Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其应用
【专利摘要】Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其应用，涉及落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其应用。本发明提供长白落叶松Csl D3基因的SNP标记，为建立长白落叶松分子辅助育种技术提供了重要分子标记。该SNP标记位于长白落叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO：1所示序列的647bp处或680bp处，本发明的SNP标记在鉴定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用。本发明提供的分子遗传标记不受长白落叶松的树龄等限制，可大大加快长白落叶松的育种进程。检测方法准确、简便易操作。本发明用于长白落叶松育种领域。
【专利说明】
Cs I D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 长白落叶松是我国林区主要的速生造林树种之一，树干端直、材质坚韧、耐腐蚀， 具有生长快，材质好、适应性强、分布广等特性，被广泛的应用于建筑、桥梁和木纤维工业原 料等多个方面，具有重要的生态与经济价值。在优良品种的定向培育中，与造纸有关的材性 性状，如纤维素含量、木质素含量等是仅次于生长指标的主要考虑因素，高纤维素、低木质 素的木材原料可以在很大程度上降低制成纸浆的成本与消耗。通过分子技术达到调节植物 次生代谢过程，提高植物纤维素含量降低植物木质素含量，成为了目前解决这一难题的重 要途径。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记及其应用。
[0004] 本发明Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记位于长白落叶松 Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp处，此处碱基为C的长白落叶松的纤 维素含量显著高于此处为T的长白落叶松。
[0005] 本发明还提供用于检测上述与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记的引物，包 括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。
[0006] 本发明另一个Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记位于长白落 叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的680bp处，此处碱基为T的长白落叶松 的纤维素含量显著高于此处为C的长白落叶松。
[0007] 本发明还提供用于检测上述与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记的引物，包 括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。
[0008] 本发明还提供上述与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴定长白落叶松高 纤维素优势品种中的应用，其包括以下步骤：
[0009] 一、以长白落叶松针叶为材料，提取其基因组DNA;
[001 0]二、以提取的基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增出长白落叶松Csl D3基 因片段;所述引物卩为5'-176〇0：1'0^丁66(：1'11^-3'，引物1?为5'-(^0^0^(：1'(：1'1'0^厶丁61'-3'。 [0011]三、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中647bp处的碱基为C，或者扩增产物序 列中680bp处的碱基为T，则待测长白落叶属于纤维素含量高的优势品种。
[0012]本发明的有益效果：
[0013]本发明主要筛选对长白落叶松Csl D3基因中与纤维素含量显著相关的SNP位点， 利用SNP辅助育种早期选择策略选取纤维素含量高的优质变异单株，为长白落叶松高效育 种提供更多的功能标记。
[0014] 1、本发明提供的分子遗传标记不受长白落叶松的树龄等限制，可大大加快长白落 叶松的育种进程。
[0015] 2、本发明的检测方法准确。
[0016] 3、本发明的检测方法简便易操作。
【具体实施方式】
[0017] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0018] 一:本实施方式Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP 标记位于长白落叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp处，此处碱基为 C的长白落叶松的纤维素含量显著高于此处为T的长白落叶松。
[0019]本实施方式筛选出与纤维素含量显著相关的功能基因标记位点，以此来选育优良 针叶纸浆用材树新品系，为在长白落叶松中进行木材纤维品质基因辅助育种以及工业用材 林的培育奠定良好的技术和材料基础，同时为根据纤维素合成酶的关键SNP位点对长白落 叶松苗木的早期选择提供标准和理论依据。
【具体实施方式】 [0020] 二:本实施方式与一不同的是：用于检测Csl D3基因 中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记引物，其特征在于包括正向引物5'-TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。其它与 一相同。
【具体实施方式】 [0021] 三:本实施方式Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP 标记位于长白落叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO: 1所示序列的680bp处，此处碱基为 T的长白落叶松的纤维素含量显著高于此处为C的长白落叶松。
[0022]【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】三不同的是：用于检测Csl D3基因 中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记引物，其特征在于包括正向引物5'-TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 ' 和反向引物5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。其它与【具体实施方式】 三相同。
[0023]【具体实施方式】五:本实施方式Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP 标记在鉴定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用，其包括以下步骤：
[0024] 一、以长白落叶松针叶为材料，提取其基因组DNA;
