一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因检测方法，主要包括以下步骤：基于Gap?PCR法设计跨越断点和突变位点的PCR扩增引物特异性扩增α&β?地贫相关基因片段，对PCR产物进行文库构建，将文库产物进行高通量测序，将测序数据以人类基因组hg19作为参考序列，根据序列比对得分Q10分析目标区域chr16：215000?236000每个基因位点的测序深度值，根据不同位点的测序深度值分布，确定α?地贫缺失型别；同时通过目标区域chr16：215000?236000和chr11：5246400?5248600进行序列比对，根据具体位点的碱基类型确定α&β?地贫突变型别。采用本发明所述方法可实现对α?地中海贫血的6种突变基因型及β?地中海贫血26种突变基因型的同时检测。
【专利说明】
一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因 检测方法。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血(Thalassemia)，简称地贫。地贫是最常见的单基因遗传病之一，分为 α-地贫和β-地贫，分别是由于α或β珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成障碍，造成α链 与β链的比例失去平衡，而相对过剩的链呈游离状态容易氧化变性。变性的链沉积在红细胞 内，附于内膜上，使红细胞变形能力降低，膜通透性发生改变容易被破坏导致溶血性贫血。 其中α-地贫相关基因为ΗΒΑ2和ΗΒΑ1，β-地贫相关基因为ΗΒΒ。地贫集中在热带和亚热带地 区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国 是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和 香港等地受累人口超过2亿。中国人群中，α_地贫的基因型别常见的有_a SEA，-α3·7，-α4· 2，αε5 α，α-α和ακα，β-地贫常见的有26种基因突变型别。目前地贫尚无根治的方法，只能依靠传 统方法治疗，即以输血治疗为主，价格昂贵，因此对地贫携带者进行筛查具有重大意义。
[0003] 目前检测α-缺失型地贫的主要方法为Gap-PCR法，检测α-突变型地贫和β-突变型 地贫的主要方法为PCR-RDB法，因此不能对α&β-地贫的缺失和突变型别进行同时检测。鉴于 此，需提供一种可以同时检测α&β-地贫缺失和突变型别的方法。
[0004] 本发明结合地贫缺失型的跨越断点，突变型的基因位点及高通量测序技术，设计 相关的特异性引物进行PCR扩增，将测序通用接头序列连接到PCR产物两端，构建高通量测 序的DNA文库。经文库定量检测后进行高通量测序。通过生物信息学分析数据判断地中海贫 血基因型别。高通量测序技术具有准确度高、通量大、样本需求量少、可以产生大量数据的 特点，在检测已知型别的同时也可检出新发突变型。
[0005] 本发明应用Gap-PCR结合高通量测序技术，建立一种可以快速、准确、同时检测α& 地贫的方法。
【发明内容】
[0006] 1、本发明提供了一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因检测方法：
[0007] 采用该方法可实现对α-地贫的-aSEA，-(13'7，-(1 4'2，€[(；5€[，(105€[和€[*\[基因型别，以及0-地贫的CD41-42(_CTTT)，CD43(GAG>TAG)，CD40-41(+T)，-32(C>A)，-30(T>C)，-29(A> G)，-28(A>G)，-28(A>C)，CD7卜72(+A)，CD7卜73(+T)，CD17(AAG>TAG)，IVS-II-654(C> T)，CD26(GAG>AAG)，CD14-15(+G)，CD27/28(+C)，CD31(-C)，CD37(TGG>TAG)，5' UTRCap+1 (A>C)，5' UTR，Cap+40-43(-AAAC)，Initiation codon，IVS-I-1 (G>T)，IVS-I-5(G>C)， IVS-II-5(G>C)，CD8和CD8/9基因型的同时检测。
[0008] 2、本发明提供了分析α&β-地贫的方法，具体包括：
[0009] 将人类基因组hgl9作为参考序列，根据序列比对得分Q10分析目标区域chrl6: 215000-236000每个基因位点的测序深度值，根据不同位点的测序深度值分布，确定α-地贫 缺失型别；同时通过目标区域chrl6:215000-236000和chrll :5246400-5248600进行序列比 对，根据具体位点的碱基类型确定α&β-地贫突变型别。
[0010] 3、本发明提供了基于高通量测序方法的地中海贫血缺失和突变型文库构建方法， 具体包括：目的基因的扩增;扩增产物的酶切打断;打断产物的接头连接;连接产物的片段 选择;最后的文库片段PCR扩增及纯化。
[0011 ] 4、本发明提供了用于扩增地贫基因的引物组，具体包括：
[0012] ⑴针对α-地贫的6种基因型别的扩增引物：
[0020] 上述引物中，Sea-F和Sea-R为扩增-aSEA基因片段的正反向引物;3 · 7-F和3 · 7-R为 扩增-α3·7基因片段的正反向引物;4.2-F和4.2-R为扩增-α 4·2基因片段的正反向引物;3.7-F 和a2R为扩增HBA2基因片段(此部分HBA2基因片段为_aSEA、-a3 ·7和-a4·2型地贫共同缺失的基 因片段)的正反向引物，且该片段覆盖了 aesa，aQS4Pawsa的突变区域。
[0021] 注:扩增正常基因 a2的正向引物与扩增-α3·7型的正向引物3.7-F为同一条引物。 [0022] (2)针对β-地贫的26种突变基因型别的扩增引物：
[0023] BF:5 '-CAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCT-3，
[0024] BR:5 '-AAGGGCCTAGCTTGGACTCAGAATAATCC-3 '
