一种卷烟烟气中角鲨烯检测的样品前处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卷烟烟气中成分的检测技术领域，更具体地，涉及一种卷烟烟气中角 鲨烯检测的样品前处理方法。
【背景技术】
[0002] 角鲨烯最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名称为 2,6，10，15，19,23-六甲基一2,6，10，14，18,22-二十四碳六烯，属开链三萜类化合物。
[0003] 角鲨烯具有提高人体内超氧化物歧化酶(S0D)活性、增强机体抗氧化性和免疫能 力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作 用的生物活性物质。最近研究发现角鲨烯对人体还具有解毒作用，可移除组织中的脂溶性 毒素。已有研究表明：在烟丝中添加一定量的角鲨烯，可降低烟气中几种有害物质和自由基 含量，表明角鲨烯具有独特降害作用，目前开发利用角鲨烯已成为科技界和烟草业研究的 热点。
[0004] 2014年4月，国家烟草专卖局下发关于加快卷烟降焦减害技术成果推广应用的通 知（国烟办综[2014]218号），提出要加大卷烟减害技术重大专项研究成果的应用推广力度， 要采取针对性技术措施加快卷烟降焦减害步伐。为了配合国家局加快卷烟降焦减害步伐的 重大决策，本申请人在完成中国烟草总公司2013年度科技面上项目《广西主流烟气天然抗 氧化剂角鲨烯的生态累积与减害研究》（中烟办[2013] 149号)研究基础上，迫切需要建立一 种可行的适于标准的主流烟气角鲨烯含量的检测方法。
[0005] 但是，目前国内外还没有可参考的烟气中尤其是主流烟气中角鲨烯定性和定量的 检测方法，因此，在烟草行业建立烤烟中角鲨烯定性和定量的检测方法具有前瞻性，也是十 分必要的。而在烟气中角鲨烯的检测中，良好的样品前处理方法对获得准确科学的检测结 果起到关键性作用。在确定的检测条件下，采用不同提取剂提取样品中角鲨烯，其提取效 率、提取操作用时等因素都是必须考虑的重要因素，各个因素之间又是相互影响的关系，目 前未见基于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的样品前处理研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是填补现有烟气中角鲨烯的检测技术不足，尤其是适于 高效液相色谱法检测烟气中角鲨烯的样品前处理方法的不足，提供一种高效液相色谱法检 测烟气(主流烟气）中角鲨烯的样品前处理方法。
[0007] 本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
[0008] 提供一种卷烟烟气中角鲨烯检测的样品前处理方法，包括以下步骤：
[0009] S11.收集烟气固粒相物并提取:抽吸卷烟，采用滤片收集烟气固粒相物；
[0010] S12.提取:将收集了烟气固粒相物剑桥滤片放入锥形瓶中，加入提取剂，常温下振 荡提取，得提取液；
[0011] S13.净化:取步骤S12所得提取液，经过再处理后得到的溶液再经旋转蒸发至干得 样品前处理物。
[0012]其中，S12步骤所述提取剂为氯仿；
[0013]其中，步骤S13所述再处理指的是将步骤S12所得提取液旋转蒸发至干，用正己烷 溶解，再用正己烷洗涤得到正己烷溶液。
[0014] 优选地，步骤SI 1是按照GB/T 16450标准抽吸卷烟。步骤SI 1所述滤片为Φ 92mm的 剑桥滤片。
[0015]优选地，步骤S12所述振荡提取是用摇床以130转/min振荡20min。
[0016] 优选地，步骤S13所述洗涤的次数为3次。
[0017] 基于所述样品前处理方法，本发明同时提供一种高效液相色谱法检测主流烟气中 所含角鲨烯的方法，以甲醇和乙腈为流动相，采用填有粒径5μπι的高效固定相的柱色谱分离 技术，精确吸取lOyL待测样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于 210nm波长处检测角鲨烯的吸收值，采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。
[0018] 所述高效液相色谱法检测主流烟气中所含角鲨烯的方法包括以下步骤：
[0019] S1.样品经前处理得到样品前处理物；
[0020] S2.配制标准溶液，建立标准曲线；
[0021] S3.检测：取样品前处理物经过柱处理，收集洗脱液，旋转蒸发至干，用色谱乙腈定 容，过0.22μπι滤膜，取滤液注入高效液相色谱仪检测；
[0022] S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算角鲨烯含量。
[0023]所述检测的检测条件为：
[0024] (1)高效液相色谱仪HPLC(AgilentllOO)配紫外检测器；
[0025] (2)色谱柱：C18 柱，5ym，4.6X250mm;
[0026]⑶柱温：20°C;
[0027] (4)流动相类型：甲醇：乙腈(V:V = 70:30);
[0028] (5)流动相流速:0.8mL/min;
[0029] (6)检测波长为：210nm;
[0030] (7)进样量：10yL。
[0031] 步骤S2所述配制标准溶液的方法是准确称取0. lg角鲨烯标准品，精确至0 .OOOlg， 用乙腈(色谱纯)溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀。所 配标准溶液置于4°C保存，待用。
[0032] 步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是:采用系列稀释法，分别配制成浓度 为0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；以进样浓 度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方 程。
[0033] 本发明适用于卷烟主流烟气中角鲨烯的检测。
[0034]本发明具有以下有益效果：
[0035]本发明针对卷烟烟气建立了一种适于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的样品 前处理方法，采用氯仿作为提取溶剂，旋转蒸发至干后用正己烷溶解和洗涤，保障了较高的 提取效率。基于所述样品前处理方法，可建立烟气中角鲨烯的高效液相色谱检测方法，色谱 峰分离较好，具有准确、快速、高灵敏、重现性好、回收率高等优点。
