一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法
【专利摘要】一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法，该方法采用“巢式PCR”的方法对以16S rDNA进行富集扩增，最大限度减少了宿主和食物残渣基因组污染，同时将V3和V6组合，进行特异扩增并进行大规模并行测序，获得菌群的靶标基因序列库。利用该文库，能够将菌群鉴定从属(Genus)级别，提升至种(Species)级别。本发明的方法可以最大限度避免宿主细胞核酸干扰，完全且高效检测全部细菌种类16S rDNA标签序列，从而准确确定肠道菌群生态结构。
【专利说明】
一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法技术领域，特别是涉及一 种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来肠道微生物与饮食和健康的关系被越来越多的阐释，在很大程度上得益于 肠道微生物研究技术的快速发展。肠道微生物的研究大体经历了培养依赖的方法，非培养 依赖的传统分子生物学方法，基于测序的高通量组学方法3个阶段。
[0003] 通过比较3个阶段研究方法的特点与应用，人们可以发现培养依赖的方法在鉴定 菌种的同时即可获得相应菌株，方便后续研究，但培养法本身费时费力，肠道微生物以厌氧 菌和兼性厌氧菌为主，培养起来更加困难，并且在培养的过程中菌种比例会发生改变，使得 其应用存在瓶颈。非培养依赖的传统分子生物学方法可以不经培养直接从样品中提取肠道 微生物基因组，利用分子生物学手段进行分离、鉴定和定量，使其结果可以比较准确的反应 肠道微生物中高丰度菌种的组成和真实比例。
[0004] 期刊Journal of Clinical Microbiology的第1122-1124页中，Kevin Jeng公开 了沙门氏菌的快速检测，题目为Application of a 16S rRNA PCR-High-Resolution Melt Analysis Assay for Rapid Detection of Salmonella Bacteremia。该发明通过针对沙 门氏菌反应性血清型肠炎菌血症患者进行分析，以确定其感染情况。
[0005] 但是传统分子生物学方法存在着通量低的缺陷，靶向方法如实时定量PCR每次只 能研究一种或一类肠道微生物，而非靶向方法如最常用的梯度变形凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)受限于灵敏度，往往只能研究肠道中高丰度的微生 物。肠道微生物群落组成复杂，每种细菌都与其他细菌形成复杂的相互关系网络，低丰度的 菌种同样扮演者重要的角色，所以传统分子生物学研究结果往往具有片面性。
[0006] 16SrDNA因其序列在物种间的高度多样性，成为细菌分类学研究的"分子钟"，具9 个可变区和9个保守区间隔排列的特征，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育 密切相关。因此通过分析可变区的序列即可得到各细菌的分类学特征。
[0007] 传统分子生物学方法中有时也应用Sanger法对单一菌种的16SrDNA进行测序和鉴 定，但受限于通量低，效率低，不能很好地满足科研、临床的需要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种获得覆盖整个微生物群落 状况的方法，以为实现快速、便捷及准确检测人肠道菌种组成与研究菌落生态结构建立基 础性的菌落数据库。
[0009] 具体的，为了解决上述问题，本发明提供了一种肠道微生物全部菌种的结构和功 能的靶标基因序列库的建立方法，尤其具体的，提供了一种基于高通量基因测序建立粪便 菌群基因文库的方法，该方法采用"巢式PCR"的方法对16S rDNA进行富集扩增，最大限度减 少了宿主和食物残渣基因组污染，同时将V3和V6组合，进行特异扩增并进行大规模并行测 序，获得菌群的靶标基因序列库。利用该序列库，能够将菌群鉴定从属(Genus)级别，提升至 种(Species)级别。
[0010]具体的，根据上述方法，其中"巢式PCR"的方法包括从总基因组DNA中进行16S rDNA全长富集扩增，扩增所用的引物组由3对PCR引物组成，该3对引物序列如下：
[0011] 第1对PCR引物序列为：
[0012] SEQ ID N0.1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'（16S-27F)
[0013] SEQ ID N0.2:5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3'（16S-1492R)
