一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片及试剂盒。本申请的基因芯片，包括芯片基片和固定于芯片基片上的探针，探针包括分别与人乳头癌病毒61、70、72、81和83型的核苷酸杂交的特异性检测探针。本申请的高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片，能够对上述五种型别的人乳头癌病毒进行平行检测，并且，在本申请的优选方案中，将这五种HPV分型的特异性检测探针与之前设计的二十九种HPV分型检测探针组合在一张基因芯片上，使得基因芯片可以实现三十四种HPV分型的平行检测，进一步完善了现有的HPV分型检测体系，为HPV的分型检测提供了一种快速、灵敏、高通量的新的检测途径。
【专利说明】
-种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因巧片及试剂盒
技术领域
[0001] 本申请设及人乳头癌病毒检测领域，特别是设及一种高通量检测人乳头癌病毒分 型的基因忍片及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒化Uman化ppillomavi;rus，HPV)是一类感染人类皮肤粘膜上皮细胞 DNA的病毒，到目前为止已经发现了大约100多种HPV型，其中有40多种型别可感染人类的泌 尿生殖道。根据HPV基因组E6、E7和Ll区开放阅读框核巧酸顺序同源性不超过90%的定义， 一些型别根据上述区域同源性在90%-98%，而不超过98%还可进一步分为不同的亚型。
[0003] HPV可W引起人全身各部位的皮肤或者粘膜感染，导致多种上皮组织疾病，例如皮 肤寻常痛、扁平痛和外生殖器的尖锐湿痛等。宫颈上皮组织长期感染的某些型别的HPV可能 引起基因突变，导致感染部位发生癌变。没有HPV感染不可能导致宫颈癌，而有HPV感染不一 定会导致疾病和宫颈癌。因为HPV感染大多数是一过性感染，即在感染后短期内靠自身免疫 力恢复转归，不会导致疾病。只有少数转为持续性感染，也只有少数可能存在反复性的感 染。据统计，80%的女性一生有可能至少感染HPV-次。目前根据导致宫颈癌风险的高低将 运些HPV分为高危型HPV和低危型HPV，前者被认为具有引发妇女发生宫颈癌的型别，主要包 括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82 等。低危性 HPV 主要引起尖锐湿痛，包括 HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83 等。
[0004] 由于HPV目前还不能进行体外培养，免疫学的抗体检测缺乏可靠一致的结果，HPV 的检测主要依赖于细胞学和分子生物学的基因检测方法。目前基于PCR对多种型别HPV的检 测方法，主要是反向点杂交法，在一张较大的约几个厘米至十多厘米的膜条或其他基质上 附着HPV检测的DNA探针，运种方法无法做到对更多型别的多指标大样本量进行平行的高通 量的快检测。
[0005] 生物忍片(biochip或bioarray)是采用能够并行处理生物样本中的多个信息的微 处理单元形成的集合体，根据生物分子间特异相互作用的原理，将生物分子分析过程集成 于忍片表面，从而实现对DNA、RNA、多肤、蛋白质W及其他生物成分的高通量快速检测。狭义 的生物忍片概念是指通过不同方法将生物分子，如寡核巧酸、cDNA、genomic DNA、多肤、抗 体、抗原等，固着于娃片、玻璃片、玻璃珠、塑料片、塑料珠、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成 的生物分子点阵。基因忍片和DNA微阵列技术是生物忍片的一个种类，采用W阵列方式设定 在平面基质载体上，形成能够并行处理生物样本中多个基因信息的微处理单元，它具有微 型化和并行处理的特征，点阵排布点直径在500皿W内，相邻两个点的中屯、点间距在1000皿 W内。微阵列忍片体积小，点径为微米级别，可实现对更多型别、更多指标及大样本量进行 平行的高通量的快检测。
[0006] 目前针对高危型HPV和低危型HPV已经有多个试剂盒，其中已获得授权的 CN103409553A专利披露了检测29种高危型HPV和低危型册V的基因忍片和相关试剂。但是， 如前面提到，目前已经发现约100多种HPV型中可感染人类的泌尿生殖道有大约40多种型 另Ij;因此，仅针对29种高危型HPV和低危型HPV的检测试剂盒或试剂已经不能满足实际检测 和研究的需求。
【发明内容】
[0007] 本申请的目的是提供一种新的高通量检测人乳头癌病毒分型的基因忍片及试剂 盒。
[0008] 为了实现上述目的，本申请采用了 W下技术方案：
[0009] 本申请公开了一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因忍片，包括忍片基片，和 固定于忍片基片上的探针，探针包括分别与人乳头癌病毒61、70、72、81和83型的核巧酸杂 交的特异性检测探针，与人乳头癌病毒61型杂交的特异性检测探针为Seq ID No.1所示序 列和/或Seq ID No. 2所示序列，与人乳头癌病毒70型杂交的特异性检测探针为Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列，与人乳头癌病毒72型杂交的特异性检测探针为 Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列，与人乳头癌病毒81型杂交的特异性检 测探针为Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列，与人乳头癌病毒83型杂交的 特异性检测探针为Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列。
