用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的pcr引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的PCR引物、试剂盒及方法，属于生物技术领域。所述PCR引物的上下游核苷酸序列分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示；所述PCR引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列如Seq ID No.4所示。本发明还提供一种用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的试剂盒，其包括上述PCR引物。采用本发明所述的PCR引物和试剂盒对转基因棉花非功能性插入片段进行检测，具有快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高等优点，因此有非常高的实用价值。
【专利说明】
用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的PCR引物、试剂盒 及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于检测转基因棉花中非功能性插入 片段的PCR引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 转基因棉花是全球种植的主要转基因作物之一，也是我国种植面积最大的转基因 作物。2014年，我国710万农户种植了转基因棉花390万公顷，占棉花总种植面积93%，高于 2013年90 %的比例。目前我国批准商业化种植的转基因棉花主要有国内研发的转cry lAb/ Ac融合基因的抗虫棉和孟山都公司的转crylAc基因的保铃棉531(http:// www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/)。
[0003] 在孟山都公司向我国农业部提交的保铃棉531的转基因生物安全评价申报书 (http://www.moa·gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/201307/P020140701514080143663·pdf)中 第10页、23-25页描述了其育种亲本还含有一个非功能性插入片段，该非功能性插入片段大 小为242bp，含有来自于质粒PV-GHBK04的176bp 7S 3 '序列和66bp的多聚接头。在美国专利 W00240677中提供了该非功能插入片段及旁侧的棉花基因组序列（Genbank登录号 AX600188)，提供的序列全长1121bp，其中1-499位为棉花基因组序列，500-741位为非功能 插入片段，742-1121位为棉花基因组序列。孟山都公司提交的申报书中（第41页）中提到通 过Southern杂交在保铃棉育种世代R5和R6中检测到了这个非功能性插入片段的存在，但在 其两个商品品种中未检测到。在商业化转基因棉花品种中特别是在我国转基因棉花中是否 存在这个非功能插入片段，未见公开报道。
[0004] 保铃棉531申报书中描述的非功能插入片段尽管不具有杀虫基因的功能，但仍属 于转基因外源成分，其存在可能会对棉花基因组产生非预期的影响，因此检测该非功能插 入片段在我国转基因棉花中的存在情况是非常有必要的。目前国内外均没有关于该非功能 插入片段特异性PCR检测方法的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述领域中的空白，本发明在非功能插入片段的旁侧棉花组设计正向引物， 在其内部设计反向引物，用常规PCR方法可以快速准确鉴定出非功能插入片段。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 用于检测转基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其特征在于，其上下游引物具 有如下核苷酸序列
[0008] 7S-421F:5 '-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3 '
[0009] 7S-649R:5 '-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3 '
[0010] 所述PCR引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列如 Seq IDNo.4所示。
[0011] 用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的试剂盒，其特征在于，包括所述的PCR 引物。
[0012] 所述的试剂盒，还包括用于进行PCR和/或电泳所需的试剂。
[0013] 用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的方法，其特征在于，包括采用所述的 PCR引物和/或所述的试剂盒进行如下步骤：
[0014] (1)采用所述PCR引物对待测棉花材料的基因组DNA进行PCR;
[0015] ⑵凝胶电泳检测所述PCR产物；
[0016] (3)从所述电泳检测结果中筛选出与所述转基因棉花非功能性插入片段特征条带 大小一致的材料；
[0017] 所述PCR引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列如 SeqIDNo.4^/f*。
[0018] 所述PCR的反应体系为:G〇Taq_?GreenMaster Mix 0.5yL/yL，所述上下游引物7S-421F和 7S-649R各0.5ymol/L，DNA 模板O.lyL/yL，其余为双蒸水。
[0019] 所述PCR的反应条件为：95°C预变性4min;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸 3〇8,35个循环；72°(：延伸1〇1^11;4°(：保存。