[0014] 第2对PCR引物序列为：
[0015] SEQ ID N0.3:5'-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3'（V3-357F)
[0016] SEQ ID N0.4：5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，(v3-534R)
[0017] 第3对PCR引物序列为：
[0018] SEQ ID N0.5:5'-CAACGCGAAGAACCTTAC-3'（v6-967F)
[0019] SEQ ID N0.6:5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'（v6-1100R)
[0020] 上述引物组中，第1对PCR引物序列扩增细菌16S rDNA的位点27/1492区域，扩增产 物长度为1465bps，约15kb。
[0021] 上述引物组中，第2对PCR引物序列扩增细菌16S rDNA V3的位点357/534区域，扩 增产物长度约为177bps;
[0022] 上述引物组中，第3对PCR引物序列扩增细菌16S rDNA V6的位点967/1100区域，扩 增产物长度约为133bps;
[0023] 为此，本发明还提供了一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法， 该方法包括如下步骤：
[0024]步骤一、提取粪便菌群总基因组DNA;
[0025]步骤二、用上述第1对引物对总基因组DNA进行16S rDNA全长富集扩增，并用16S rDNA的V3区和V6区第2对引物和第3对引物分别进行特异扩增；
[0026]步骤三、进行大规模并行测序，建立文库。
[0027]上述方法中，步骤二的特异扩增的产物分别为约177bps和133bps。
[0028]上述方法中，步骤三的大规模并行测序使用Ion Torrent个人化操作基因组测序 仪进行大规模并行测序。
[0029] 上述方法中，步骤一提取粪便菌群总基因组DNA按照按照（TIANGEN公司DP328)试 剂盒操作说明书所述的条件提取粪便菌群总基因组DNA进行，优选的，根据肠道菌进行条件 优化，优化后的条件如下：
[0030] 将样品预处理的裂解温度调整为95°C孵育lOmin，能使较难破壁的革兰氏阳性细 菌裂解破壁，使得抽提产物能覆盖到全部微生物，同时使DNA结构完整性保持最佳状态;样 品裂解后，在原有一块的基础上，再添加一块抑制剂吸附片InhibitEX，能针对于粪便样品 杂质去除PCR抑制作用。
[0031] 优选的，上述步骤二中，对总基因组DNA进行16S rDNA全长富集扩增的方法为"巢 式PCR三步循环法"。
[0032]具体的，巢式PCR三步循环法的操作步骤为：
[0033]首先将细菌总基因组DNA稀释到浓度为lng/ul，取ΙμL为模板作为第一次扩增的模 板，以第1对引物进行PCR扩增，得到16S rDNA的PCR产物;第二次扩增，以lul其扩增富集的 16S rDNA的PCR产物稀释50倍为模板，引物为第2对引物和第3对引物，用相同配液体系和反 应条件进行二次扩增。
[0034]其中巢式PCR三步循环法的反应体系为：PCR为50μ1总体系，具体是2XTaq PCR StarMix with Loading Dye 25yl，Primer-F/Primer_R 2μ1，浓度稀释到lng/μL以下的细 菌gDNA模板2ul，用灭菌水补足50μ1体系。
[0035] 其中巢式PCR三步循环法的反应条件为:95°C预变性3min，然后95 °C变性30sec，58 °C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环28次，最后72°C再延伸5min。
[0036] 上述方法中，16S rDNA和V3、V6区PCR产物鉴定方法为：取5μ1第一次扩增完后的 16S rDNA产物和第二次扩增的V3、V6区PCR产物直接跑1 %琼脂糖凝胶电泳。
[0037] V3、V6区PCR产物回收方法为：利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按样品与磁 珠体积1.5倍体积纯化回收目的片段。
[0038]上述方法中，优选的，步骤三的操作步骤如下：
[0039] (1)末端补平DNA、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按 样品与磁珠体积1.5倍体积(75yL)纯化回收目的片段；
[0040] (2)连接接头，缺口平移、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure 磁珠按样品与磁珠体积1.2倍体积（120yL)纯化回收目的片段；