[0010] 需要说明的是，本申请针对CN103409553A专利中记载的29种高危型HPV和低危型 HPVW外的其它人乳头瘤病毒(缩写HPV)型别进行研究，特别设计了册￥61、70、72、81、83(即 MM7)等五种型别人乳头瘤病毒的特异性杂交探针，并研制出了针对运五种型别的高通量检 测基因忍片。可W理解，本申请的五种型别的探针彼此之间W及与CN103409553A专利所述 29种高危型HPV和低危型HPV不会有交叉反应，并且具有很好的一致性，因此可W制备到一 张基因忍片上，实现人乳头瘤病毒=十四种型别的高通量检测；同样的，根据不同的需要， 运些探针也可W分开使用，例如针对某个型别或某几个型别的基因忍片上，可W只采用些 探针中的某条或某几条，运都属于本申请的保护范围，在此不做具体限定。
[0011] 还需要说明的是，本申请在经过设计和筛选，HPV61、70、72、81、83 (MM7)每个型别 获得了两条特异性检测探针，例如HPV61型Seq ID No. 1所示序列的探针和Seq ID No.2所 示序列的探针都可W用于其特异性检测，因此，在使用时，本申请的基因忍片中可W单独使 用Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.2所示序列的特异性检测探针，也可W同时使用两条 探针，W保障HPV61型别检测的准确性。HPV70型可W同时使用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No.4所示序列的特异性检测探针，也可W单独使用其中一条。HPV 72型可W同时使用 Seq ID No.5所示序列和Seq ID No.6所示序列的特异性检测探针，也可W单独使用其中一 条。HPV 81型可W同时使用Seq ID No.7所示序列和Seq ID No.8所示序列的特异性检测探 针，也可W单独使用其中一条。HPV83型可W同时使用Seq ID No.9所示序列和Seq ID No. 10所示序列的特异性检测探针，也可W单独使用其中一条。在此不做具体限定。
[0012] 优选的，探针还包括阳性质控探针、阴性质控探针和PCR内对照探针；阳性质控探 针为Seq ID No.11所示序列，阴性质控探针为Seq ID No.12所示序列，PCR内对照探针为 Seq ID No. 13所示序列。
[001引优选的，述忍片基片分为册V检测区、阳性质控区、阴性质控区、PCR内对照区和定 位区;HPV检测区固定有样品检测的人乳头瘤病毒特异性检测探针，阳性质控区含有至少S 个并排重复的阳性质控探针的检测点，定位区含有至少=个并排重复的定位显色点，阴性 质控区含有至少S个并排重复的阴性质控探针的检测点，PCR内对照区含有至少S个并排 重复的PCR内对照探针的检测点。其中，阳性质控探针(缩写PC)和杂交质控品为互补的核巧 酉《序列，选自Arabidopsis thaliana homeobox-leucine zipper protein HATlmRNA基因。
[0014] 需要说明的是，本申请的基因忍片采用特殊的微阵列结构设计，将=个重复的定 位点设计在一个定位区里面，与CN103409553A专利的在忍片基片的右上角、右下角和左上 角分别设置一个定位点的结构相比，本申请的设计结构更为合理。本申请的基因忍片对一 个指标提供3次重复检测，提高了准确性;增加质控点，包括阳性质控和阴性质控，如果阳性 质控检测结果为阴性，可W判断杂交阴性检测结果无效，避免假阴性产生;如果阴性质控检 测结果为阳性，可W判断杂交阳性检测结果无效，可W避免假阳性产生。
[0015] 本申请的另一面公开了一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因忍片，包括忍片 基片，和固定于忍片基片上的检测探针，检测探针包括分别与34种型别的人乳头癌病毒核 巧酸杂交的型特异性杂交检测探针，其中，型特异性杂交检测探针为Seq ID No.1所示序列 和/或Seq ID No. 2所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No. 3所示序列和/或Seq ID No.4 所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特异性 杂交探针、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特异性杂交探针，W及Seq ID No. 14所示序 列至Seq ID No.42所示序列的特异性杂交探针。
[0016] 需要说明的是，本申请是在发明人之前研究的高通量分型检测人乳头瘤病毒基因 忍片的基础上深入研究而成的，之前研究的高通量分型检测人乳头瘤病毒基因忍片详细记 载于CN103409553A专利中，其中记载了人乳头癌病毒化PV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82)共计二十九个型别的 人乳头癌病毒分型检测所需的二十九条特异性杂交探针和内对照探针，即本申请的Seq ID No. 14所示序列至Seq ID No.42所示序列的特异性杂交探针和本申请的内对照探针Seq ID 13。因此，在本申请的一种方案中，除了可W将此次研究的五种分型单独制成基因忍片W 夕h还将此次研究的五种分型的特异性杂交探针和之前研究的二十九条特异性杂交探针一 起整合到一张基因忍片上，从而可W实现人乳头瘤病毒=十四种分型的同时检测，真正实 现了人乳头瘤病毒的高通量分型检测。
