一种鉴别8种动物源性成分的pcr引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肉及肉类产制品中动物源性成分鉴定的食品检验技术，具体涉及一种 同步检测山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛 8种动物源性成分的PCR方法，试剂盒 及应用。
【背景技术】
[0002] 自古以来"民以食为天"，"食"是生存之本，也是人们日常生活中必不可少的一部 分。随着社会经济的发展，肉类及其制品成为人们日常食物的重要来源和组成部分。鉴于 肉类及其产制品的价格和利润，国内外市场上肉食品掺假以及"挂羊头卖狗肉"事件时有发 生，"假牛肉事件"和"马肉风波"等食品问题不仅损害了消费者的利益，同时带来诸多社会 问题。如今，食品种类更加丰富多样，一部分加工食品改变了外观和气味，难以凭感官区分 其来源；与之同时，网络销售和监管不足都给掺假者带来了可乘之机。打击食品犯罪是国家 食品安全和法制的需要，国家监管部门先后颁布多项法律法规来规范动物性食品加工销售 的多个环节。在技术上也制定了一系列的标准方法用于牛、羊、猪等物种成分的检测，这对 打击肉类及产制品掺假犯罪起到了一定作用。
[0003] 早期肉类鉴别依赖于感官和形态学检验，这些检验方法准确性低、局限度大，尤其 对于深加工的肉类以及饲料中添加的动物源性成分基本无法鉴别。随后发展起来的肉类形 态学分析和成分鉴定方法，在这个过程中基本确立了以特征性的蛋白和核酸作为靶标物质 进行检验的思路，如今形成了蛋白检验和DNA分析两个不同的检测方向。经过20多年的发 展，两种鉴别技术在精度和灵敏度均有极大提高。但是当肉类经过物理处理如切碎、混合、 腌制、蒸煮和熏烤等过程后失去了原有形态和质地，蛋白质鉴定技术很难满足对这些样品 检测的需要。而DNA尤其是线粒体DNA(mtDNA)具有耐热性强、不依赖于细胞形态、种间多 态性好等特点，表现出更高的准确度和精度以及重复性，成为现代物种溯源鉴定的"DNA条 形码"。国内外目前在行的一系列对于动物源性鉴定如猪、牛、羊、兔、马、驴、狗和鹿成分的 鉴定均采用了 DNA检测技术。但另一方面，大部分现行国家标准的检测对象为单一物种，对 于未知物种难以检测，大部分方法基于荧光定量PCR技术，存在对仪器要求高、试剂相对价 格高等不足，对大批量样品进行筛选的成本高、耗时长。因此，建立一种简便易行且可以同 时鉴定多种肉用动物源性成分的检测方法弥补现有检测方法的不足，对于提高检测工作效 率以及未知动物源性成分的溯源研宄都具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有物种鉴定技术中检测物种单一而多重PCR技术又存在特异性差的 不足，本发明提供了一种能在一次PCR操作中鉴别8种动物源性成分的PCR引物及试剂盒， 从而弥补现有技术的不足。
[0005] 申请人经过对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种及常见动物（包 括鸡、鸭、鼠、兔、狗、马、驴、鱼类）的mtDNA全序列做精细对比，发现了这些物种中一段特有 的变异序列及两端的保守序列，因此以包含8个物种特异性序列两端的保守区设计引物， 扩增产物在不同物种间大小不同，因此可以用于物种的鉴定，从而促成了本发明。
[0006] 本发明首先提供一种PCR引物，包括上游引物和下游引物，其信息如下：
[0007] 上游引物：CCTCCCTAAGACTCAGGGAA SEQ ID ΝΟ:1、
[0008] 下游引物：AAGCTCGTGATCTAATG SEQ ID NO:2 ;
[0009] 本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒使用上述的引物；
[0010] 试剂盒，还包括下列试剂：
[0011] PCR A液：含有PCR反应体系中合适浓度的PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、 引物SEQ ID 1、引物SEQ ID 2和双蒸水；
[0012] PCR B液：含有阳性DNA模板，包括山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛的基 因组DNA。
[0013] 本发明还提供一种用于检测鉴别8种动物源性成分的PCR方法，其特征在于，包括 以下步骤：
[0014] 1)采集山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛和其他常见肉类动物组织作为建 立方法的标准品，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作提取基因组DNA，或者参照分子 克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液或纯水中保存备用；
[0015] 2)将待测样品进行DNA提取后用引物进行扩增，产物进行电泳检测，依据PCR产物 条带大小和有无即可判定检测样品中是否含有上述动物源性成分；