[0025]引物名称中，BF为正向引物，BR为反向引物，扩增片段为β-地贫相关基因 ΗΒΒ突变 区域。
[0026]与现有技术相比，本发明提供的方法特点在于：
[0027] 1)通过引入Gap-PCR方法，结合高通量测序技术，即可实现对α-地贫的一aSEA，_ a3·7，-a4·2，aGSa，a QSa和awsa，以及β-地贫的26种型别同时检测；
[0028] 2)所需的样本DNA量少，仅需要1 Ong即可实现对样本的检测；
[0029] 3)具有高通量性，一次测序反应可同时进行96个样本的检测；
[0030] 4)在对已知突变位点检测的基础上，可以实现对新发位点的筛查与研究。
【附图说明】
[0031] 图1为样本3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0032] 图2为样本1根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0033] 图3为样本2根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0034] 图4为样本3根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0035] 图5为样本4根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0036] 图6为样本5根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0037] 图7为样本6根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0038] 图8为样本7根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0039] 图9为样本8根据不同Q值比对的测序深度值分布图；
[0040] 图10为样本9根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0041]图11为样本10根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0042]图12为样本11根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0043]图13为样本12根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0044]图14为样本13根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0045]图15为样本14根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0046]图16为样本15根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0047]图17为样本16根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0048]图18为样本17根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0049]图19为样本18根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0050]图20为样本19根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0051]图21为样本20根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0052]图22为样本21根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0053]图23为样本22根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0054]图24为样本23根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0055]图25为样本24根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0056]图26为样本25根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0057]图27为样本26根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0058]图28为样本27根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0059]图29为样本28根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0060]图30为样本29根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0061]图31为样本30根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0062]图32为样本31根据Q10比对的测序深度值分布图；
[0063]图33为样本32根据Q10比对的测序深度值分布图；
【具体实施方式】
[0064] 下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[0065] 样本说明：以下实施例所用的32个样本(其中阳性样本30个，阴性样本2个)均收集 自中山大学第一附属医院，分别编号为样本1-32,基因型如下：
[0068] 实施例1 :α&β-地贫检测方法的建立
[0069] ( -）引物设计