[0017] 同样的，在检测；十四种分型的基因忍片中，也包含有阳性质控探针、阴性质控探 针和PCR内对照探针等。
[0018] 本申请的另一面公开了一种用于高通量分型检测人乳头癌病毒的试剂盒，该试剂 盒中包含有本申请的基因忍片。
[0019] 可W理解，本申请的基因忍片可W是新研究的五种型别的人乳头癌病毒分型检测 的基因忍片，也可W是包含之前的二十九种型别的可分型检测=十四种人乳头癌病毒的基 因忍片。
[0020] 同样的，试剂盒中还包含有对各人乳头癌病毒分型的DNA进行PCR扩增的引物。
[0021] 需要说明的是，引物的作用是对各HPV分型的核巧酸进行扩增，W实现信号放大， 方便后续的基因忍片杂交检测。可W理解，凡是能够对各HPV分型进行PCR扩增，且扩增片段 包含本申请的特异性检测探针的引物都可W用于本申请。本申请的优选方案中，所有引物 都引用自CN103409553A专利。
[0022] 同样的，试剂盒中还包含有人乳头癌病毒DNA提取试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂和 显色试剂。可W理解，为了方便使用，可W在本申请的试剂盒中配置基因忍片整个过程相关 的试剂，运些相关试剂同样引用自CN103409553A专利。
[0023] 优选的，试剂盒中还包含阳性对照品、阴性对照品和杂交质控品；阳性对照品和阴 性对照品均含有人基因组DNA，杂交质控品为5'-Biotin标记的人工合成核巧酸片段，杂交 质控品为Seq ID No.54所示序列。
[0024] 本申请的另一面公开了一种用于高通量检测人乳头癌病毒分型的探针，探针包括 分别与34种型别的人乳头癌病毒核巧酸杂交的特异性杂交探针，探针包括Seq ID No. 1所 示序列和/或Seq ID No.2所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特 异性杂交探针、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特异性杂交探针，W及Seq ID No. 14所示 序列至Seq ID No.42所示序列的特异性杂交探针。
[0025] 需要说明的是，第一，本申请的探针可W对S十四种HPV型别进行高通量检测，可 W作为整体一起使用，也可W单独使用。第二，本申请的探针虽然是针对基因忍片而设计 的，但是，可W理解，由于其特异性W及彼此之间的一致性，其它的如斑点杂交、液相忍片等 技术同样可W使用本申请的探针，只是针对不同的技术在探针的末端分别进行相应的标记 或修饰而已，在此不做具体限定。
[0026] 本申请的再一面公开了一种用于高通量检测人乳头癌病毒分型的试剂盒，该试剂 盒中含有本申请的探针，W及对各人乳头癌病毒分型的DNA进行PCR扩增的引物。
[0027] 可W理解，本申请的基因忍片可W单独存在于试剂盒中使用，而本申请针对基因 忍片设计的探针，由于其特异性和各探针的一致性，同样可W单独存在于试剂盒中，例如斑 点杂交就可W直接采用本申请的探针进行，在此不做具体限定。
[0028] 由于采用W上技术方案，本申请的有益效果在于：
[0029] 本申请的高通量检测人乳头癌病毒分型的基因忍片，能够对册V61、70、72、81、83 (MM7)五种人乳头瘤病毒进行平行的分型检测，进一步完善了现有的HPV分型检测体系。并 且，在本申请的优选方案中，将运五种HPV分型的特异性检测探针与之前设计的二十九种 HPV分型检测探针组合在一张基因忍片上，使得基因忍片可W实现S十四种HPV分型的平行 检测，为HPV的分型检测提供了一种快速、灵敏、高通量的新的检测途径。
【附图说明】
[0030] 图1是本申请实施例中忍片基片的质控结构示意图；
[0031] 图2是本申请实施例中的一种检测S十四种HPV型别的微阵列结构示意图；
[0032] 图3是本申请实施例中忍片的点样流程图；
[0033] 图4是本申请实施例中试剂盒阴性对照品的显色模式图；
[0034] 图5是本申请实施例中试剂盒阴性对照品对照的实际检测结果图；
[0035] 图6是本申请实施例中阳性对照品的显色模式图；
[0036] 图7是本申请实施例中阳性对照品的实际检测结果图；
[0037] 图8是本申请实施例中样品中含有HPV33和HPV44两个混合型的结果图；
[0038] 图9是本申请实施例中样品中含有HPV16和HPV35两个混合型的结果图。
【具体实施方式】
[0039] 本申请的目的在于结合核酸扩增、DNA分子杂交和基因忍片技术形成一种高通量 检测多种HPV型别的基因忍片和试剂盒。通过设计特异性核酸探针，将各探针点样在很小面 积的平面载体上形成基因忍片微阵列;运用DNA分子杂交和信号放大技术，将PCR扩增产物 与探针在基因忍片上杂交，然后通过显色和基因忍片阅读分析仪检测忍片给出的信号，可 W检测多种HPV型，包括个别型的亚型，达到快速、灵敏和高通量的检测效果。本申请的一种 实现方式中，将基因忍片至于微孔板装置的孔内进行分子杂交，利用96孔微孔板做96个微 孔反应池，每个孔放入一个微阵列忍片，每个孔单独进行显色信号放大，然后通过显色和基 因忍片阅读分析仪检测忍片给出的信号;实现大批量样品的平行检测。
[0040] 本申请提供了用于检查人乳头瘤病毒五种型别和个别亚型的基因忍片，针对人乳 头瘤病毒，针对不同的HPV型别设计特异性的探针，在特定杂交条件下和在微型化的基因忍 片阵列上进行DNA分子杂交;补充并进一步完善了现有的HPV分型检测体系，为HPV分型的深 入研究奠定了基础。