[0041 ] (3)文库扩增、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按样品 与磁珠体积1.2倍体积（120yL)纯化回收目的片段；
[0042] (4)文库质控与决定模板稀释因子：
[0043]检测浓度：取2μ1扩增后的文库，将文库稀释为终浓度100ρΜ的稀释因子，通过 Qubit 2.OHS DNA荧光检测试剂进行浓度检测；
[0044] 检测片段分布：根据Qubit检测浓度将待测样品稀释至lng/μL，通过High Sensitivity DNA Assay试剂盒芯片检测；
[0045] 分别将V3、V6等摩尔浓度混合。取100ng作为建库起始量。
[0046] (5)模板制备：米用Ion OneTouch 200Template Kit 0T2试剂盒和OneTouch仪器 进行乳液PCR;采用MyOne beads磁珠和Ion OneTouch ES仪器进行ISPs富集，最终得到3'端 带有磁珠的阳性模板文库；
[0047] (6)测序及测序结果分析:将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGM sequencer高通量测序仪上进行测序，样本生成测序读长在200bp，深度要求在100X以上，数 据量在0.05M reads以上;经FastQC-3.4.1.1分析测序质控，使用QUME软件，通过与数据库 比对，即可获得菌群生态的物种组成、比例。通过获得菌群生态的物种组成、比例判断优势 劣势菌情况。
[0048]上述方法中，V3、V6区纯化回收产物质控与决定建库起始量为：
[0049] (1)检测浓度:取2μ1 V3、V6区纯化回收产物，通过Qubit 2.0HS DNA荧光检测试剂 进行浓度检测；
[0050] (2)检测片段分布：根据Qubit检测浓度将待测样品稀释至lng/μL，通过High Sensitivity DNA Assay试剂盒芯片检测。
[0051]本发明还提供了一种从总基因组DNA中进行16S rDNA全长富集扩增所用的引物 组，该引物组由3对PCR引物组成，该3对引物序列如下：
[0052] 第1对PCR引物序列为：
[0053] SEQ ID N0.1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'
[0054] SEQ ID N0.2:5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3'
[0055] 第2对PCR引物序列为：
[0056] SEQ ID N0.3:5'-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3'
[0057] SEQ ID N0.4:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
[0058] 第3对PCR引物序列为：
[0059] SEQ ID N0.5:5'-CAACGCGAAGAACCTTAC-3'
[0060] SEQ ID NO·6:5 '-GGGTTGCGCTCGTTG-3 '。
[0061] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0062] (1)建库速度快，通量大:检测方法搭配了目前最快的高通量测序平台life品牌的 Ion Torrent PGM测序仪，上百个样品并行检测，上机测序时间仅为3个小时，文库满足科 研、临床需要；
[0063] (2)文库高特异性，高灵敏度:V3和V6组合，菌群从鉴定到"属(Genus)"级别，提升 至鉴定到"种(Species)"的级别。同时，选择"巢式PCR"的方法对以16S rDNA进行富集扩增， 最大限度减少了宿主和食物残渣基因组污染；
[0064] (3)文库建立采用原位活检：以新鲜或冻存的样品原位活检粪便的菌群组成，不需 要经过筛选培养，从而保持原来菌群生态组成。
[0065] (4)本发明以高通量组学为手段，能够快速、方便、同步、高效、高特异、高灵敏地检 测到原来菌群的生态组成，获得覆盖整个微生物群落的文库信息，真正实现了对肠道微生 物全部菌种的结构和功能的整体研究。
【附图说明】
[0066] 图1为实施例粪便菌群总基因组抽提的检测结果。
[0067]图2为实施例粪便菌群16SrDNA扩增的检测结果。
[0068] 图3为实施例粪便菌群V3、V6扩增的检测结果。
[0069] 图4为实施例粪便菌群V3扩增纯化回收的2100检测结果。
[0070] 图5为实施例粪便菌群V6扩增纯化回收的2100检测结果。
[0071 ]图6为实施例粪便菌群V3、V6文库构建后的2100检测结果。
[0072]图7为实施例粪便菌群V3、V6文库测序上机后的数据量结果。