[0016] 在检测样品是否含有上述动物源性成分的同时应设置阳性和阴性对照组；
[0017] 3)对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定，若PCR扩增产物与阳性对照组任何 一种存在一致性电泳结果则认为含有对应物种的源性成分，依次类推；
[0018] 其中，？0?反应程序为：95°〇变性51^11;95°〇变性3〇8,58.5°〇退火3〇8,72°〇延伸 30s为一个循环，共计30个循环；然后72°C保持lOmin，结束后降温至4°C ;
[0019] PCR反应中设置的阳性对照为完好的山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼、牦牛基 因组DNA样品，阴性对照为双蒸水。
[0020] 本发明与现有技术相比，可以在一次PCR反应中鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、 鹿、骆驼和牦牛8个物种，且具有较高的特异性和灵敏度。相对现有检测技术大大提高了检 测效率，尤其对于未知物种成分的产制品溯源检测具有重要意义。相比更为复杂的多重PCR 技术，本发明在一定程度上提高了灵敏度，更为重要的是一次PCR就可以鉴定8个物种，超 过了很多多重PCR检测物种的数量。本发明基于PCR技术平台，适于大多数检测和研宄单 位应用。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明对山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛的DNA样品的PCR扩增 电泳检测结果。图中所示为泳道编号1-8和对应产物大小（第二行数字是对应PCR产物大 小，单位bp) :1 :山羊；2:绵羊；3 :鹿；4 :水牛；5 :家牛；6 :牦牛；7 :猪；8 :骆驼。参照分子 量标注依次是 1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp*100bp。
[0022] 图2是本发明对8种动物DNA样品PCR产物SspI酶切鉴定的检测结果。图中各泳 道标注了物种名称，其酶切后对应产物片段大小如下：山羊：258bp、192bp、160bp和118bp ; 绵羊：300bp、180bp 和 75bp ;鹿：358bp 和 146bp ;水牛：453bp ;家牛：270bp 和 178bp ;耗牛： 181bp、178bp 和 73bp ;猪：300bp 和 96bp ;骆驼：326bp。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限 于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进 行。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护 和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0024] 实施例1引物设计
[0025] 根据GenBank所公布的基因序列，以山羊（⑶229278)、鹿（HQ191428)、水牛 (AF702618)、牛（EU177861)、绵羊（KF938337)、牦牛（KM233416)、猪（AF486867)和骆驼 (AP003423)的mtDNA全序列为模板，通过比对分析8个物种和常见物种（鸡、鸭、兔、鼠、马、 狗）的mtDNA序列，根据其基因序列的特异性和保守性，利用Primer premier 5.0软件，设 计多个物种的通用引物，该引物与上述山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛8个物种 的mtDNA序列配对。而且，为了提高引物检测的灵敏度，对上游引物的序列进行了改造。具 体的引物序列如下表1所示。
[0026] 表1 :本发明中的引物及序列
[0028] 实施例2 PCR体系优化
[0029] PCR反应体系采用了 20 μ L的基础体系，其中缓冲液2.0 μ L，引物SEQ ID 1(或 SEQ ID 3 或 SEQ ID 4)和 SEQ ID 2 各 2.0 μ L，dNTP 1.6 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L， MgCl2L 2 μ L，DNA 模板 3· 0 μ L (约含 30ng DNA)，ddH20 补充至 20. 0 μ L。
[0030] 根据上述PCR体系，在梯度PCR仪上设置温度梯度进行退火温度优化（温度范围 48. 0~63. 0°C)。基本的PCR过程如下：95°C变性5min ;95°C变性40s，不同退火温度30s， 72°C延伸40s为一个循环，共计30个循环；然后72°C延伸lOmin。
[0031] 不同温度下的PCR产物经电泳检测（4S Red琼脂糖核酸染料）后选取电泳条带大 小