[0041] 在本申请的实施例中，将本申请设计的10条特异性检测探针，任意选择其中5条与
【申请人】之前的专利CN103409553A中的29条HPV分型特异性检测探针一起整合到一张基因忍 片中使用。可W理解，运34条探针可W-起整合到一张基因忍片上，在特殊的使用需求中， 也可W单独将本申请设计的10条特异性检测探针或者其中部分单独制成基因忍片，基因忍 片的制备和检测方法与本申请实施例相同。
[0042] 本申请是在专利CN103409553A基础上进一步研究而提出的，因此专利 CN103409553A的全部内容引用至本申请中，包括其具体的试验材料和试验方法等。
[0043] 可W理解，本申请实际上就是另外设计了五种HPV型别的特异性检测探针，并且， 在本申请的实施例中，将运五种探针加入到了专利CN103409553A的基因忍片中，所不同的 是，本申请另外对基因忍片的结构进行了改进，其余例如DNA样品提取、基因忍片制备、PCR 反应、杂交、信号检测和分析、试剂盒等都可W参考专利CN103409553A。包括W下实施例中 省略记载的部分内容都参见专利CN103409553A。
[0044] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。W下实施例仅对本申请 进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0045] 实施例一基因忍片及其制备
[0046] 1、材料
[0047] 1.1主要试剂和仪器
[004引试剂:忍片基片、特异性杂交探针、引物、DNA提取试剂盒、忍片点样试剂、PCR扩增 试剂、忍片杂交试剂等。
[0049]仪器:移液器、PCR仪、Heath Digit2003生物忍片点样仪、基因忍片阅读分析仪、无 菌工作台、恒溫箱等。
[(K)加]1.2样品采集及其DNA提取
[0051]采用棉签试子或专用毛刷刮取宫颈脱落细胞样本，或者直接采用宫颈组织切片， 采用煮沸裂解法提取DNA，备用。本例分别提取了 HPV61、70、72、81和83 (MM7)五个分型的DNA 作为测试对象。并提取了专利申请号为201310041615.4的专利申请中记载的29种高危型 HPV 和低危型 HPV 的 DNA，分别为 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、 40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、82。同时，提取了人基因组0魁作为对照。内对照 采用人珠蛋白基因的Ll片段重组质粒DNA，阴性对照为提取的未感染人乳头癌病毒的人全 基因组DNA。
[0化2] 1.3引物和探针设计
[0化3] 本例册V61、70、72、81和83(MM7)五个分型的基因组L1区的引物，W及人珠蛋白基 因引物都参考专利CN10：3409553A，HPV正向引物有四条，分别为Seq ID No.43、Seq ID No.44、Seq ID No.45、Seq ID No.46所示序列，HPV反向引物有五条分别为Seq ID No.47、 569 10齡.48、569 10齡.49、569 10齡.50、569 10齡.51所示序列，产生的？0?产物根据 各个型别的基因组序列，在164-173bp之间。人珠蛋白基因引物皿正向引物和皿反向引物分 别为Seq ID No.52和Seq ID No.53所示序列，详见表1。
[0054] 本例的五个分型由于是在专利CN103409553A的基础上继续研究的，因此，沿用了 HPV基因组DNA的Ll区域保守区，针对该区域设计10条探针，每个分型各两条探针，而引物则 沿用专利CN103409553A的PCR扩增引物。同样的，在所有反向引物的5'末端分别进行生物素 标记，探针的5 '端带有氨基修饰。
[0化日]HPV61的两条探针分别为Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列，HPV70的 两条探针分别为Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列，HPV72的两条探针分别为 Seq ID No.5所示序列和Seq ID No.6所示序列，HPV81的两条探针分别为Seq ID No.7所示 序列和Seq ID No. 8所示序列，HPV83的两条探针分别为Seq ID No. 9所示序列和Seq ID No. 10所示序列。
[0化6] 同时，合成了专利CN103409553A中记载的29种高危型HPV和低危型HPV的特异性检 测探针。具体的，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、 53、54、55、57、66、67、69、73、82共计二十九个分型的探针依序分别为SeqIDNo.l4所示序 列至Seq ID No.42所示序列。
[0化7] 此外，本例还合成了PCR内对照探针皿probe、阴性质控探针NC probe和阳性质控 探针PC probe,PC probe为Seq ID No. 11 所示序列，NCprobe为Seq ID No. 12所示序列，皿 probe为Seq ID No. 13所示序列。
[0化引化值的计算使用Primer Express 3.0软件，设计各探针的化值在55°C左右。
[0059] 表1引物及探针
[00621
[0063] 2、试验方法