【附图说明】
[0036] 图1角鲨烯标准曲线图。
[0037]图2角鲨烯标准样品色谱图（lmg/L角鲨烯标样，峰面积= 41.9)。
[0038]图3角鲨烯标准样品色谱图（5mg/L角鲨烯标样，峰面积= 213.3)。
[0039] 图4氯仿提取液未添加角鲨烯空白样品色谱图。
[0040] 图5氯仿提取液添加40mg/kg(换算为烟丝含量)角鲨烯样品色谱图。
[0041] 图6未经净化处理效果色谱图（空白对照）。
[0042]图7未经净化处理效果色谱图（添加40mg/kg角鲨烯样品）。
[0043] 图8经硅胶净化样品的色谱图（空白对照）。
[0044] 图9经硅胶净化样品的色谱图（添加40mg/kg角鲨烯样品）。
[0045] 图10经PSA柱净化后样品的色谱图（空白对照）。
[0046] 图11经PSA柱净化后样品的色谱图（添加40mg/kg角鲨烯样品）。
[0047]图12用PSA和硅胶复合柱净化后样品的色谱图（空白对照）。
[0048]图13用PSA和硅胶复合柱净化后样品的色谱图（添加40mg/kg角鲨烯样品）。
[0049]图14氯仿提取液直接过柱处理后色谱图。
[0050]图15氯仿提取液再经正己烷溶解后过柱处理后色谱图。
[0051] 图16 C8柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，5mg/kg角鲨烯标样）。
[0052] 图17 C8柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，空白对照）。
[0053]图18 C8柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，添加40mg/kg角鲨烯的样品）。 [0054]图19 C8柱检测样品的色谱图（流动相乙腈:水，5mg/kg角鲨烯标样）。
[0055]图20 C8柱检测样品的色谱图（流动相乙腈:水，空白对照）。
[0056]图21 C8柱检测样品的色谱图（流动相乙腈:水，添加40mg/kg角鲨烯的样品）。
[0057]图22 C18柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱温30 °C，波长210nm，5mg/kg角藍稀标样）。
[0058]图23 C18柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱温30 。(：，波长210nm，空白对照）。
[0059]图24 C18柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱温30 °C，波长210nm，添加40mg/kg角藍稀的样品）。
[0060] 图25 C18柱检测样品的色谱图（流动相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min，柱温20 。(：，波长210nm，空白对照）。
[00611图26 C18柱检测样品的色谱图（流动相流动相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min， 柱温20°C，波长210nm，添加40mg/kg角藍稀的样品）。
【具体实施方式】
[0062]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示 例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常 规市购或商业途径获得的试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本 领域常规使用的方法和设备。为方便说明，本发明实施例中使用的仪器和试剂说明如下，但 并不因此限定本发明。
[0063]仪器：
[0064] (1)高效液相色谱仪HPLCXAgilentllOO)，配备:脱气栗、四元栗、自动进样器、柱温 箱和紫外检测器(美国Agilent公司）
[0065] (2)全温控摇床(江苏金坛市荣华仪器有限公司）
[0066] (3)电子天平(BSA2245，d = 0 · lmg，赛多利斯科学仪器有限公司）
[0067] (4)旋转真空蒸发器:ZFQ-3型(上海亚荣生化仪器厂）
[0068] (5)真空抽滤栗:SHZ-Dm型(巩义市予华仪器厂）
[0069] (6)IKA中 MS3basic 涡旋仪(MS3BS25，IKA)
[0070] (7)RM2〇OA 吸烟机(德国）
[0071] (8)固相萃取柱(varian)
[0072] (9)各种实验室通用玻璃器皿 [0073]试剂：
[0074] (1)99.8%角鲨烯对照品（中国药检所）
[0075] (2)甲醇(色谱纯）
[0076] (3)乙腈(色谱纯）
[0077] (4)正己烷(分析纯）
[0078] (5)三氯甲烷(氯仿，分析纯）
[0079] (6)石油醚(分析纯）
[0080] (7)0·22μπι 有机滤膜
[0081] (8)净化剂:PSA(Welchrom)，硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂）
[0082] (9)商品烟(从广西中烟工业有限责任公司产品中随机性抽取）
[0083] 实施例1
[0084] 1.角鲨烯标准溶液的配制
[0085] 准确称取O.lg角鲨烯标准品，精确至O.OOOlg，用乙腈（色谱纯）溶解后定容至 100mL配制成1000mg/L角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀。所配标准溶液置于4°C保存。
[0086] 2.标准曲线的建立
[0087]采用系列稀释法，分别配制浓度为0.5，l，2,5，10mg/L的角鲨烯标准溶液于高效液 相色谱上检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，见图1所示。求出角鲨 烯浓度与相应峰面积的线性回归方程，y = 44.61 x-3.2993，R2 = 0.9996。标准角鲨烯色谱图 见图2和图3所示。
[0088] 3.液相色谱条件
[0089] (1)高效液相色谱仪HPLC(AgilentllOO)配紫外检测器
[0090] (2)色谱柱：C18 柱，5