[0025]二、以提取的基因组DNA为模板，以引物F和R，PCR反应扩增出长白落叶松Csl D3基 因片段;所述引物卩为5'-176〇0：1'0^丁66(：1'11^-3'，引物1?为5'-(^0^0^(：1'(：1'1'0^厶丁61'-3'。 [0026]三、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中647bp处的碱基为C，或者扩增产物序 列中680bp处的碱基为T，则待测长白落叶属于纤维素含量高的优势品种。
[0027]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】五不同的是:步骤二中PCR反应体系 为50μ1，具体如下：
[0029] 。其它与【具体实施方式】五相同。
[0030] 【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】五不同的是:步骤二中PCR反应程序 为：
[0032]。其它与【具体实施方式】五相同。
[0033]为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
[0034] 1、植物材料
[0035]本试验材料取自于东北林业大学帽儿山试验林场长白落叶松第二种源试验林，采 用完全随机区组设计，重复五次。1980年于和龙、露水河、小北湖等10个地点（种源)采种，第 二年育苗，第三年进行造林，小区内每个种源60株，双行排列，共计3000株。1995年进行隔行 去行间伐，2001年进行隔一株去2株间伐。现从五个区组中选取I、II、IV、V区组，每个种源挑 取6个单株，10个种源共计240个个体。
[0036] 2、表型测定
[0037]对长白落叶松240株单株进行了材性性状表型测定，利用滤袋技术对纤维素 (cellulose)进行测定，纤维素分析仪为ANKOM A2000i型。样品用粉碎机粉碎好，用40目和 60目的筛子筛取，于102°C烘箱将水分烘干。
[0038] 1)中性洗涤纤维NDF的分析方法
[0039] 中性洗涤纤维检测方法，消解后残留物为半纤维素、纤维素和木质素。
[0040] a.中性洗涤液的配制：称取90g十二烷基硫酸钠、55.83g的乙二胺四乙酸二钠、 20.43g的四硼酸钠、13.68g的磷酸氢二钠和30ml的三乙二醇。将上述药品与试剂加入3L去 离子水中，搅拌均匀，调节pH为7.0，即为NDF中性洗涤液。在通风橱中进行。
[0041 ] b.将配置好的NDF中性洗涤液放在ANKOM A2000i型纤维素分析仪左边的架子上， 并在右边的蓝色塑料杯中加入208ml去离子水。热水器加热调至最大。
[0042] c.用记号笔给滤袋编号并称重，取0.5g的样品放入滤袋中，距滤袋口4mm处用封口 机封口。同时做一空白对照。
[0043] d.样品脱脂:在通风橱中进行，将装好样品的滤袋放入3L的烧杯中，加入足量的丙 酮至样品能全部覆盖，震荡并浸泡5-10min，将滤袋挑出，放置风干。轻轻敲击滤袋，使样品 能平铺于滤袋中。
[0044] e.滤袋放入仪器的托盘中，每个托盘放入3个样品，最上层不放任何东西，托盘间 呈120°角放置，确保最上面的托盘放入重锤后可全部浸入洗涤液中，放入重锤。
[0045] f.开启机器，待洗涤液浸满液缸中加入20g无水亚硫酸钠，至搅拌均匀。
[0046] g.NDF分析洗涤结束后，打开盖子取出样品，将样品上的水挤压干净，浸入丙酮3-5min，通风橱内风干，放入烘箱102 °C烘干3h。
[0047] h.取出滤袋放置于干燥器中，待样品冷却后称取重量。
[0048]公式计算：
[0049] NDF(as-received basis)% =(W3-(fflx Cl))x100 /W2
[0050] Wl=滤袋质量 [0051 ] W2 =样品质量
[0052] W3 =消解后滤袋干重
[0053] C1 =灰分空白滤袋因素（点燃失重的空白/原空白值）
[0054] 2)酸性洗涤纤维ADF的分析方法
[0055]酸性洗涤纤维检测方法，用硫酸和十六烷基三甲基溴化铵CTAB消解剩余的残渣， 纤维残留物主要是纤维素及木质素。
[0056] a.稀硫酸配制:81ml的浓硫酸加入3L去离子水中，即配制成1.00N的硫酸溶液。
[0057] 酸性洗涤液的配置:20g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入到1L的1.00N的硫酸溶 液中，适当搅拌使其溶解。
[0058] b.将配置好的ADF酸性洗涤液放在ANKOM A2000i型纤维素分析仪右的架子上。
[0059] c.将测量好NDF的样品放入仪器托盘中，放入重锤。热水器加热调至最大。开启机 器
[0060] d.ADF分析洗涤结束后，打开盖子取出样品，将样品中的水轻轻挤压干净，浸入丙 酮3-5min，通风橱内风干，放入烘箱102 °C烘干3h。
[0061] e.取出滤袋放置于干燥其中，待样品冷却后称取重量。
[0062]公式计算：
[0063] ADF(as-received basis)% =(W3-(fflx Cl))x100 /W2
[0064] Wl=滤袋质量
[0065] W2 =样品质量
[0066] W3 =消解后滤袋干重
[0067] Cl=灰分空白滤袋因素（点燃失重的空白/原空白值）
[0068] 3)酸性洗涤木质素 ADL的分析方法
[0069] a.配制72%的硫酸溶液:取734.69ml的浓硫酸，加入到265.31的蒸馏水中。
[0070] b.将ADF处理后的滤袋放入3L烧杯中，加足量的72%的硫酸，将滤袋浸没即可。注： 滤袋必须完全干燥，待其冷却至室温后加入硫酸，如滤袋有水分，加入硫酸后会产生热，容 易将滤袋中的样品烧焦，影响测定结果。
[0071] C .将2L的烧杯放到3L的烧杯中，使滤袋完全浸没在硫酸中，充分搅拌滤袋，并在 30min内将2L烧杯上下提起大约30次。之后静置3h。
[0072] d.将滤袋取出用流水冲洗样品并浸泡，洗至pH为中性，将样品中的水分挤出。浸入 丙酮3-5min，通风橱内风干，放入烘箱102 °C烘干4h
[0073] e.放入烘箱中（102°C)干燥4h，之后放入干燥袋中冷却至室温，称重，记录数据。
[0074] f.提前准备好坩埚并标号，将坩埚干燥至恒重（250°C，2h即可），取出放入干燥其 中冷却至室温，称重。将干燥的坩埚和滤袋一起放入马弗炉中300°C碳化半小时，不要盖盖 子，然后再升温至600°C，2h，取出放入干燥器中冷却至室温，称重记录数据。
[0075]公式计算：
[0076] ADL(%) = [(m2-mlx Cl)-((m4-m3)]x100 /m
[0077] 其中:ml为空袋质量，g;m2为提取烘干后滤袋+样品质量，g;m3为坩埚质量，g;m4为 坩埚+灰分质量;C1为空白袋子校正系数(烘干后质量/原来质量）;m为样品质量。
[0078] 3、基因组DNA的提取
[0079]将采取的长白落叶松叶子及时贮藏在-80 °C冰箱保存。DNA采取改进的CTAB法提 取。
[0080]提取前工作：1)将水浴锅升温至65°C;2)预热提取缓冲液;3)配制比例为24:1的氯 仿和异戊醇混合液;4)将异丙醇放入冰箱中预冷。
[0081 ] 1)在1.5ml离心管中加入600yL CTAB提取液，将其放入65°C恒温水浴锅中预热。称 取1-1.5g嫩叶于酒精消过毒并用液氮冷冻过的研钵中，倒入液氮使其充分预冷，液氮挥发 至不再沸腾时研磨至粉末状，可再次加入液氮使其研磨更充分，样品研磨越细，DNA提取效 率越好。将粉末转入预热的CTAB缓冲液中，上下颠倒混匀，放入65 °C水浴锅中恒温15min。 [0082] 2) 15min后加入600yL氯仿异戊醇混合液，充分颠倒混勾，12000rpm/min，离心 5min，抽取上清液于1.5ml离心管中。