[0073]图8为实施例粪便菌群V3、V6文库测序上机后片段分布结果。
[0074] 图9为实施例粪便菌群的微生物百分比热图和柱状图。
[0075] 图10为实施例粪便菌群的微生物丰富度柱状图。
[0076]附图1-8中外文的含义如下：
[0077] Μ 指 maker 1 kb，DNA 分子量标准；
[0078] bp，碱基对个数
[0079] 16s rDNA，16s核糖体DNA;
[0080] kb，一千个碱基对个数
[0081] V3,核糖体 16s DNA V3区；
[0082] V6,核糖体 16s DNA V6区；
[0083] FU，电信号值；
[0084] Total Bases，总数据量；
[0085] M，Mb，兆字节；
[0086] Key Signal，关键信号值；
[0087] ISP Loading，Ion Sphere Particles Loading，离子球粒子覆盖度；
[0088] ISP Density，Ion Sphere Particles Density，离子球粒子密度；
[0089] Wells，纳米孔数；
[0090] GZ-170-2015.09.08-16s v3v6-200,测序流水号和测序样品命名；
[0091 ] Loading Density，Ion Sphere Particles Density average，离子球离子密度平 均值；
[0092] (Avg-76%)，本次离子球离子密度测定的平均值是76%，正常范围是在65-85%之 间，属于较佳值。
[0093] None bp Mean，无平均值；
[0094] median，中值；
[0095] Mode，众数；
[0096] Read Length，测序序列长度；
[0097] Read length Histogram测序序列长度直方图；
[0098] count，计数值；
[0099]附图9中外文的含义如下：
[0100] Color Key and Histogram，颜色信号与柱状图；
[0101] Value，值；
[0102] count，计数点；
[0103] AB1.1，携带艰难梭菌AB毒素阳性的粪便样品1
[0104] AB1.2,携带艰难梭菌AB毒素阳性的粪便样品2
[0105] NC，normal control，空白对照
[0110] ABl-l，携带艰难梭菌AB毒素阳性的粪便样品1
[0111] AB1-2，携带艰难梭菌AB毒素阳性的粪便样品2 [0112] NC，normal control，空白对照
【具体实施方式】
[0113] 下面通过结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发 明并不限于以下实施例。实施例中所用的材料为广州军区总医院提供的一组确诊为携带艰 难梭菌AB毒素阳性的患者粪便。
[0114] 本发明的建立文库的实验流程具体步骤如下。
[0115] 1.提取粪便菌群总基因组DNA:
[0116] 严格按照TIANamp Stool DNA Kit(TIANGEN公司DP328)试剂盒操作说明书提取粪 便菌群总基因组DNA，并针对肠道菌进行了条件优化:将样品预处理的裂解温度调整为95°C 孵育lOmin，能使较难破壁的革兰氏阳性细菌裂解破壁，保证抽提产物能覆盖到全部微生 物，同时使DNA结构完整性保持最佳状态；样品裂解后，再添加一块抑制剂吸附片 InhibitEX，能针对于粪便样品杂质去除PCR抑制作用。具体操作如下：
[0117] 1.1提取粪便菌群总基因组DNA
[0118] (1)称取奠便样本50mg至1.5ml离心管中，并将管置于冰上。
[0119](若是液态样本则转移200μ1至离心管中）
[0120] (2)向样本中加入1.5ml缓冲液GSL，间歇振荡3min至样本混匀。
[0121] (3)95°C 孵育 lOmin。
[0122] (4)祸旋158θ(^12,00〇Γρπι离心lmin。转移上清液lml至新的1 · 5ml离心管。
[0123] (5)添加一块抑制剂吸附片InhibitEX，振荡至吸附片彻底打开重悬。室温孵育 5min，使吸附片能充分作用。
[0124] (6)12,000印111离心3111；[11。
[0125] (7)将上一步所得上清液转移至新的1.5ml离心管，重复步骤6。
[0126] (8)转移所得上清液400μ1至新的1 · 5ml离心管，加入20μ1 ProteinaseK。
[0127] (9)加入400μ1 缓冲液 GB，涡旋 15sec〇
[0128] (10)70°C 孵育 lOmin。
[0129] (11)加入400μ1无水乙醇，涡旋混匀。
[0130] (12)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱中12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将 吸附柱放入收集管中。
