用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的pcr引物对、鉴定方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用，本发明用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，序列为F:5’?AGCCATGAGCTGAGCAGGAC?3’；R:5’?GAAGCAGAGGCTGGACACCAT?3’。用所述引物对，对待测猪肉DNA进行PCR扩增；根据扩增条带测序结果就可以判断待测猪肉是否为黑猪肉。本发明可准确判定猪肉的种源，鉴定结果准确、高效。
【专利说明】
用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用
技术领域
[0001] 本发明用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对、鉴定方法及应用，涉及黑猪肉的 分子标记技术领域，特别涉及对黑猪肉的鉴别和检测技术。
【背景技术】
[0002] 肉类生产在人类生活中占有极其重要的地位，自1990年以来，我国肉类产品总产 量和总消费量始终处于世界首位，从消费结构来看，中国居民的猪肉消费量占全国全部肉 类总消费量的60%以上。随着社会的发展，居民消费水平逐渐提高，传统的供销模式难以满 足人们日益增长的物质文明需求，越来越多的消费者开始关注饮食安全、健康和营养问题。 因此我国猪肉产量和需求量还有较大的增长空间，特别是"优质放心猪肉"的潜在需求量较 大，呈现出广阔的市场前景，具有巨大的经济和社会效益。
[0003] 我国地方猪种资源丰富，是世界猪遗传资源的重要组成部分。1986年出版的《中国 猪品种志》，收录了我国48个地方猪品种资源，12个培育猪品种资源和6个引入猪品种资源。 我国地方猪种大多为黑毛，因此地方猪又俗称黑猪或土猪。所谓黑猪肉，是指采用我国地方 猪种且按照农家传统饲养方式"圈养"的家猪，而成为商品猪后并通过"传统人工宰杀的方 式"屠宰后得到的猪肉。地方黑猪大多散养，对环境要求较高，用有机饲料或谷物喂养，生长 周期一般为10-12个月，宰杀后，猪肉颜色深红，肌肉纤维致密，大理石纹清晰，肌肉内脂肪 含量较高，蛋白质含量高，煮熟后肉质细嫩，香味浓郁，具有很高的食用营养价值;而市场常 见的瘦肉型猪生产周期一般为5-6个月，猪肉颜色鲜红，肌肉纤维不致密，瘦肉内沉积的脂 肪量少，其口味相对土猪肉香味较淡，口感一般。
[0004] 我国是猪肉生产和消费大国。近年来，随着市场多元化的发展以及人们生活水平 的提高，对猪肉的需求已经不仅仅是能吃上，而是要既瘦肉多，又色、香、味倶全。但是长期 以来，人们对猪的选育重点都集中在瘦肉率和生长速度上，而忽视了猪肉品质。导致许多消 费者都反映，现在的猪肉不好吃、肉香味不足。一味的追求快大型和瘦肉型猪的选育，已经 无法满足今后多元化的市场需求，更无法保证我国在猪肉生产和消费市场的竞争优势。
[0005] 随着人们对饮食安全、健康和营养要求的提高，传统优质地方猪肉（俗称黑猪肉） 越来越受消费者欢迎。黑猪肉因其生产成本高，市售价格是普通瘦肉型猪肉几倍甚至十几 倍。由于黑猪肉与普通猪肉直观难以辨别，一些不法商家以次充好、以假冒真，使得消费者 和真正黑猪肉商家利益蒙受损害。因此，为了维持黑猪肉市场的稳定发展，急需科学的黑猪 肉鉴别方法来规范目前的黑猪肉市场。
[0006] 我国地方猪种大多为黑毛，而外种猪为白色和棕色皮毛，因此，可以通过中国地方 猪种特有的黑毛基因对黑猪肉进行科学鉴定。该技术可有效维护我国地方黑猪产业的可持 续发展，规范黑猪肉市场。现有技术中还没有使用黑毛基因对黑猪肉进行鉴定的记载。
【发明内容】
[0007] 为了解决以上黑猪肉鉴定方面的难题，本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉 的PCR引物对、鉴定方法及应用，可快速、准确判定猪肉的种源。
[0008] 为此，本发明，第一方面，提供用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，所述引物 对由SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示的两条单链0嫩分子组成。
[0009] 第二方面，提供用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，所述试剂盒中含有上述由 SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示的两条单链0嫩分子组成的引物对。
[0010] 所述试剂盒中还含有dNTP和DNA聚合酶。根据需要还可以包含其他相关试剂。
[0011] 第三方面，提供所述的引物对或所述的试剂盒，在鉴定或辅助鉴定黑猪肉中的应 用。
[0012] 第四方面，提供利用所述的引物对或所述的试剂盒，鉴定或辅助鉴定是否为黑猪 肉的方法，步骤如下：
[0013 ] (1)对目标肉样进行DNA提取；
[0014] (2)使用权利要求1所述引物对，对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；
[0015] (3)对步骤(2)中的扩增产物进行DNA测序；
[0016] (4)根据测序结果即可直接判断目标肉样是否为黑猪肉：
[0017] 当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为C碱基的纯 合状态时，为纯种黑猪肉；
[0018] 当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为C和T的杂合 状态(同时存在C碱基和T碱基)时，为黑猪与外种猪杂交猪肉；