[0083] 3)重复步骤2)。
[0084] 4)将上清液移入新的1.5ml的离心管中，加入400yL预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温 静置lOmin，可见白色絮状沉淀，沉淀即为核酸。12000rpm/min，离心5min，弃掉上清液。 [0085] 5)加入500yL、70%乙醇洗涤沉淀，颠倒并旋转离心管，洗去残存的盐离子及管壁 的异丙醇。12000rpm/min，离心2min。
[0086] 6)弃掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上去除残液。沉淀风干后，溶于30yL DEPC 缓冲液或去离子水中溶解DNA。加入2yL RNase消化处理1 h，得到高质量的DNA样品。
[0087] 7)将提取的DNA置于-20 °C冰箱保存备用。
[0088] 4、引物设计与筛选
[0089]根据长白落叶松转录组测序结果检索到的Csl D3基因，利用Primer5.0软件设计 引物(如表1所示），以实验采集的长白落叶松个体的DNA为模板扩增基因片段克隆测序。 [0090]表1目的基因引物信息
[0092] 5、基因克隆
[0093] 1)PCR反应体系和反应条件
[0094] 表2 50μ1反应体系
[0096]反应条件：
[0098] 2)PCR产物的回收
[0099] 将PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，利用北京全式金Easy Pure Quick Gel ExtractionKit胶回收试剂盒纯化和回收目的条带。
[0100] a.切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，每100mg凝胶加 入3倍体积Gel Solubilization Buffer溶液(Yellow)。
[01 01 ] b.水浴10min，每2-3min混合，确保胶块完全融化，当胶块完全融化后，观察溶液的 颜色，若为紫色，则加入3M pH5.2醋酸钠，调颜色为黄色。
[0102] c.待溶液静置降至室温时，10000rpm/min离心lmin，弃流液。
[0103] d ·加入650μ1 Wash BufTer(使用前已加入 100% 乙醇），10000rpm/min离心lmin， 弃流液。
[0104] e.重复步骤d，再 10000rpm/min空离l_2min，去除残留的Wash Buffer。
[0105] f.将离心柱至于新的离心管中，打开盖子静置l_2min，使残留的乙醇挥发干净，在 离心柱中央加入30μ1去离子水(pH>7.0)，去离子水提前在65°C水浴中预热，室温静止5min。
[0106] g. 10000rpm/min 离心 lmin，洗脱的 DNA 保存于-20°C 冰箱。
[0107] 3)回收产物与载体连接、转化并测序
[0108] 克隆载体选用TaKaRa公司pMD18-T Vector载体。
[0109] 感受态选用北京全式金Trans5aChemically Competent Cell。
[0110] a.体系全量5μ1，如表3所示。
[0111] 表3 5μ1载体体系
[0113] b.l6°C 反应 lh。
[0114] c.取50μ1感受态细胞冰上助融，加入5μ1上述体系，轻轻混匀，冰上静置30min。
[0115] d. 42 °C水浴热激45秒，快速置于冰上冰浴静置2min。
[0116] e.离心管中加入500μ1不含抗生素的LB培养基，37°C200rmp/h培养lh。
[0117] f.吸取150μ1已转化的感受态细胞涂于LB固体培养基中（已加入50mg/ml氨苄），至 液体被吸收。倒置平板于37 °C培养箱过夜培养12h。
[0118] g.随机挑取6个白斑分别于50ml锥形瓶中，加入5ml LB液体培养基（已加入50mg/ ml氨苄），37°C200rpm/h培养 12h。
[0119] h.取600μ1菌液与600μ150%灭菌甘油于2ml离心管中混匀，保存菌种送上海生物 工程有限公司测序，即为长白落叶松Csl D3基因。
[0120] 6、SNP位点的筛选
[0121] 将测序获得的克隆片段利用NCBI的在线工具BLAST中的Nucleotide BLAST进行同 源序列比对。序列采用Bioedit进行编辑，其中Clustal W程序可将同一基因的多个序列进 行比对，频率超过10%确定为常见SNP，同时利用NCBI在线程序VecScreen去除载体序列。结 合每一条序列的测序峰值图进行基因分型分析并确定SNP位点，在同一个位点上出现两个 峰，即为杂合子，纯合子为单峰。
[0122] 在Csl D3基因中发现56个SNP位点，分别为：
[0123] SNPl(Csl D3.g.32C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的32bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和C两个等位基因；
[0124] SNP2(Csl D3.g.36A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的36bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0125] SNP3(Csl D3.g.50C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的50bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0126] SNP4(Csl D3.g.67A>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的67bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和T两个等位基因；
[0127] SNP5(Csl D3.g.68G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的68bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0128] SNP6(Csl D3.g.69C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的69bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0129] SNP7(Csl D3.g.74C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的74bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0130] SNP8(Csl D3.g.94C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的94bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0131] SNP9(Csl