[0064] 2.1基因忍片制备 [00化]2.1.1微阵列设计
[0066] 本例的忍片基片结构图1所示，忍片基片分为HPV检测区1、阳性质控区2、阴性质控 区3、PCR内对照区4和定位区5。人乳头瘤病毒特异性检测探针固定于HPV检测区1，阳性质控 区2含有至少S个重复的阳性质控探针PC probe的检测点，定位区5含有至少S个重复的定 位点GP5,阴性质控探针NC probe固定于阴性质控区3，PCR内对照探针皿probe固定于PCR 内对照区4。每个样品重复=个检测点。在本例的一种实现方式中，在阴性质控区3并排设置 若干个VE-空白质控。本例的VE-空白质控是直接点不含探针的点样缓冲液，点样缓冲液与 含探针的点样缓冲液组分相同。
[0067] 本例的具体样品排列矩阵采用34样品（即34种HPV型别）阵列，如图2所示，34种HPV 型别是专利CN103409553A中记载的29种高危型HPV和低危型HPV，加本例设计的5个型别的 HPV探针，共计34种人乳头瘤病型别探针的样品阵列。34种人乳头瘤病具体包括HPV 16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、26、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、69、73、 82，^及册￥61、70、72、81、83(匪7)。矩阵：（3义4)^0，行距:400皿，不同探针点间距:400^ m，S连点间距:400皿，点样误差:<200皿，点直径：150皿。忍片宽度为:6400皿。基因忍片右 上角有3个重复点的阳性质控点PC与右下角的3个重复点的定位点GP5为合格忍片必须显色 点。VE-空白质控及阴性质控点NC为合格忍片不显色点。PCR内对照皿为判断核酸扩增PCR是 否正常的显色点。
[006引 2.1.2点样
[0069]按照图2的设计，点样制备％样品阵列基因忍片，忍片的点样流程如图3所示，将 Pall Biodyne C膜剪裁为适当大小，用抓C进行前处理后，用O. IM的憐酸缓冲液(pH7.4)分 别配制569 10齡.1、569 10齡.3、569 10齡.5、569 10齡.7、569 10齡.9所示序列的探 针点样液，W及专利CN103409553A中记载的29种高危型HPV和低危型HPV的29条探针的点样 液，探针浓度在〇.2iiM-5iiM，使用化ath Digit2003生物忍片点样仪将探针按照图2的阵列和 要求进行喷点，点样液使用黄色染料来跟踪判断忍片矩阵每个探针点是否完整，没有漏点。
[0070] 2.2PCR 扩增
[0071] 本例的PCR反应体系为，HPVPCR反应液27.6化、Taq/UNG混合液0.化UDNA样品化L。 HPVPCR反应液中含有1冲CR Buffer、0.2測HPV正向引物、0.4測HPV反向引物。其中，HPV正 向引物即Seq ID No.43至Seq ID No.46所示序列的引物，HPV反向引物即Seq ID No.47至 Seq ID No.51所示序列的引物。
[0072] PCR反应条件为，5〇1：2111111、95°(：1〇111111，然后进入40个循环：951：3〇3日。、521： 45sec、65°C30sec，循环完成后 65°C5min。
[0073] 2.3基因忍片检测
[0074] 2.3.1基因忍片杂交
[0075] 使用前将杂交质控品加入变性液中，与变性液按1:30的稀释配制。杂交质控品是 与阳性质控探针互补的5'-Biotin标记人工合成DNA片段，杂交质控品DNA片段为Seq ID No.54所示序列，可与阳性质控探针特异性杂交结合，并在其后的显色步骤中显色。取PCR产 物加入30化含杂交质控品的碱变性液中，进行碱变性，变性时间为10分钟;变性结束后加入 100化杂交中和液，杂交中和液为含6 X SSC、0.02M PB缓冲液、0.5 % BSA和0.5 % SDS的溶液； 杂交反应在55 °C进行30分钟。
[0076] 2.3.2酶标反应和信号检测
[0077] 本例采用的信号放大的方法包括（1)辣根过氧化物酶标记的亲和素介导的酶底物 放大反应，作为酶底物的可W是TMB或POD; (2) W及由辣根过氧化物酶标记的亲和素介导的 化学发光信号放大系统，发光底物为鲁米诺化uminol); (3)还包括碱性憐酸酶标记的亲和 素介导的底物放大反应，所采用的底物为4-MUP或pNPP底物。具体内容参见专利 CN10：M09553A。
[0078] 3、结果分析
[0079] 检查确认忍片孔内基因忍片均为正位，用HPV分型基因忍片检测阅读系统对基因 忍片检测并分析。本实施例的W3个点的信号同时判断检测结果，如果有一个点信号超限 (outlier),则舍弃该点，取另外2个点的平均值，如果S个点的信号没有一个超限值，则取3 个点的信号平均值。
[0080] 检测结果中，阳性质控区2即PC点应显色，PCR内对照区4即皿点应显色，定位区5即 GP5点应显色，阴性质控区3即NC点应不显色，VE-空白质控点应不显色。训月性对照品进行 检测，本例中，阴性对照品含有人基因组DNA，不含有任何型别的人乳头癌病毒DNA，因此，除 PC、皿、GP5显色W外，其它都不应显色，如图4所示，图4是试剂盒阴性对照品检测的模拟图； 检测结果如图5所示，图5是试剂盒阴性对照品实际检测的结果图，可见，图5所示的实际检 测结果与预期的模拟图4相符。W阳性对照品进行检测，本例中，阳性对照品含有HPV16型别 人乳头癌病毒DNA和人基因组DNA，因此除PC、皿、GP5和HPV16显色W外，其它都不应显色，如 图6所示，图6是试剂盒阳性对照品检测的模拟图;检测结果如图7所示，图7是试剂盒阳性对 照品实际检测的结果图，可见，图7所示的实际检测结果与预期的模拟图6相符。如果检测结 果不符合上述质控要求，则该次检测结果无效。