[0020] 所述凝胶电泳指，采用0.8%的琼脂糖凝胶，于120V恒功率电泳分离15分钟后，EB 染色紫外灯下显影。
[0021] 所述试剂盒的制备方法，其特征在于，组装所述试剂盒的试剂中包括所述的PCR引 物，和/或
[0022] 在标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装盒内装有所述的PCR引物。
[0023] 组装所述试剂盒的试剂中还包括用于进行PCR和/或电泳所需的试剂，和/或
[0024] 所述标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装盒内还装有用于进行PCR 和/或电泳所需的试剂。
[0025]由于转基因抗虫棉保铃棉531在美国和我国等已经批准种植近20年，在原始育种 材料中存在着一个242bp的非功能插入片段，由于该片段与其功能插入片段并不在同一染 色体上，没有紧密连锁，因此该片段在育种过程可能随机遗传到子代材料中。因此对这个非 功能插入位点进行检测，监测其可能引起的非预期效应显得十分必要。
[0026]本发明在非功能插入片段的旁侧棉花基因组序列设计正向引物，在其内部设计反 向引物，用常规PCR方法可以快速准确鉴定出非功能插入片段。
[0027]实验数据证明，含有非功能插入片段的棉花样品能扩增得到一条229bp的片段，这 与预期结果完全一致。因此，建立的非功能插入片段定性PCR方法能有效地鉴别出非功能插 入片段。可以用于转基因棉花材料中非功能插入片段的检测。
[0028] 根据获得的两条引物及实验结果，本发明提供了用于非功能插入片段的试剂盒和 检测方法。
[0029] 综上，因此本发明为特异性鉴定非功能插入片段提供了便利，这些方法的优点在 于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
【附图说明】
[0030] 图1.20个湖南省棉花种子中非功能插入片段PCR检测
[0031] 1-20:20个棉花种子样品；21:空白对照;M:DL2000
[0032] 图2.雅杂棉一号F1的60粒种子中非功能插入片段PCR检测 [0033] 1-60:60个单粒;61:空白对照;62:阳性对照;M:DL2000 [0034]图3.湘杂棉13号F1的60粒种子中非功能插入片段PCR检测
[0035] 1-60:60个单粒;61:空白对照;62:阳性对照;M: DL2000
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
[0037] 生物材料
[0038]实施例2中所用到的20个转基因棉花种子来源为:2015年购置湖南棉花种子市场， 其中，雅杂棉一号F1(生厂商：湖南兴亚种业科技有限公司，生产批号：201410,审定编号：赣 审棉2006005)，2015年购自湖南省棉花种子市场。
[0039] 湘杂棉13号F1 (生厂商：湖南泰邦棉花种子有限公司，生产批号：201411，审定编 号:湘审棉2007008)，2015年购自湖南省棉花种子市场。
[0040]麵
[0041 ] 分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程 有限公司。
[0042]其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京三博生物技术有限责任公 司合成。
[0043] 实验仪器
[0044] PCR 扩增仪:型号 S1000(Bi〇-Rad 公司）
[0045] 核酸电泳仪:DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂）
[0046] 凝胶成像系统:BiospectrumAC(UVP 公司）
[0047] 其它仪器包括:离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
[0048]实施例1.本发明所述的PCR引物及试剂盒
[0049] 本实施例提供一种用于检测转基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其设计过 程如下：
[0050] 在美国专利W00240677中提供了该非功能插入片段及旁侧的棉花基因组序列 (Genbank登录号AX600188)，提供的序列全长1121bp，如Seq ID No. 3，其中1-499位为棉花 基因组序列，500-741位为非功能插入片段，742-1121位为棉花基因组序列。本发明在序列 的5'端棉花基因组上设计正向引物，在插入片段内设计反向引物，扩增两者的连接区，从而 建立特异性的检测方法。
[0051] 所设计的本发明的引物如下：
[0052] 7S-421F：5(-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3'(Seq ID No.1),
[0053] 7S-649R:5'-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3'（Seq ID No.2)，
[0054] 采用上述引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列 如Seq IDNo.4所示。
[0055] 基于上述PCR引物，本实施例还提供一种用于检测转基因棉花非功能性插入片段 的试剂盒，其包括上述PCR引物；
[0056] 优选地，所述试剂盒还包括用于进行PCR和/或电泳所需的试剂。
[0057] 本实施例进一步提供所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤:组装所述试剂盒的 试剂中包括所述的PCR引物，和/或，在标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装 盒内装有所述的PCR引物。
[0058] 优选地，所述步骤还包括:组装所述试剂盒的试剂中还包括用于进行PCR和/或电 泳所需的试剂，和/或，所述标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装盒内还装有 用于进行PCR和/或电泳所需的试剂。
[0059] 实施例2.转基因棉花中非功能插入片段的PCR检测方法