[0131] (13)向吸附柱中加入500μ1缓冲液⑶，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱 放入收集管中。
[0132] (14)向吸附柱CR2中加入600μ1漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱 CR2放入收集管中。
[0133] (15)重复操作步骤14。
[0134] (16)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温 放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0135] (18)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μ1ρΗ值 7.5的无核酸水，放置在65 °C烘箱5min，12，OOOrpm离心2min，将溶液收集到离心管中。DNA产 物应保存在-20 °C。
[0136] 1.2菌群总基因组浓度检测与质控
[0137] 对抽提后的DNA片段用微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度与纯 度。DNA应在0D260处有显著吸收峰，0D260/0D280比值应为1.8-2.0，浓度为500ng/yl。电泳 胶图中在约15kb处条带单一清晰，说明DNA质量合格。细菌总基因组电泳图如图1所示:M: Marker; 1-18:菌群总基因组DNA。
[0138] 2.设计PCR引物富集16SrDNA和捕获V3、V6区
[0139] 2.1富集 16SrDNA 和捕获 V3、V6 区
[0140] 设计3对PCR引物对抽提出来的总基因组DNA进行16S rDNA全长富集扩增，保证扩 增的产物能完全覆盖到高突变区域;然后取lylPCR产物为模板，用16S rDNA的V3区和V6区 特异引物分别进行特异捕获。
[0141] 第一对PCR引物序列为：
[0142] 16S-27F:5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3 '
[0143] 16S-1492R:5 '-GGTTACCTTGTTACGACT-3 '
[0144] 扩增细菌16S rDNA的位点27/1492区域，扩增产物长度为1465bps，约15kb;
[0145] 第二对PCR引物序列为：
[0146] V3-357F:5 '-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3 '
[0147] V3-534R:5 '-ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '
[0148] 扩增细菌16S rDNA V3的位点357/534区域，扩增产物长度约为177bps;
[0149] 第三对PCR引物序列为：
[0150] V6-967F:5 '-CAACGCGAAGAACCTTAC-3 '
[0151] v6-l100R:5 '-GGGTTGCGCTCGTTG-3 '
[0152] 扩增细菌16S rDNA V6的位点967/1100区域，扩增产物长度约为133bps;
[0153] 用上述引物配合配合如下反应体系:PCR为50μ1总体系：
[0155]首先将细菌总基因组DNA稀释至浓度为lng/μL，取ΙμL为模板反应条件为"巢式PCR 三步循环法"
[0157] 第二次扩增，以lul其扩增富集的16SrDNA的PCR产物稀释50倍为模板，分别用V3和 V6区两对引物，用相同配液体系和反应条件进行二次扩增。目的模板的浓度稀释至lng/μL 以下有利于提高PCR的特异性。
[0158] 2.2 16SrDNA 和 V3、V6 区 PCR 产物鉴定
[0159] 取5μ1第一次扩增完后的16SrDNA产物和第二次扩增的V3、V6区PCR产物直接跑1% 琼脂糖凝胶电泳，如图2、图3所示。图2，扩增产物16S rDNA约为15kb;图3，V3、V6区扩增产物 分别为约177bps和154bps。
[0160] 2.3V3、V6区PCR产物磁珠回收
[0161 ] 利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按样品与磁珠体积1.5倍体积纯化回收目 的片段。具体方法如下：
[0162] (1)将样品补水至50μ1，加入1.5倍体积的磁珠 (75μ1)，用移液器吹打混匀，室温孵 育5分钟；
[0163] (2)将样本管子放置在磁力架上，等待2-3分钟直到管内溶液完全澄清。
[0164] (3)小心吸取上清液，移除和弃掉上清液。