[0081 ] 检测结果INS的参考值为11.0。参考值的确定方法：统计HPV阴性标本的检测INS 值，按平均值+3倍标准差确定参考值。HPV分型基因忍片检测阅读系统可自动检测INS值，并 分析和报告结果，报告结果如下：
[0082] 1)INS<11.0:HPV 阴性；
[0083] 2)INS> 11.0:HPV 阳性
[0084] 并报告HPV型别，即本例的34种分型的检测结果。
[0085] 检测结果显示，各个HPV分型DNA对应的特异性检测探针有信号反应，而其它探针 则没有信号反应，可见34条探针没有交叉反应，并且具有良好的特异性。
[00化]此外，本例对HPV分型61、70、72、81、83(匪7)的另外五条探针也进行了相应的检 ，结果显示，本例的10条探针都能够很好的用于HPV分型检测，具有良好的特异性，并且与 其他探针没有交叉反应。
[0087] 本例按照图2的微阵列结构点样后，另外，对多个分型的检测进行了试验，例如将 多个样品混合后一起进行忍片杂交检测。部分检测结果如图8和图9所示，图8为HPV 33和 HPV44两个混合型别样品的检测结果图，可见，在相应的位置处都有明显的显色。图9为 HPV16和HPV35两个混合型别样品的检测结果图，同样的，在忍片点样的16和35处可W看到 明显的显色。
[0088] 实施例二人乳头癌病毒分型检测试剂盒
[0089] 【产品名称】通用名:人乳头瘤病毒分型检测试剂盒基因忍片法
[0090] 【包装规格】48测试/盒
[0091] 【检验原理】
[0092] 本试剂盒采用基因忍片检测技术。利用微量点样技术，将HPV分型特异性检测探针 点样于基因忍片基片上，制成基因忍片;经过对样本中的DNA进行PCR扩增、杂交和显色，通 过HPV分型基因忍片检测阅读系统自动采集图像并分析和报告检测结果。试剂盒所采用的 基因忍片为实施例一所制备的34样品阵列基因忍片。试剂盒的主要成份和检测过程举例如 下：
[0093] 【主要组成成份】
[0094] 本试剂盒由A盒和B盒组成，如表2所示;A盒包括5种PCR相关组份，B盒包括9种杂交 显色相关组份。在有效期内不同批号试剂盒中各组份可W互换。HPV的PCR反应液中包含四 条HPV正向引物，即Seq ID No.43至Seq ID No.46所示序列，五条册V反向引物，即Seq ID No.47至Seq ID No.51所示序列。正向引物和反向引物的比例为1:2(0.2測:0.4山〇为最佳， 能提高5'-Biotin标记PCR产物的比率。利用简并引物的原理，适当降低复性溫度至52°C，使 所有34个型别HPV都能够产生PCR产物，从而能够被实施例一所制备的基因忍片检测。A盒还 包含杂交质控品，为与阳性质控探针互补的人工合成DNA片段，可与阳性质控探针特异性结 合，并显色。
[00M]表2试剂盒主要组成成份
[0096]
[0097]
[0098] 【储存条件及有效期】
[0099] 1.储存条件
[0100] A 盒-20°C 保存，B盒 2-8°C 保存。
[0101] A盒组份应避免反复冻融，B盒内的显色液B应避光保存。
[0102] 2.有效期
[0103] 未开封产品有效期为12个月。
[0104] 已开封产品建议1个月内用完。
[0105] 【适用仪器】
[0106] 普通PCR扩增仪，HPV分型基因忍片检测阅读系统。
[0107] 【样本要求】
[0108] 标本类型生殖道脱落细胞，如宫颈口、尿道口等部位脱落细胞。
[0109] 将采样棉拭子或宫颈刷浸入盛有ImL无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗。将棉拭 子或宫颈刷贴壁挤干后丢弃，立即送检。
[0110] 标本保存采集的标本应尽快送检，建议标本4 °C保存不超过24小时，-20°c保存不 超过6个月，需要长期保存的标本应置于-70°C保存，避免多次冻融。
[0111] 已经提取好的样本DNA，可直接进入如下2.1的步骤进行PCR扩增。
[0112] 【检验方法】
[0113] 1.样本处理
[0114] 1.1标本预处理
[0115] 取出待处理标本，振荡混匀；置离屯、机中W13 0(K)rpm离屯、5分钟；弃上清，保留沉 淀物。-20°C保存的标本，应置室溫自然解冻后再使用。
[0116] 1.2DNA 提取
[0117] 1.2.1准备2个离屯、管，分别加入阴性对照和阳性对照各化1。
[011引 1.2.2分别向上述对照品管及1.1项标本管加入SOiil HPV DNA提取液，振荡混匀； 然后沸水浴或干浴10分钟。
[0119] 1.2.3将上述样本管置离屯、机中，13 OOOrpm离屯、10分钟，保留上清液(DNA样品）， 备用。
[0120] 1.3DNA样品保存
[0121] 建议DNA样品立即用于PCR检测，否则4°C保存；当天不检测的样品，-20°C保存。
[0122] 2. PCR 扩增
[0123] 2. IPCR反应混合液配制
[0124] 根据待检测总样本数，包括对照品和临床标本，表3，配制PCR反应混合液。
[0125] 实际计算用量时应计入损耗量。
[01%]将PCR反应混合液混匀并短暂离屯、后，按每管2祉1分装至各PCR反应管中。
[0127]表3 PCR反应混合液配制 「rnool LOl 29 J 2.2 加巧
[0130] 取化1待测DNA样品分别加至上述PCR反应管中。盖紧管盖，混匀并短暂离屯、，立即 用于检测。-20°C保存的DNA样品，应在用前取出，置室溫自然解冻并混匀后，13 O(K)巧m离屯、 1分钟，取上清用于检测。