[0019] 当步骤(2)中的扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为T碱基的纯 合状态时;或扩增产物碱基长度为473bp的DNA片段时，为普通猪肉，即非黑猪肉。其中，前者 为棕毛猪肉，即杜洛克猪肉；后者为白毛或外种猪杂交猪肉。
[0020] 473bp的DNA片段与471bp的DNA片段相比，其第128个碱基处插入两个碱基CC。
[0021] 所述PCR扩增程序为：94°C预变性3min;94°C变性3〇8,63.5°(：复性3〇8,72°(：延伸 40s，30个循环；72°C终延伸7min。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 建立了黑猪肉的DNA分子标记鉴定技术体系，可准确判定猪肉的种源，鉴定结果准 确率可达100 %。
[0024] 利用本发明技术可有效维护我国地方黑猪产业的可持续发展，规范黑猪肉市场， 促进公平竞争，保护消费者权益。
【附图说明】
[0025] 图1为采用本发明引物对对目标肉样进行PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行 进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本 发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0027] 本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用 的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 实施例1.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对的设计与合成
[0029] F:5 '-AGCCATGAGCTGAGCAGGAC-3 '
[0030] R:5 '-GAAGCAGAGGCTGGACACCAT-3 '
[0031] 毛色是动物品种的重要特征之一，不同猪品种间毛色差异很大。毛色性状可作为 一种遗传标记，在进行杂交育种过程中，可有助于获得所需要的、能稳定遗传的毛色类型。 而MC1R基因是动物黑色素形成调控中的一个关键基因，对决定动物的皮毛颜色起着重要的 作用。MC1R通过与α-促黑素(α-MSH)及肾上腺皮质激素(ACTH)结合控制黑色素的形成。它能 被黑素细胞刺激素(MSH)激活，导致黑素体中真黑素（黑色和褐色）的形成增加，然后通过黑 素体转运到周围的毛发中。因此，本方法选用MC1R基因作为分子遗传标记进行黑猪肉的鉴 定。
[0032] 针对MC1R基因，参考其编码序列（Ensembl序列号：ENSSSCG00000020924)设计了 PCR引物对，该引物覆盖了 MC1R基因的外显子1和外显子2的编码序列，通过其编码区的单核 苷酸(SNP)突变类型来判定黑猪肉。
[0033] 实施例2.用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒
[0034]将实施例1设计合成的引物F和R分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚 合酶、10 X buffer缓冲液等包装于同一试剂盒中，或者将引物F和R分别单独包装后，与 SuperMix-同包装于同一试剂盒中，即得到本发明用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒。 [0035]实施例3.鉴定待测肉样是否为黑猪肉 [0036] (1)样品准备
[0037] 选择纯种的莱芜黑猪、大蒲莲黑猪、大白猪、杜洛克猪及杂交的鲁莱黑猪、杜长大 三元商品猪各3头，从其肌肉组织中提取基因组DNA，提取方法为通用方法。
[0038] (2)PCR 扩增
[0039]将上述莱芜黑猪、大蒲莲黑猪、大白猪、杜洛克猪、鲁莱黑猪、杜长大三元商品猪6 个猪种的基因组DNA各三份，用本发明引物对一一进行PCR扩增，然后凝胶电泳检测是否有 相应扩增条带。
[0040] PCR扩增反应总体系为25yL，其中SuperMix 12.5yL，上、下游引物各0.8yL (lOpmol/μΙ)，模板lyL(100ng/yl)，ddH2〇补足25yL。
[0041 ] PCR 扩增程序:94°C 预变性 3min;94°C 变性 3〇8,63.5°(：复性3〇8,72°(：延伸4〇8,30个 循环;72°C终延伸7min;4°C保存。
[0042] PCR结束后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，结果如图1所示。
[0043] (3)PCR扩增产物测序
[0044] 利用毛细管电泳DNA测序仪进行测定，主要操作步骤如下：
[0045] 1)PCR产物的测序PCR反应:纯化的PCR产物lyL(10ng/yL)，BigDye8yL(2.5x)，引物 lyL(3.2pmol/yL)，灭菌去离子水10yL。反应程序:96°C预变性lmin; (96°C变性10s，50°C复 性5s，60°C延伸4min，25个循环;4°C保温。
[0046] 2)醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物：每孔依次加入2yL 125mM EDTA和2yL 3M NaAc到 溶液中，再加入50yL 100%酒精，盖好，震荡4次，室温15min。台式离心机12000x g 4°C离心 30min，马上用枪吸尽上清液。然后，每孔加入70yL70%酒精，12000x g 4°C离心15min，马上 用枪吸尽上清液。让酒精在室温挥发干净后，加入10yL Hi-Di Formamide溶解DNA。