[0165] (4)加500yL新鲜配置的70%的酒精溶液。通过旋转管子清洗磁珠，旋转180°。总共 旋转5次以彻底清洗。注:旋转可以利用磁性打散珠，去除底物。
[0166] (5)放置样本管子在磁力架上澄清后去除上清液，再旋转离心后去除残留的酒精 溶液。
[0167] (6)在室温条件下完全风干磁珠 5分钟，直到磁珠表面干燥，无液体光泽。
[0168] (7)加 25yL LowTE到样本管子内并震荡10秒。用枪头上下吹吸溶液多次以保证洗 脱完全混匀。
[0169] (8)将样本管子放置在磁力架上，待溶液澄清后，将洗脱的溶液(上清液)转移到一 个新的.5ml低吸附管子内保存。
[0170] 2.4V3、V6区纯化回收产物质控与决定建库起始量
[0171] (l)Qubit 检测浓度
[0172] 取2μ1 V3、V6区纯化回收产物，通过Qubit 2.0HS DNA荧光检测试剂进行浓度检 测。检测结果:V3产物为53ngAxl、V6产物为25ngAxl。从浓度上看，说明此磁珠回收的产量相 对于切胶回收法较高效，同时弥补了切胶法无法去除大片段污染的不足。
[0173] (2)安捷伦2100检测片段分布
[0174] 根据Qubit检测浓度将待测样品稀释至lng/μL，通过High Sensitivity DNA Assay试剂盒芯片检测。检测结果:V3区主峰为179bp和205bp大小;V6区主峰为154bp大小。 从片段分布上看，V3、V6区条带都符合预期大小，对于V3区存在两个主峰，205bp的主峰可能 是肠道特有的优势菌的扩增产物。片段大小在160-200之间，有利于构建200base读长的测 序DNA文库。安捷伦2100仪器对文库的片段大小检测如图4、5。
[0175] 3.大规模并行测序
[0176]文库构建采用life品牌的DNA文库构建试剂盒，按照200bp扩增子的标准操作流程 进行建库，并针对肠道菌16SrDNA的片段特征进行优化。文库构建即为对靶目标序列前后两 端加上与引物匹配的位点并为识别不同样品插入约十个碱基的特异性标签双链接头。此标 签接头，为后面的扩增反应及测序提供匹配位点和识别信号。
[0177] 3.1末端补平DNA
[0178] (1)在低吸附的1.5ml管内混合并混匀以下试剂成分，然后放置在室温条件下孵育 30分钟。
[0180] (2)利用Backman品牌Agencourt AMPure磁珠按样品与磁珠体积1 ·5倍体积(75yL) 纯化回收目的片段，经验证此浓度能确保片段选择中最大限度保留目标主峰200base，去除 接头二聚体的污染。
[0181] 3.2连接接头，缺口平移
[0182 ] (1)在连接反应体系中混合并混匀以下试剂成分。
[0185] (2)在PCR仪上按照以下程序孵育：
[0187] (3)利用Backman品牌Agencourt AMPure磁珠按样品与磁珠体积1.2倍体积（120μ L)纯化回收目的片段，经验证此浓度能确保片段选择中最大限度保留加接头后的目标主 峰。
[0188] 3.3文库扩增
[0189] (1)在PCR管中混合并混匀以下试剂成分。
[0191] (2)设置以下程序进行PCR反应。
[0193] (3)利用Backman品牌Agencourt AMPure磁珠按样品与磁珠体积1.2倍体积（120μ L)纯化回收目的片段，经验证此浓度能确保片段选择中最大限度保留目标主峰300,同时去 除接头二聚体和引物污染。
[0194] 3.4文库质控与决定模板稀释因子
[0195] (l)Qubit 检测浓度
[0196] 取2μ1扩增后的文库，通过Qubit 2.OHS DNA荧光检测试剂进行浓度检测。检测结 果:V3和V6片段混合文库为1.68ng/yl。从浓度上看，在l-lOng/μΙ范围，又不过度扩增而失 真。（2)安捷伦2100检测片段分布
[0197] 根据Qubit检测浓度将待测样品稀释至lng/μL，通过High Sensitivity DNA Assay试剂盒芯片检测。检测结果:V3和V6片段混合文库为237bp、263bp和288bp大小;此为 目标序列加上两端接头85bp，实际插入片段为152bp、178bp和203bp，此与建库前加进去的 V3和V6区片段模板完全一致，且大小符合测序长度要求，由此说明本批样品文库构建质量 合格。根据安捷伦2100提供的50-1000bp范围的摩尔浓度将文库稀释为终浓度ΙΟΟρΜ的稀释 因子。16SV3V6文库安捷伦2100检测结果见图6。
[0198] 3.5模板制备
[0199] 文库构建完成后，通过在油包水乳液PCR中序列簇成百万倍扩增，并以此为模板进 行上机测序。经验证取6μ1的ΙΟΟρΜ文库稀释因子能降低主峰分散带来的多克隆现象，可获 得更多的测序仪数据量。采用Ion OneTouch 200Template Kit 0T2试剂盒和OneTouch仪器 进行乳液PCR;采用MyOne beads磁珠和Ion OneTouch ES仪器进行ISPs富集，最终得到3'端 带有磁珠的阳性模板文库。