D3.g.97A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所 示序列的97bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0132] SNP10(Csl D3.g.l26A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的126bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0133] SNPll(Csl D3.g.l27A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的127bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0134] SNP12(Csl D3.g.l73G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的173bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0135] SNP13(Csl D3.g.213A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的213bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0136] SNP14(Csl D3.g.219G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的219bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0137] SNP15(Csl D3.g.233A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的233bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0138] SNP16(Csl D3.g.241C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的241bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0139] SNP17(Csl D3.g.253A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的253bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0140] SNP18(Csl D3.g.255C>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的255bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和G两个等位基因；
[0141] SNP19(Csl D3.g.258A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的258bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0142] SNP20(Csl D3.g.277G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的277bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0143] SNP21(Csl D3.g.286C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的286bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0144] SNP22(Csl D3.g.288A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的288bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因
[0145] SNP23(Csl D3.g.312G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的312bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0146] SNP24(Csl D3.g.318A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的318bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0147] SNP25(Csl D3.g.322C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的322bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0148] SNP26(Csl D3.g.323C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的323bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0149] SNP27(Csl D3.g.363A>C)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的363bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0150] SNP28(Csl D3.g.398A>C)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的398bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和C两个等位基因；
[0151] SNP29(Csl D3.g.408A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的408bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0152] SNP30(Csl D3.g.422A>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的422bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和T两个等位基因；