[0047] 3)在PCR仪上变性:95 °C4min，4°C 4min。上机电泳2h。电泳结束后仪器会自动分析 或打印出彩色测序图谱。扩增条带序列如SEQ ID No.3-7所示。
[0048] ⑷结果
[0049] 测序结果表明，由莱芜黑猪、大蒲莲黑猪基因组DNA扩增出的PCR产物的碱基长度 为471bp，且第423个碱基处为C碱基纯合状态(SEQ ID如.3、4)。由鲁莱黑猪基因组0嫩扩增 出的PCR产物碱基长度为471bp的DNA片段，且第423个碱基处为杂合状态，即同时存在C和T 碱基（SEQ ID如.3、5)。由杜洛克猪基因组0嫩扩增出的？〇?产物的碱基长度为47化？，且第 423个碱基处是T碱基纯合状态(SEQ ID No.6)。由大白猪、杜长大三元猪基因组DNA扩增出 的PCR产物同时存在碱基长度为471bp和473bp(第128个碱基处插入两个碱基CC)的DNA片 段，471bp扩增产物的第423个碱基处是T碱基纯合状态(SEQ ID No.6、7)。
[0050] 由此，获得本发明鉴定或辅助鉴定黑猪肉的方法：用引物对？：5'_ AGCCATGAGCTGAGCAGGAC-3 ' ； R: 5 ' -GAAGCAGAGGCTGGACACCAT-3 ' 对待测猪肉DNA进行PCR扩 增，当PCR扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基处为C碱基纯合状态时，可鉴定 为纯种黑猪肉（黑毛）；当PCR扩增产物同时存在碱基长度为471bp的DNA片段，而第423个碱 基处为杂合状态，即同时存在C和T碱基时，可鉴定为黑猪与外种猪杂交猪肉，即带有黑猪血 统的杂种猪肉；当PCR产物的碱基长度为471bp，且第423个碱基处是T碱基纯合状态时，或扩 增产物的碱基长度为473bp时，可鉴定为普通猪肉，即非黑猪肉。
[0051 ]实施例4.本发明鉴定或辅助鉴定黑猪肉方法准确率及灵敏性验证 [0052]准确率验证:采集员采集若干个猪品种的肌肉样本，并编号，其中有3个是莱芜黑 猪(来自莱芜市莱芜黑猪保种场），3个是大蒲莲猪(来自济宁市大蒲莲猪保种场）、3个沂蒙 黑猪(来自临沂市江泉原种猪场），3个烟台黑猪(来自威海市烟台黑猪保种场），3个五莲黑 猪(来自日照市五莲黑猪保种场），3个杜洛克(来自山东省农科院原种猪场），3个大白猪(来 自山东省农科院原种猪场），3个长白猪（来自山东省农科院原种猪场），3个杜长大三元猪 (来自济南绿安食品有限责任公司），采集员知晓哪些编号是黑猪肉，哪些编号不是黑猪肉， 且未告知实验人员。实验人员使用上述引物按照上述方法对27个样品进行检测鉴定，判定 结果经采集员确认，准确率达到100 %。说明上述黑猪肉的鉴定方法准确度高。
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的PCR引物对，其特征是，所述引物对由SEQ ID No. 1和 SEQ ID如.2所示的两条单链0嫩分子组成。2. 用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中含有权利要求1所述 引物对。3. 用于鉴定或辅助鉴定黑猪肉的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中还含有dNTP和DNA聚 合酶。4. 权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒，在鉴定或辅助鉴定黑猪肉 中的应用。5. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒，鉴定或辅助鉴定是否 为黑猪肉的方法，其特征是，步骤如下： (1) 对目标肉样进行DNA提取； (2) 使用权利要求1所述引物对，对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增； (3) 对步骤(2)中的扩增产物进行DNA测序； (4) 根据测序结果即可直接判断目标肉样是否为黑猪肉。6. 如权利要求5所述方法，其特征是，所述步骤(4)判断目标肉样是否为黑猪肉的标准 是： a. 当扩增产物的碱基长度为47lbp，同时，第423个碱基都为C碱基的纯合状态时，为纯 种黑猪肉； b. 当扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基为C和T的杂合状态， 即同时存在C碱基和T碱基时，为黑猪与外种猪杂交猪肉； c. 当扩增产物的碱基长度为471bp，同时，第423个碱基都为T碱基的纯合状态时，或扩 增产物碱基长度为473bp的DNA片段时，为普通猪肉，即非黑猪肉。7. 权利要求6所述方法，其特征是，所述473bp的DNA片段与471bp的DNA片段相比，其第 128个碱基处插入两个碱基CC。8. 权利要求5所述鉴定或辅助鉴定是否为黑猪肉的方法，其特征是，进行所述PCR扩增 反应时，所采用的退火温度为63.5 °C。9. 权利要求5或8所述鉴定或辅助鉴定是否为黑猪肉的方法，其特征是，所述PCR扩增程 序为:94°C预变性3min;94°C变性3〇8,63.5°(：复性3〇8,72°(：延伸4〇8,30个循环 ;72°(：终延伸 7min〇
【文档编号】C12N15/11GK105936934SQ201610440259
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】蔺海朝, 王彦平, 王继英, 郭建凤, 成建国, 林松
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所