玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药材检测领域，特别是涉及玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方 法。
【背景技术】
[0002] 经典方剂玉屏风制剂是扶正祛邪的代表方，来源自南宋嘉定六年（1213年）张松 《究原方》，由黄芪、白术和防风组成。其中黄芪甘温，内补脾肺之气，外可固表止汗，为君药； 白术健脾益气，助黄芪以加强益气固表之功，为臣药；佐以防风走表而散风邪。该方对人体 犹如抵御外邪的屏障，故称玉屏风。具有益气固表、健脾止汗的作用。主治气虚自汗、易感 风寒之证，临床疗效确切，被称为中成药中的丙种球蛋白。
[0003] 玉屏风制剂为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰 富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这 一问题，建立玉屏风制剂的指纹图谱将能较为全面地反映其中所含化学成分的种类与数 量，进而对其质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。玉屏风制剂指纹 图谱的研究和建立，对于提高玉屏风散质量，促进中药现代化具有重要意义。
[0004] 然而，就目前而言，玉屏风制剂的质量控制方法还存在一定缺陷，《中国药典》仅通 过经氨转化所得黄芪甲苷的含量来表征其质量，而现有关于玉屏风的指纹图谱研究多数集 中在汤剂，其它剂型的质量较少得到关注，且获得的指纹图谱的共有特征峰较少，难以全面 有效的表征或控制玉屏风制剂的质量。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法。
[0006] -种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0007] 取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取l_3h(优选为2h)， 过滤，即得供试品溶液；
[0008] 精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰 构成的玉屏风制剂指纹图谱，其中，
[0009] 所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0. 02-0. 1 % 磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。
[0010] 在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0_60min，流动相A的体积百分数由 15%变化至35%;6〇-8〇111；[11，流动相4的体积百分数由35%变化至47%;80-95111；[11，流动 相A的体积百分数由47%变化至70% ;95-110min，流动相A的体积百分数由70%变化至 90%0
[0011] 在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0. 05 %磷酸水溶液。
[0012] 在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱（优选 为 YMC Hydrosphere Cls，4.6X250mm，5ym);所述流动相的流速为 l.OmL/min;柱温 30°C; 检测波长230nm〇
[0013] 本发明还提供一种玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
[0014] 取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取l_3h，过滤，即得供 试品溶液；
[0015] 精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得，其中，
[0016] 所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0. 02-0. 1 % 磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。
[0017] 在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由 15%变化至35%;6〇-8〇111；[11，流动相4的体积百分数由35%变化至47%;80-95111；[11，流动 相A的体积百分数由47%变化至70% ;95-110min，流动相A的体积百分数由70%变化至 90%0
[0018] 在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0. 05 %磷酸水溶液。
[0019] 在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱（优选 为 YMC Hydrosphere Cls，4.6X250mm，5ym);所述流动相的流速为 l.OmL/min;柱温 30°C; 检测波长230nm〇
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021] 本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，通过大量的实验对供试品溶液的制 备以及高效液相色谱的条件进行了优化研究：
[0022] 采用甲醇对玉屏风制剂进行回流提取，并合理控制提取时间为l_3h，可有效增加 玉屏风制剂中如毛蕊异黄酮葡萄糖苷等成分的稳定性，提高构建所得指纹图谱的准确性和 精密度；
[0023] 通过对流动相系统进行考察，发现采用乙腈-体积浓度（0. 02-0. 1) %磷酸水溶液 (优选体积浓度为0.05% )系统按照本发明所述的梯度洗脱方式进行洗脱，可获得较多的 特征峰（共22个特征共有峰），且各特征峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，且 较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱；