[0153] SNP31(Csl D3.g.428C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的428bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0154] SNP32(Csl D3.g.435C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的435bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0155] SNP33(Csl D3.g.444A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的444bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0156] SNP34(Csl D3.g.487C>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的487bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和G两个等位基因；
[0157] SNP35(Csl D3.g.517A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的517bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和G两个等位基因；
[0158] SNP36(Csl D3.g.519C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的519bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0159] SNP37(Csl D3.g.534A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的534bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0160] SNP38(Csl D3.g.542G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的542bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和T两个等位基因；
[0161] SNP39(Csl D3.g.581C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的581bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0162] SNP40(Csl D3.g.594C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的594bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和Τ两个等位基因；
[0163] SNP41(Csl D3.g.597A>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的597bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和Τ两个等位基因；
[0164] SNP42(Csl D3.g.605A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的605bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0165] SNP43(Csl D3.g.626C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的626bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0166] SNP44(Csl D3.g.647C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的647bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和Τ两个等位基因；
[0167] SNP45(Csl D3.g.660G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的660bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和Τ两个等位基因；
[0168] SNP46(Csl D3.g.671A>C)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的671bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和C两个等位基因；
[0169] SNP47(Csl D3.g.680C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的680bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0170] SNP48(Csl D3.g.686A>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的686bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和T两个等位基因；
[0171] SNP49(Csl D3.g.704A>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的704bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和Τ两个等位基因；
[0172] SNP50(Csl D3.g.722G>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的722bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在G和Τ两个等位基因；
[0173] SNP51(Csl D3.g.730A>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的730bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在Α和G两个等位基因；
[0174] SNP52(Csl D3.g.757A>C)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的757bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和C两个等位基因；
[0175] SNP53(Csl D3.g.768C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的768bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因；
[0176] SNP54(Csl D3.g.775C>G)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID Ν0:1 所示序列的775bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和G两个等位基因；