[0070] 通过Primer Premier 5.0软件，针对α-地贫的6种型别，以及β-地贫的26种突变型 另IJ，设计扩增引物对，引物序列和配对如下：
[0071 ] (1)针对α-地贫的6种型别的扩增引物：
[0079] 上述引物中，Sea-F和Sea-R为扩增_aSEA基因片段的正反向引物;3.7-F和3.7-R为 扩增-α3·7基因片段的正反向引物;4.2-F和4.2-R为扩增-α4· 2基因片段的正反向引物;3.7-F 和a2R为扩增HBA2基因片段(此部分HBA2基因片段为_aSEA、-a3 ·7和-a4·2型地贫共同缺失的基 因片段)的正反向引物，且该片段覆盖了 aGSa、aQSa、aWSa的突变区域。
[0080]注:扩增正常基因 a2的正向引物与扩增-a3·7型的正向引物3.7-F为同一条引物。 [00811 (2)针对β-地贫的26种突变型别的扩增引物：
[0082] BF:5 '-CAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCT-3，
[0083] BR:5 '-AAGGGCCTAGCTTGGACTCAGAATAATCC-3 '
[0084]弓丨物BF为正向引物，BR为反向引物，扩增片段为β-地贫相关基因 ΗΒΒ突变区域。 [0085] (3)引物的验证:应用上述设计的引物对样本3进行检测，结果如图1所示，证明本 发明所设计的引物能特异性的对目的基因进行扩增。
[0086](二)检测步骤：
[0087] (1)全血基因组DNA提取
[0088]按照DNeasy Blood&Tissue Kit(50)(厂家：Qiagen，货号：69504)试剂盒操作说明 书进行全血基因组DNA提取。DNA溶液可置于-20°C保存。
[0089] (2)文库构建
[0090] a.a-地贫 PCR 反应 [0091]引物Mix配制如下：
[0093] PCR反应体系如下：
[0096] PCR反应条件如下：
[0098] 反应结束，进行纯化，获得30yLDNA。
[0099] bj-地贫PCR反应 [0100] PCR反应体系如下：
[0102] PCR反应条件如下：
[0105] 反应结束，进行纯化，获得30yLDNA。
[0106] ο.α&β-地贫PCR产物的酶切打断
[0107] 酶切打断反应体系如下：
[0109] 加入10yL的Ion Shear? Plus Enzyme Mix II，立刻吹打混匀。不要涡旋震荡，避 免产生气泡。37°C反应5分钟。反应结束后，立刻加入5yL Ion Shear? Plus Stop Buffer， 涡旋5秒。稍离心。放于冰盒上。进行纯化，获得25yLDNA。
[0110] d.打断产物的接头连接
[0111] 接头连接反应体系如下：
[0113] 25°C反应15分钟，72°C反应5分钟，反应结束进行纯化，获得22yLDNA。
[0114] e.连接产物的片段选择
[0115] 选择Run SizeSelect 2%模式，点击G0开始运行E-Gel?预制琼脂糖凝胶电泳系 统。回收12.5yL330bp文库DNA片段。
[0116] f.文库片段PCR扩增
[0117] PCR反应体系如下：
[0119] PCR反应条件如下：
[0121] 反应结束进行纯化，获得22yL文库DNA。
[0122] (3)按照Ion PGM? HiQ? 0T2 Reagents 200(厂家：Life Technologies，货号： A26428)和Ion PGM? HiQ? 0T2 Solutions 200(厂家：Life Technologies，货号：A26429) 的试剂盒操作说明书进行模板制备和模板富集。
[0123] ( 4 )按照 I on PGM ITM H i QTM Se quen c i ng 20 0 Reagen t s (厂家：L i f e Technologies，货号：A26431)、Ion PGM? HiQ? Sequencing 200 Solutions(厂家：Life Technologies，货号：A26430)和 Ion PGM? Sequencing Nucleotides(厂家：Life Technologies，货号:A26432)的试剂盒操作说明书进行上机测序。
[0124] (三)数据分析
[0125] (1)数据量的分析：将人类基因组hgl9作为参考序列，分析目标区域chrl6: 215000-236000和chrll :5246400-5248600的平均测序深度值，测序深度值（Sequencing Depth) 2 500,进行下一步分析。
[0126] (2)α&β-地贫突变型别分析方法确定:分析α&β-地贫共29种型别的具体基因位点， 每个位点的测序深度值需2 500，否则需要重新检测，如果该位点所在区域全部缺失无需重 新检测，如_α3·7纯合缺失型的样本a WSa基因位点的测序深度值<500,该情况无需重新检测： 根据每个检测位点的突变频率来判断，突变频率值在0-5 %即突变野生型，40 %-60 %即是 杂合突变型，90%_100%则是纯合突变型，若突变频率值未落在以上范围内该样本需要重 新检测。
[0127] (3)α_地贫缺失型别分析方法确定:应用本发明所述的检测方法对样本1-8进行检 测，根据序列比对得分如、91、94、010分析每个基因位点的测序深度值分布，得出样本1_8不 同Q值的测序深度值分布图（如图2、3、4、5、6、7、8和9所示），比较样本1-8的同一〇值分析得 出的测序分布图，根据样本缺失类型及分布图差异最终确定最佳的序列比对得分Q值。通过 该方法分析得到的测序深度值分布，进行α-地贫缺失型别判别如下：测序深度值分布图中 横坐标为染色体位置，纵坐标为测序深度值。若在16:221913-221936和16:223631-223612 范围内有明显峰，且其他位置没有明显峰，则是α_地贫缺失阴性;若在16:219303-219327和 16:225173-225148范围内有明显峰，且其他位置没有明显峰，则是-α 4·2纯合缺失型；若在 16:221913-221936和16:227726-227702范围内有明显峰，且其他位置没有明显峰，则是-α 3·7纯合缺失型；若在16:235908-235888和16:215284-215308范围内有明显峰，且其他位置 没有明显峰，则是_a SEA纯合缺失型。若同时存在以上两种情况，则为对应型别的杂合缺失 型。根据图2、3、4、5、6、7、8和9可以明显看出区分四种缺失类型的最佳的序列比对得分糾直 为Q10,所以最终以序列比对得分Q10进行测序深度值分析。