[0200] 3 ·6Ιοη Torrent PGM测序
[0201] 对PGM测序仪初始化前，首先按Ion PGM Sequencing 200kit v2试剂盒清洗标准 操作流程对测序仪管道先后用氯水和18ΜΩ去离子水清洗15min。然后，按照安装W1、W2、W3 反应溶液进行初始化调节pH值，校正至pH为7.5-7.6。初始化后，用100 %异丙醇和退火缓冲 液Annealing buffer清洗314测序芯片，然后放到PGM测序仪上反应孔信号检测。同时，向富 集好的文库中加入测序引物、文库内参Contro 1 Ion Spheres。然后置PCR仪上95°C，2min; 37°C，2min退火变性，加入测序聚合酶，将文库样品加载到测序芯片上。最后，将芯片放到 PGM测序仪上，设置500个flow测序循环，反应两个小时，测序完成。
[0202] 3.7测序结果分析
[0203] 样品通过上机测序，得到的最原始的测序数据以FASTQ格式的形式储存。
[0204] 本次测序数据结果报告:314基因芯片实际测得有效区域达76%，最终产生的原始 测序数据总量为45.1Mb;测序读长为150bp、179、205bp，均反映插入的目的片段实际长度。 (见图7为实施例粪便菌群V3、V6文库测序上机后的数据量结果；图8为实施例粪便菌群V3、 V6文库测序上机后片段分布结果）
[0205] 本次16S rRNA测序得到的FASTQ结果，通过使用QHME软件进行操作单元分类(没 有进行过滤），得到分别有自己代表序列的操作单元，使用QIIME里面的分类功能，根据 Greengene database分类0TU的代表序列，得到其界、门、纲、目、科、属分别是那种微生物。 分类分析结果得到29个能分类到属并大于0.001 (0.1 % )的微生物优势属，并且根据结果绘 制了图9微生物百分比热图和柱状图和图10微生物丰富度柱状图。
[0206] 根据分类分析学的分析结果，数据用更直观的方法去展示。
[0207] 根据图9,微生物百分比热图，能更好观测到不同样品中的微生物差异情况：
[0208] 根据样品聚类情况，知道携带艰难梭菌患者样品AB1.1和AB1.2的相似度比样品正 常人NC(空白对照）的情况更接近，且可以明显观测微生物百分比含量在不同样品间的差 别。
[0209]根据图10,微生物丰富度柱状图，能清晰看到在三组样品中33个微生物优势属占 样品百分比的情况，更好地表达样品内优势菌属的占百分比的状况。如图10所示， Ruminococcus(约9%_25% )，Corynebacterium(约3%_9% )、Enhydrobacter(约2%_5% )， Clostridium(约2%_7% )，Enterococcus(约1 )分别在3个样品中均为优势的5个菌 属，其中本次实验最为关注的Clostridium(梭菌属)在三组样品中的百分比含量分别是NC 样为2.65%，AB1-1 样为5.61%，ΑΒ1-2样为7.04%。
[0210]由此可见，艰难梭菌属患者比正常人患者所含比例明显增高，其菌群结构的动态 也有稍微差别。
【主权项】
1. 一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法，该方法采用"巢式PCR"的 方法对16S rDNA进行富集扩增，同时将V3和V6组合，进行特异扩增并进行大规模并行测序， 获得菌群的靶标基因序列库。2. 根据权利要求1所述的方法，其中"巢式PCR"的方法包括从总基因组DNA中进行16S rDNA全长富集扩增，扩增所用的引物组由3对PCR引物组成，该3对引物序列如下： 第1对PCR引物序列为： SEQ ID N0.1：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3， SEQ ID N0.2:5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3' 第2对PCR引物序列为： SEQ ID N0.3:5'-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3' SEQ ID N0.4:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' 第3对PCR引物序列为： SEQ ID N0.5:5'-CAACGCGAAGAACCTTAC-3' SEQ ID N0.6:5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'。