[0131] 2.3PCR 扩增
[0132] 将待检测反应管小屯、置于PCR扩增仪中，按表4要求设置PCR扩增参数。
[0133] 表4 PCR扩增参数设置
[0134]
[0135] 3. DNA杂交
[0136] 3.1准备
[0137] 3.1.1准备试剂
[013引将杂交中和液及洗液B置55 °C预热。
[0139] 3.1.2准备湿盒
[0140]建议制作方法：用适当大小，不小于20cm X 15cm X IOcm,的带盖塑料盒，内置吸水 纸，加水浸湿，W无流动水为宜，55°C预热。
[0141] 注意:在基因忍片的溫育操作中必须用湿盒保湿，切忌湿盒干燥。
[0142] 3.1.3基因忍片定位
[0143] 小屯、转移基因忍片至96孔板内，按正位摆放在忍片孔内。正位指忍片水平放置、定 位点正对孔内左下角。忍片孔指已定位忍片的孔位。转移忍片时应避免器械接触忍片中屯、 区及污损忍片。
[0144] 3.2预杂交
[0145] 向各忍片孔中加入10化L洗液B，55 °C溫育15分钟;吸干孔内液体。
[0146] 3.3 变性
[0147] 使用前将杂交质控品加入变性液中，杂交质控品与变性液按1:30的比例稀释配 审Ij。取30iiL含有杂交质控品的变性液加至PCR产物管中，轻微摇动混匀，静置10分钟。
[014引 3.4中和与杂交
[0149] 向各忍片孔中分别加入10化L杂交中和液和变性的PCR产物，约60化，轻微摇动混 匀。55 °C溫育30分钟，吸干孔内液体。
[0150] 3.5 清洗
[0151] 向各忍片孔中加入15化L洗液B，轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体;重复2次。
[0152] 注意:应使忍片孔内溫度不低于20°C，否则影响清洗效果。
[0153] 4.显色
[0154] 4.1准备试剂
[0155] 4.1.1将洗液A和显色液B置37 °C预热。
[0156] 4.1.2配制酶标工作液
[0157] 按表5要求，用洗液A将酶标原液稀释为酶标工作液，配制方法见表5。
[0158] 实际计算用量时应计入损耗量。
[0159] 表5配制酶标工作液
[0160]
[0161]
[0162] 4.2 酶标
[01创取100化酶标工作液，加至3.5项的忍片孔内，37 °C溫育30分钟;吸干孔内液体。
[0164] 4.3 清洗
[0165] 加入15化L洗液A，轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体;重复1次。加入15化L洗液C， 轻微摇动漂洗3分钟，吸干孔内液体。
[0166] 应使忍片孔内溫度不低于20°C，否则影响清洗效果。
[0167] 4.4 显色
[0168] 分别加入50化显色液A和50化显色液B，轻微摇动混匀，室溫显色5分钟。吸干孔内 液体，加入15化L洗液C，静置约1分钟，吸干孔内液体。
[0169] 4.5 风干
[0170] 45 °C风干。注意:请确认风干后检测。
[0171] 5.检测与分析
[0172] 检查确认忍片孔内基因忍片均为正位，用HPV分型基因忍片检测阅读系统对基因 忍片检测并分析。
[0173] 【参考值】
[0174] 检测结果(INS)的参考值为11.0。
[0175] 参考值的确定方法:统计HPV阴性标本的检测INS值，按平均值+3倍标准差确定参 考值。
[0176] 【检验结果的解释】
[0177] 1.质量控制
[017引1.1基因忍片点阵说明
[0179] 基因忍片的探针点阵共包括117个点。点阵模式图见图2,基因忍片点阵说明见表 6。
[0180] 表6基因忍片点阵说明 [01811
「01821
[0183] 1.2质控品检测结果
[0184] 1)试剂盒阴性对照品检测结果应为HPV阴性并且3个皿点阳性，3个PC点显色，3个 GP5点显色；
[0185] 2)试剂盒阳性对照品结果应为册V16型阳性并且3个皿点阳性，3个PC点显色，3个 GP5点显色；
[0186] 如果检测结果不符合上述要求，则本次检测结果无效。
[0187] 1.3质控品异常分析及处理
[0188] 1)3个阳性质控点（PC)中一个或多个缺失或者不显色，检测结果无效，应重新检 测。
[0189] 2)标本的检测结果中，如果3个PC点和3个定位点正常而皿点和所有HPV检测点均 为阴性，表明样本中可能含有PCR抑制成分，应将原DNA样品适当稀释后再检测。
[0190] 3)如试剂盒阴性对照品或阳性对照品的检测结果不符合1.2的质控要求，应检查 操作或试剂是否正常。
[0191] 2.结果判断
[0192] HPV分型基因忍片检测阅读系统可自动检测INS值，并分析和报告结果，报告结果
[0193] 如下；
[0194] 1)INS<11.0:HPV 阴性；
[0195] 2)INSM1.0:HPV 阳性，并报告 HPV 型别。
[0196] W上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申 请的具体实施只局限于运些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本申请构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护 范围。
【主权项】