[0024] 采用C18色谱柱（优选为YMC Hydrosphere C18)分析所得的指纹图谱中，色谱峰 尖锐对称，可获得较为丰富的峰信息。
[0025] 综上所述，本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，建立了由22个共有峰组 成的玉屏风制剂液相色谱指纹图谱，共有峰具有特征性，较为全面的将每味中药的主要成 分都进行的控制，有别于药典标准和现有文献评价方法，并且对每味药材的指标色谱峰做 了定性鉴别和峰归属，使得玉屏风制剂的质量控制更为全面和精确。经检验，该玉屏风制剂 指纹图谱的构建方法结果可靠，具有较好的重复性和精密度。
[0026] 本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，可以更准确全面地对玉屏风制剂的 质量进行控制，且精密度高，重复性好。
【附图说明】
[0027] 图1为空白溶剂高效液相色谱图；
[0028] 图2为供试样品溶液高效液相色谱图；
[0029] 图3为缺黄芪阴性对照高效液相色谱图；
[0030] 图4为缺防风阴性对照高效液相色谱图；
[0031] 图5为缺麸炒白术阴性对照高效液相色谱图；
[0032] 图6为对照品溶液高效液相色谱图；
[0033] 图7为12批玉屏风制剂指纹图谱（S1-S12)及对照指纹图谱（RFP);
[0034] 图8为玉屏风制剂的对照指纹图谱；
[0035] 图9为实施例2所述待测样品的指纹图谱；
[0036] 图10为实施例3所述待测样品的指纹图谱。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合具体实施例对本发明的玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法作 进一步详细的说明。
[0038] 实施例1
[0039] 本实施例一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法。
[0040] 1、材料
[0041] 1.1药物与试剂
[0042] 黄芪、防风、麸炒白术为香雪制药股份有限公司自生产；玉屏风散样品为香雪制药 股份有限公司自生产，将黄芪、防风、麸炒白术，分别粉碎，按3:1:1比例混合均匀即得。
[0043] 对照品：升麻素苷（中国食品药品检定研究院，111522-201209)、毛蕊异黄 酮葡萄糖苷（中国食品药品检定研究院，111920-201203)、升麻素（成都瑞芬思生物 科技有限公司，S-007-130908)、5-0-甲基维斯阿米醇苷（中国食品药品检定研究院， 111523-201208)、亥茅酚苷（成都瑞芬思生物科技有限公司，H-027-130912)、毛蕊异黄酮 (成都瑞芬思生物科技有限公司，M-021-130525)、芒柄花素（成都瑞芬思生物科技有限公 司，C-018-130428)、白术内酯III (成都瑞芬思生物科技有限公司，B-035-130428)、白术内 酯I (成都瑞芬思生物科技有限公司，B-033-130428)、白术内酯II (成都瑞芬思生物科技 有限公司，B-035-130428)、芒柄花苷（成都瑞芬思生物科技有限公司，M-013-130516)和槲 皮素（中国食品药品检定研究院，100081-200907)。
[0044] 甲醇、乙腈为色谱纯（德国默克），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
[0045] 1. 2 仪器
[0046] 电子天平（Mettler Toledo XS204 (d = 0· lmg)、Mettler Toledo XP205 (d = 0.0 lmg))、HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、Simplicity UV 纯水机（Millipore)、高效液相色谱仪（DIONEX Ultimate 3000、DAD-3000 检测器）。
[0047] 2方法与结果
[0048] 2. 1色谱条件
[0049] 色谱条件：色谱柱（YMC Hydrosphere C1S，4. 6X250mm，5 μπι);流动相乙腈（A)-体 积浓度0. 05%磷酸（B)，梯度洗脱（梯度见表1);流速1.0 mL/min ;柱温30°C;进样量10 μ L ; 检测波长230nm〇
[0050] 表1梯度条件
[0051]
[0052] 2· 2对照品溶液的制备
[0053] 对照品储备液的制备：分别精密称取升麻素苷3. 5mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 2. Omg、升麻素 2. 0mg、5-0-甲基维斯阿米醇苷3. Omg、亥茅酸苷2. 5mg、毛蕊异黄酮2. Omg、芒 柄花素 4. Omg、白术内酯III4. Omg、白术内酯I 4. Omg、白术内酯II 4. Omg、芒柄花苷2. Omg、槲 皮素 2. Omg，用甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，储存于4°C的冰箱中，备用。
[0054] 对照品溶液的制备：分别精密量取各对照品储备液适量，用甲醇定容，配制成含 升麻素苷35 μ g/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷20 μ g/mL、升麻素10 μ g/mL、5-〇-甲基维斯阿米 醇苷30 μ g/mL、亥茅酸苷25 μ g/mL、毛蕊异黄酮20 μ g/mL、芒柄花素40 μ g/mL、白术内酯 III 5 μ g/mL、白术内酯I 5 μ g/mL、白术内酯II 5 μ g/mL、芒柄花苷20 μ g/mL、槲皮素20 μ g/ mL的混合标准品溶液。
[0055] 2. 3供试品溶液的制备
[0056] 取玉屏风散粉末lg，精密称定，加50mL甲醇回流提取2h，过滤，滤液浓缩至干后， 加甲醇定容至10mL，即得。
[0057] 2. 4色谱峰归属