[0060] 采用实施例1所述的两条引物7S-421F和7S-649R或所述试剂盒，进行本发明所述 的非功能插入位点定性PCR检测方法，对2015年购置湖南棉花种子市场的20个转基因棉花 种子进行检测，包括如下步骤：
[0061 ] 1样品前处理
[0062] 雅杂棉一号F1、湘杂棉13号F1等20个转基因棉花种子2015年购置湖南棉花种子市 场，每个样品随机取600粒种子，研磨混匀。
[0063]另外，雅杂棉一号F1和湘杂棉13号F1样品再随机选取60粒种子，单粒研磨。
[0064] 2棉花基因组DNA提取
[0065]依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司）的操作手册，进行棉花材料 总DNA的提取。取5μ1提取的DNA溶液，以0.8 %的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步 判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
[0066] 3湖南省20个棉花种子的非功能插入片段的PCR检测
[0067] PCR反应体系：G〇Taq?GreenMaster Mix 10yL，引物7S-421F和7S-649R(10ymol/ L)各lyL，DNA模板2yL，补超纯水至总体积20yL。反应程序:95°C预变性4min，95°C变性30s， 56°C退火30s，72°C延伸30s，扩增反应进行35个循环，72°C保温lOmin。
[0068] 检测结果表明，如图1所示，20个湖南省棉花种子样品中有雅杂棉一号F1、湘杂棉 13号F1等3个获得了一条229bp的片段，表明在湖南省的棉花种子样品中检测到了非功能插 入片段。
[0069] 4雅杂棉一号F1、湘杂棉13号F1棉花种子中的非功能插入片段的单粒PCR检测
[0070]选择湖南省棉花种子非功能插入片段检测阳性的两个样品：雅杂棉一号F1和湘杂 棉13号F1，分别随机抽取60个单粒，单粒研磨，单粒提取DNA，采用建立的非功能插入片段定 性PCR方法进行鉴定，结果表明雅杂棉一号F1样品中含有非功能插入片段的单粒为28粒(图 2)，湘杂棉13号F1中样品中含有非功能插入片段的单粒为34粒（图3)，参照国家标准(农业 部1485号公告-19-2010)中转基因纯度的计算方法计算非功能插入片段的纯度：
[0071 ]纯度=阳性个体数/总个体数。
[0072]计算结果表明，雅杂棉一号F1和湘杂棉13号F1的非功能插入片段的纯度分别为 46.67%和 56.67%。
[0073]从图1至图3可以看出，采用本发明所述引物或试剂盒对含有非功能插入片段的棉 花材料检测时，扩增特征条带单一清晰，无其它杂带产生，说明本发明所提供的引物特异性 很1?。
【主权项】
1. 用于检测转基因棉花非功能性插入片段的PCR引物，其特征在于，其上下游引物具有 如下核巧酸序列 7S-42IF:5 '-AGAACCCACAAAGGGTGTTG-3 ' 7S-649R:5 '-CTTTCAGACTGACAAGATCG-3 ' 所述PCR引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列如Seq ID No.4所示。2. 用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所 述的PCR引物。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行PCR和/或电泳所需的试 剂。4. 用于检测转基因棉花中非功能性插入片段的方法，其特征在于，包括采用权利要求1 所述的PCR引物和/或权利要求2或3所述的试剂盒进行如下步骤： (1) 采用所述PCR引物对待测棉花材料的基因组DNA进行PCR; (2) 凝胶电泳检测所述PCR产物； (3) 从所述电泳检测结果中筛选出与所述转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小 一致的材料； 所述PCR引物扩增的转基因棉花非功能性插入片段特征条带大小为229bp，序列如Seq ID No.4所示。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为：G〇Taq? GreenMaster Mix 0.5化/化，所述上下游引物7S-421F和7S-649R各0.5皿01/L，DNA模板0.1 化/化，其余为双蒸水。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95°C预变性 4min;95°C 变性 30s，56°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇3,35个循环;72°(：延伸1〇111111;4°(：保存。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述凝胶电泳指，采用0.8%的琼脂糖凝 胶，于120V恒功率电泳分离15分钟后，邸染色紫外灯下显影。8. 权利要求2或3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装所述试剂盒的试剂中包 括权利要求1所述的PCR引物，和/或 在标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装盒内装有权利要求1所述的PCR 引物。9. 权利要求2或3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装所述试剂盒的试剂中还 包括用于进行PCR和/或电泳所需的试剂，和/或 所述标有检测转基因棉花非功能性插入片段用途的包装盒内还装有用于进行PCR和/ 或电泳所需的试剂。
【文档编号】C12Q1/68GK105907855SQ201610282177
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】谢家建, 彭于发, 王叶
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所