3. -种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法，该方法包括如下步骤： 步骤一、提取粪便菌群总基因组DNA; 步骤二、用上述第1对引物对总基因组DNA进行16S rDNA全长富集扩增，并用16S rDNA 的V3区和V6区第2对引物和第3对引物分别进行特异扩增； 步骤三、进行大规模并行测序，建立文库。4. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤二中，对总基因组DNA进行16S rDNA全长富集 扩增的方法为"巢式PCR三步循环法"。5. 根据权利要求4所述的方法，其中巢式PCR三步循环法的操作步骤为： 首先以lOOng/μΙ的细菌总基因组DNA稀释100倍，取ΙμL为模板作为第一次扩增的模板， 以第1对引物进行PCR扩增，得到16S rDNA的PCR产物;第二次扩增，以lul其扩增富集的16S rDNA的PCR产物稀释50倍为模板，引物为第2对引物和第3对引物，用相同配液体系和反应条 件进行二次扩增。6. 根据权利要求5所述的方法，其中巢式PCR三步循环法的反应体系为:PCR为50μ1总体 系，具体是2XTaq PCR StarMix with Loading Dye 25yl，Primer-F/P;rime;r-R 2μ1，浓度 稀释到lng/μL以下的DNA模板，用灭菌水补足50μ1体系。7. 根据权利要求5所述的方法，其中巢式PCR三步循环法的反应条件为：95°C预变性 3min，然后95°C变性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环28次，最后72°C再延伸 5min〇8. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤三的操作步骤如下： (1) 末端补平DNA、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按样品 与磁珠体积1.5倍体积(75yL)纯化回收目的片段； (2) 连接接头，缺口平移、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠 按样品与磁珠体积1.2倍体积（12〇 yL)纯化回收目的片段； (3) 文库扩增、纯化回收目的片段:利用Backman品牌AgencourtAMPure磁珠按样品与磁 珠体积1.2倍体积（120yL)纯化回收目的片段； (4) 文库质控与决定模板稀释因子： 检测浓度：取2μ1扩增后的文库，将文库稀释为终浓度ΙΟΟρΜ的稀释因子，通过Qubit 2.OHS DNA荧光检测试剂进行浓度检测； 检测片段分布:根据Qubit检测浓度将待测样品稀释至lng/μL，通过High Sensitivity DNA Assay试剂盒芯片检测； (5) 模板制备：米用Ion OneTouch 200Template Kit 0T2试剂盒和OneTouch仪器进行 乳液PCR;采用MyOne beads磁珠和Ion OneTouch ES仪器进行ISPs富集，最终得到3'端带有 磁珠的阳性模板文库； (6) 测序及测序结果分析：将制备好的文库在Life technologies公司的Ion PGM sequencer高通量测序仪上进行测序，样本生成测序读长在200bp，深度要求在100X以上，数 据量在0.05M reads以上;经FastQC-3.4.1.1分析测序质控，使用QUME软件，通过与数据库 比对，即可获得菌群生态的物种组成、比例。通过获得菌群生态的物种组成、比例判断优势 劣势菌情况。9.一种从总基因组DNA中进行16S rDNA全长富集扩增所用的引物组，该引物组由3对 PCR引物组成，该3对引物序列如下： 第1对PCR引物序列为： SEQ ID N0.1：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3， SEQ ID N0.2:5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3' 第2对PCR引物序列为： SEQ ID N0.3:5'-CTCCTACGGGAGGCAGCA-3' SEQ ID N0.4:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' 第3对PCR引物序列为： SEQ ID N0.5:5'-CAACGCGAAGAACCTTAC-3' SEQ ID N0.6:5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'。
【文档编号】C12Q1/04GK105937053SQ201510884236
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年12月2日
【发明人】伍泳彰
【申请人】广州赛哲生物科技股份有限公司