1. 一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片，其特征在于:包括芯片基片，和固定 于芯片基片上的探针，所述探针包括分别与人乳头癌病毒61、70、72、81和83型的核苷酸杂 交的特异性检测探针，与人乳头癌病毒61型杂交的特异性检测探针为Seq ID No.1所示序 列和/或Seq ID No. 2所示序列，与人乳头癌病毒70型杂交的特异性检测探针为Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列，与人乳头癌病毒72型杂交的特异性检测探针为 Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列，与人乳头癌病毒81型杂交的特异性检 测探针为Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列，与人乳头癌病毒83型杂交的 特异性检测探针为Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列。2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于:所述探针还包括阳性质控探针、阴性 质控探针和PCR内对照探针;所述阳性质控探针为Seq ID No.11所示序列，所述阴性质控探 针为Seq ID No. 12所示序列，所述PCR内对照探针为Seq ID No. 13所示序列。3. 根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于：所述芯片基片分为HPV检测区（1 )、阳 性质控区（2)、阴性质控区⑶、PCR内对照区⑷和定位区（5);所述HPV检测区（1)固定有用 于样品检测的人乳头瘤病毒特异性检测探针，所述阳性质控区（2)含有至少三个并排重复 的阳性质控探针的检测点，所述定位区（5)含有至少三个并排重复的定位点，所述阴性质控 区（3)含有至少三个并排重复的阴性质控探针的检测点，所述PCR内对照区（4)含有至少三 个并排重复的PCR内对照探针的检测点。4. 一种高通量检测人乳头癌病毒分型的基因芯片，其特征在于:包括芯片基片，和固定 于芯片基片上的检测探针，所述检测探针包括分别与34种型别的人乳头癌病毒核苷酸杂交 的型特异性杂交检测探针，所述型特异性杂交检测探针为Seq ID No. 1所示序列和/或Seq ID No.2所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的 特异性杂交探针、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特异性杂交探针、 Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.9所示序 列和/或Seq ID No. 10所示序列的特异性杂交探针，以及Seq ID No. 14所示序列至Seq ID No. 42所示序列的特异性杂交探针。5. 根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于:所述探针还包括阳性质控探针、阴性 质控探针和PCR内对照探针;所述阳性质控探针为Seq ID No.11所示序列，所述阴性质控探 针为Seq ID No. 12所示序列，所述PCR内对照探针为Seq ID No. 13所示序列。6. -种用于高通量检测人乳头癌病毒分型的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中包含 有权利要求1-5任一项所述的基因芯片。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含有人乳头癌病毒 DNA提取试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂和显色试剂。8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还包含阳性对照品和阴性 对照品，以及杂交质控品，所述阳性对照品和阴性对照品均含有人基因组DNA，所述杂交质 控品为5'-Biotin标记的人工合成核苷酸片段，所述杂交质控品为Seq ID No.54所示序列。9. 一种用于高通量检测人乳头癌病毒分型的探针，其特征在于:所述探针包括分别与 34种型别的人乳头癌病毒核苷酸杂交的特异性杂交探针，所述探针包括Seq ID No.1所示 序列和/或Seq ID No.2所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.3所示序列和/或Seq ID No.4所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.5所示序列和/或Seq ID No.6所示序列的特 异性杂交探针、Seq ID No.7所示序列和/或Seq ID No.8所示序列的特异性杂交探针、Seq ID No.9所示序列和/或Seq ID No. 10所示序列的特异性杂交探针，以及Seq ID No. 14所示 序列至Seq ID No.42所示序列的特异性杂交探针。10. -种用于高通量检测人乳头癌病毒分型的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有 权利要求9所述的探针。
【文档编号】C12N15/11GK105861750SQ201610309281
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】黄明辉, 黄鹤, 李勐, 赵雷
【申请人】港龙生物技术（深圳）有限公司