%的甲醇水溶液的添加 比例为2g :80~100ml。
[0027] 在本发明一个技术方案中，所述步骤1)中，所述甲醇水溶液的体积百分浓度为 50%，所述草木樨药材粉末或者滤渣与甲醇水溶液的添加比例为2g :90ml。
[0028] 在本发明一个技术方案中，所述步骤1)中，所述过滤为用孔径为0. 45um的滤膜过 滤。
[0029] 在本发明的一个技术方案中，所述步骤2)中，高效液相色谱的进样量为20 μ 1。
[0030] 通过上述方法，本发明获得了草木樨药材的高效液相色谱指纹图谱。
[0031 ] 在本发明的中，所述HPLC指纹图谱，可以为下述指纹图谱：由29个共有特征峰组 成，特征峰的保留时间分别为：峰1 :3. 2min、峰2 :3. 5min、峰3 :4. 9min、峰4 :6. 2min、峰5 : 6. 6min、峰 6 :13. lmin、峰 7 :13. 7min、峰 8 :15. lmin、峰 9 :15. 6min、峰 10 :20. 7min、峰 11 : 24. Omin、峰 12 :30. 3min、峰 13 :31. lmin、峰 14 :32. 4min、峰 15 :32. 8min、峰 16 :33. 7min、 峰 17:34. 3min、峰 18 :34. 8min、峰 19 :35. 8min、峰 20 :36. 8min、峰 21 :37. 7min、峰 22 : 38. 6min、峰 23 :39. 4min、峰 24 :40.0 min、峰 25 :41. 9min、峰 26 :44. Omin、峰 27 :46. 4min、 峰 28 :48. lmin、峰 29 :50. 3min。
[0032] 以29号峰香豆素为参照峰，特征峰的相对保留时间分别为：峰1 :0. 063 (±5% )、 峰 2 :0· 069(±5 % )、峰 3 :0· 097(±5 % )、峰 4 :0· 122(±5 % )、峰 5 :0· 131(±5 % )、峰 6 :0.261(±5% )、峰 7 :0.273(±5% )、峰 8 :0.300(±5% )、峰 9 :0.311(±5% )、峰 10 : 0.411 (±5% )、峰 11 :0.476 (±5% )、峰 12 :0.602 (±5% )、峰 13 :0.618 (±5% )、峰 14 : 0.644(±5% )、峰 15 :0.652(±5% )、峰 16 :0.671(±5% )、峰 17 :0.681(±5% )、峰 18 : 0.691 (±5% )、峰 19 :0.713 (±5% )、峰 20 :0.732 (±5% )、峰 21 :0.749 (±5% )、峰 22 : 0· 768(±5% )、峰 23 :0· 783(±5% )、峰 24 :0· 795(±5% )、峰 25 :0· 833(±5% )、峰 26 : 0· 875(±5% )、峰 27 :0· 923(±5% )、峰 28 :0· 957(±5% )、峰 29 :1· 000。
[0033] 在本发明的又一个实施方式中，所述HPLC指纹图谱，可以为下述指纹图谱：由 32个共有特征峰组成，其保留时间分别为：峰1 :3. 6min、峰2 :3. 9min、峰3 :5. 5min、峰4 : 6. 9min、峰 5 :7. 4min、峰 6 :14. 2min、峰 7 :14. 9min、峰 8 :16. 4min、峰 9 :17. Omin、峰 10 : 21. 4min、峰 11 :22. 3min、峰 12 :22. 7min、峰 13 :26. Omin、峰 14 :27. 4min、峰 15 :29. 3min、 峰 16 :32. 4min、峰 17 :32. 8min、峰 18 :34. 2min、峰 19 :34. 6min、峰 20 :35. 6min、峰 21 : 36. 5min、峰 22 :37. 7min、峰 23 :38. 7min、峰 24 :39. 5min、峰 25 :40. 5min、峰 26 :41. 3min、 峰 27 :41. 8min、峰 28 :44. 8min、峰 29 :45. 8min、峰 30 :48. 4min、峰 31 :51. Omin、峰 32 : 53. 9min〇
[0034] 以32号峰香豆素为参照峰，特征峰的相对保留时间分别为：峰1 :0. 066 (±5% )、 峰 2 :0· 073(±5 % )、峰 3 :0· 102(±5 % )、峰 4