[0128] (4)α&β_地贫插件建立:根据以上条件制作成分析α&β-地贫插件，对本发明检测方 法得到的测序数据进行分析。
[0129] 综上所述，根据实施例1所建立的检测方法可以实现对α&β-地贫基因型别同时检 测。
[0130] 实施例2: α&β-地贫基因突变型别的临床样本检测
[0131] 应用实施例1的方法对样本9、10、11、12、13、14、15和16进行检测，结果如下表所 示：
[0134]由突变信息表格和图 10、11、12、13、14、15、16 和 17 可知样本 9、10、11、12、13、14、15 和16的型别如下：
[0136] 结果显示，本发明对α&β-地贫突变型别的临床样本检测与原始型别一致。
[0137] 实施例3: α-地贫缺失型别的临床样本检测
[0138] 应用实施例1的方法对样本17、18、19、20、21、22、23和24进行检测。
[0139] 按照本发明提供的方法所建立的插件对样本17、18、19、20、21、22、23和24的进行 突变分析，突变频率均在〇~5%，所以样本17、18、19、20、21、22、23和24突变型别均为突变 阴性，由突变结果和图18、19、20、21、22、23、24和25可知样本17、18、19、20、21、22、23和24的 型别如下：
[0141] 结果显示，本发明对α-地贫缺失型别的临床样本检测与原始型别一致。
[0142] 实施例4: α&β-地贫复合型别的临床样本检测
[0143] 应用实施例1的方法对样本25、26、27、28、29、30、31和32进行检测，结果如下表所 示：
[0144]
[0145] 由突变信息表格和图 26、27、28、29、30、31、32和33可知样本25、26、27、28、29、30、 31和32的型别如下：
[0147]结果显示，本发明对α&β-地贫复合型别的临床样本的检测与原始型别一致。
【主权项】
1. 一种基于高通量测序技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于该方法基于Gap-PCR扩增和高通量测序技术，同时检测人类α-地中海贫血6种突变基因型和β-地中海贫血26 种突变基因型；即以人类基因组hgl9作为参考序列，通过序列比对得分QlO分析目标区域 chrl6:215000-236000每个基因位点的测序深度值，再根据不同位点的测序深度值分布，确 定α-地贫缺失基因型别；同时通过目标区域 chrl6: 215000-236000和chrll: 5246400-5248600进行序列比对，根据具体位点的碱基类型确定α和β-地贫突变基因型别。2. 根据权利要求1所述的检测方法，所述人类α-地中海贫血的6种突变基因型分别为:- aSEA、_a3· 7、_α4· 2、aGSa、JSc^paWS a 地中海贫血的 26 种突变基因型分别为：CD41_42(_ CTTT)、CD43(GAG>TAG)、CD40-41 (+T)、-32(C>A)、-30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、-28 (A>C)、CD7h72(+A)、CD7h73(+T)、CD17(AAG>TAG)、IVS-II-654(C>T)、CD26(GAG> AAG)、CD14-15(+G)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD37(TGG>TAG)、5' UTR Cap+1 (A>C)、5' UTR、 Cap+40-43(-AAAC)、Initiation codon、IVS-I-l(G>T)、IVS-I-5(G>C)、IVS-II-5(G>C)、 CD8和CD8/9〇3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在还在于主要包括以下5个步骤： (1) 分别设计α和β-地中海贫血突变基因型别的扩增引物对； (2) 提取样本全血基因组DNA; (3) 构建α-地贫和β-地贫突变型别的DNA文库后，进行模板制备和富集； (4) 上机测序； (5) 分析数据后分别确定α和β_地中海贫血基因型别。4. 根据权利要求3所述步骤，其特征在于步骤(1)中所述扩增引物对分别为： (1) 针对α-地中海贫血6种突变基因型别的特异性扩增引物对为： Sea-F:5，-GAGGGAAGGAGGGGAGAAGCTGAGT-3， Sea-R:5 '-AGCCCACGTTGTGTTCATGGC-3 ' 3·7-F:5 '-CCCCACATCCCCTCACCTACATTC-3 ' 3·7-R:5 '-GCATCCTCAAAGCACTCTAGGGTCC-3 ' 4.2-F:5 '-TGCTTTTGTGAGTGCTGTGTTGACC-3 ' 4·2-R:5，-GAAGTAGCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3， a2R:5 '-CGGGCAGGAGGAACGGCTAC-3 ' (2) 针对β-地中海贫血的26种突变型别的扩增引物对为： BF:5 '-CAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCT-3， BR:5 '-AAGGGCCTAGCTTGGACTCAGAATAATCC-3 '
【文档编号】C12Q1/68GK105886617SQ201610250952
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月16日
【发明人】李明, 吴英松, 杨学习, 杨旭, 范冬梅
【申请人】广州市达瑞生物技术股份有限公司