[0177] SNP55(Csl D3.g.777A>C)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的777bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在A和C两个等位基因；
[0178] SNP56(Csl D3.g.780C>T)，该SNP位点存在于Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1 所示序列的780bp，在基因型检测结果中发现，该位点存在C和T两个等位基因。
[0179] 7、关联分析
[0180]对筛选出的SNP标记基因型与纤维素含量进行关联分析，使用SPSS13.0软件进行 单因素方差分析(AN0VA)找到与纤维素含量显著关联的SNP标记。通过关联分析，在长白落 叶松Csl D3基因中找到2个与纤维素含量显著相关的SNP位点，分别为：
[0181] SNP 44(Csl D3g.647C>T)在长白落叶松中的基因型检测结果发现，该位点存在C 和T两个等位基因，频率分别为0.13和0.87，基因分型结果发现，该位点存在CC和TT基因型， 频率分别为0.13、0.87。SNP44位于外显子上，同义突变。多重比较分析结果表明SNP44的CC 基因型长白落叶松纤维素含量为0.6224 ± 0.0257，与TT基因型纤维素含量0.5983 ± 0.0301 差异极显著(P = 〇.0002)，基因型为CC的长白落叶松具有较高的纤维素。
[0182] SNP 47(Csl D3g.680C>T)在长白落叶松中的基因型检测结果发现，该位点存在C 和T两个等位基因，频率分别为0.20和0.80，基因分型结果发现，该位点存在CC和TT基因型， 频率分别为0.20和0.80ΑΝΡ47位于外显子上，同义突变。多重比较分析结果表明SNP47的CC 基因型长白落叶松纤维素含量为0.5927 ± 0.0281，与ΤΤ基因型纤维素含量0.6034 ± 0.0318 差异显著(Ρ = 〇.0500)，基因型为ΤΤ的长白落叶松具有较高的纤维素。
[0183] 表4 Csl D3基因与长白落叶松纤维素显著关联单个SNP位点(Ρ值）
【主权项】
1. Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记，其特征在于该SNP标记位于 长白落叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID N0:1所示序列的647bp处，此处碱基为C的长白 落叶松的纤维素含量显著高于此处为T的长白落叶松。2. 用于检测权利要求1所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记 引物，其特征在于包括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '和反向引物5 ' - CTCCACCACTCTTCTAATGT-3'。 3. Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记，其特征在于该SNP标记位于 长白落叶松Csl D3基因克隆片段如SEQ ID NO: 1所示序列的68化P处，此处碱基为T的长白 落叶松的纤维素含量显著高于此处为C的长白落叶松。4. 用于检测权利要求3所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记 引物，其特征在于包括正向引物5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '和反向引物5 ' - CTCCACCACTCTTCTAATGT-3'。5. 权利要求1所述Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴定长白 落叶松高纤维素优势品种中的应用，其包括W下步骤： 一、 W长白落叶松针叶为材料，提取其基因组DNA; 二、 W提取的基因组DNA为模板，W引物巧PR，PCR反应扩增出长白落叶松Csl D3基因片 段;所述引物F为 5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '，引物R为 5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。 Ξ、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中647bp处的碱基为C，则待测长白落叶属于 纤维素含量高的优势品种。6. 根据权利要求5所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴 定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应体系为50μ1，具体 如下： !〇χ PC民 Buffer 5μ1 2,5 niM dNTP Mix 4μ1 IQ μΜ正反向剥物 各1μ1 5 U/liL Taq DN Apolymerase ΙμL 娜贩D職 4μ1 dd H2O 叩化 50μ] ο，7. 根据权利要求5所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴 定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应程序为： 预变性 变性 退乂 延伸 循环次数补延伸 保存 94 "C 94'C 58TJ 72'C 30 72'C 4"G 3min 觀 s 45.s 45 s 7min 。8. 权利要求3所述Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴定长白 落叶松高纤维素优势品种中的应用，其包括W下步骤： 一、W长白落叶松针叶为材料，提取其基因组DNA; 二、W提取的基因组DNA为模板，W引物F和R，PCR反应扩增出长白落叶松Cs 1 D3基因片 段;所述引物F为 5 ' -TTGCCCTCTATGGCTTTG-3 '，引物R为 5 ' -CTCCACCACTCTTCTAATGT-3 '。 S、检巧UPCR扩增产物，如果扩增产物序列中680bp处的碱基为T，则待测长白落叶属于 纤维素含量高的优势品种。9. 根据权利要求8所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴 定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应体系为50μ1，具体 如下： lOxPCRBuffijr 5μ1 2.5 mM clNTP Mix 4μ1 .1.0 μΜ正反向引物 各1 μ1 5 υ/μL TaqDN Apolymerase 1μ1 模板DNA 4μ1 'd.过，陡Ο up 化 5〇μ110. 根据权利要求8所述的Csl D3基因中与长白落叶松纤维素含量相关的SNP标记在鉴 定长白落叶松高纤维素优势品种中的应用，其特征在于步骤二中PCR反应程序为： 预变性 变性 退火 延伸 循环次数补延伸 保存 94 它 ：94°仁1 如°C 72 υ 30 72 °C 4°C 3min 30 & 45 S 4：5& 7min 。
【文档编号】C12N15/11GK105936938SQ201610473452
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】张磊, 赵佳丽, 张含国
【申请人】东北林业大学