一种猪圆环病毒2型的pcr检测方法、所用引物及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法、所用引物及检测试剂盒，所述PCR检测方法操作简单、技术要求低，适合于临床检测。所述PCR检测方法，包括以下步骤：（1）以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为：上游5?CGTTGGAATGGTACTCCTC?3；下游5?TATGGAAATTCAGGGCATG?3；（2）对扩增产物进行电泳；（3）分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。
【专利说明】一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法、所用引物及检测试剂盒
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法、所用引物及检测试剂盒。
[0003]
【背景技术】
[0004]猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属。是迄今为止发现的最小的单股环状DNA病毒，对外界环境有很强的抵抗力，不易被灭活。根据其抗原性的不同，可将其分为不具致病性的I型(PCVl)和具致病性的2型(PCV2)，其基因的同源性较高。PCV2的危害主要是侵害机体的免疫系统，使机体的抵抗力遭到破坏，在机体遭受其他病原侵害时抵抗力下降，引起并发或继发感染。PCV2常与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌等协同作用引起发病。引起的疾病有:断奶仔猪多系统衰弱综合症(PMWS)、猪皮炎和肾病综合症(PDNS)、繁殖与呼吸综合征、渗出性皮炎等疾病。
[0005]自1997年加拿大报道该病以来，世界上大多数国家和地区对该病均有报道，说明PCV2呈世界性分布，PCV2的发生和蔓延给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。由于目前尚无针对该病的有效预防和控制措施，且该病常以亚临床感染的形式存在，所以做好该病的诊断对该病的监控尤为重要。目前对PCV2的诊断方法较多，除了有传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA等方法以外，还有实时荧光PCR等，与这些方法相比，普通PCR操作简单，技术要求较低，更适合于临床检测或流行病学调查。
[0006]
【发明内容】
[0007]发明目的
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，操作简单、技术要求低，适合于临床检测。
[0008]本发明的另一个目的是提供用于所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法的引物。
[0009]本发明的另一个目的是提供与上述检测方法相应的检测试剂盒。
[0010]发明概述根据本发明的第一方面，提供了一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，包括以下步骤:
(I)以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为:
上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3 ；
下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3 ；
(2 )对扩增产物进行电泳；
(3)分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。优选的，PCR扩增的条件及程序为:95°C预变性5min; 94°C变性30s，48_59°C退火30s，72°C延伸30s，共41个循环，最后72°C延伸6min。进一步优选的，PCR扩增的条件及程序为:95°C预变性5min; 94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，共41个循环，最后72°C延伸6min。
[0011]优选的，PCR反应体系为:
PCR缓冲液；
MgCh 终浓度 2.5mmol/L；dNTP 终浓度(h2mmol/L;
TaqDNA 聚合酶 Iunit;
上下游引物终浓度均为0.5ymol/l ；
模板2.Ομ? ；
加ddH20至终体积50 μ?ο
[0012]其中，TaqDNA聚合酶的终浓度为本领域常规参数，引物及模板的终浓度可以由本领域技术人员经试验确定，以能获得有效的PCR扩增反应为目标。所述有效的PCR扩增反应是指当DNA模板中含有足量目标DNA序列可以进行PCR扩增反应时，扩增产物的量足以被检出，显示结果为阳性。
[0013]所述阴性对照可以由本领域技术人员进行选择，优选的，所述PCR检测方法以猪伪狂犬病病毒作为阴性对照。
[0014]根据本发明的第二方面，还提供了用于所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法的引物，其序列为:
上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3 ；
下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3。
[0015]根据本发明的第三方面，还提供了一种用于猪圆环病毒2型的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括:
PCR缓冲液；
引物对，序列为:
上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3，
下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3 ；
MgCl2;
dNTP；
Taq DNA聚合酶；
CldH2O;
阴性对照；
DNA Ladder0
[0016]优选的，所述阴性对照为猪伪狂犬病病毒。
[0017]本发明所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法操作简单，技术要求较低，便于临床检测或流行病学调查，所检测的泰州地区67份疑似PMffS的病料，其中42份表现为阳性，其阳性率可达62.6%。
[0018]【附图说明】
[0019]图1是实施例1的PCR扩增电泳图，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2、3、4:PCV2扩增产物；
图2是敏感性试验的PCR扩增电泳图，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2、3、4、5、6、7分别代表稀释 I O—1、I O—2、I O—3、I O—4、I O—5、I O—6、I O—7倍数的 PCV2扩增产物。
【具体实施方式】
[0020]下边结合实施例作具体的说明。
[0021]1.1主要试剂及仪器
基因组DNA快速抽提试剂盒、10bp DNA LadderX DNA Loading Dye、dNTP Mix均为上海生工生物工程有限公司产品；TaqDNA聚合酶为Fermentas产品，型号EP0404，浓度为lu/μ1;25πιΜ MgCl2及 10 X Buffer为Fermentas产品；PCR扩增仪(PTC-200rev)、JS-380A自动凝胶图像分析仪、Mikro200R冷冻高速离心机、DYY-7C型电泳仪、DYCP-3IDN琼脂糖水平电泳槽、恒温箱、微量移液器等。
[0022]1.2引物的设计及合成
参照GenBank上发表的PCV2全基因序列JX682407和发明人分离鉴定的5株PCV2序列(GenBank登录号::KC788750、KF039888、KF039889、KF039890、KF039891)，设计一对扩增PCV2片段的特异性引物，扩增片段位于826-979bp，长度为153bp，引物的序列为:
上游5- CGTTGGAATGGTACTCCTC-3 ；
下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3。
[0023]引物的合成由上海生物工程有限公司合成，-20°C冰箱保存备用。
[0024]1.3 DNA模板的提取
采集有PMffS典型症状发病猪的脾脏、淋巴结和肺等病变组织，按照基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书操作。提取的DNA模板-20°C保存备用。
[0025]实施例1
以1.3提取的DNA为模板，用上述引物进行扩增，反应体系为:10 X Buf f er和MgCl2各5μ1,2.5mmol/LdNTP 4μ1 ,TaqDNA聚合酶Ιμ?，上下游引物各Ιμ?，模板2.Ομ?，加ddH20至终体积50μ1，混匀后放入PCR扩增仪中。反应的程序为:95°C预变性5min; 94°C变性30s，采用48-59°C范围内不同温度退火30s，72°C延伸30s，共41个循环，最后72°C延伸6min，发现退火温度为53°C时扩增效果最好。反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖上进行电泳，凝胶成像系统进行观察。在约153bp处见一特异性条带，与预期的大小一致。结果如图1(1、2、3、4是在完全相同条件下的四次重复实验的结果，退火温度均为53°C)。
[0026]将PCR产物按DNA凝胶回收试剂盒的要求进行回收，将回收产物送去生物公司进行测序，测序的结果与GenBank中的PCV2序列进行比对，结果显示扩增的条带为PCV2序列。
[0027]
实施例2特异性测定
以1.3提取的DNA、猪瘟脾淋苗、猪伪狂犬病阳性病料的DNA、猪大肠杆菌的DNA为模板，用上述所设计的PCV2的特异性引物按照实施例1的方法进行扩增，电泳、观察结果。结果显示，所设计的引物仅能扩增出PCV2的DNA片段，约153bp，而其它扩增结果均没显示条带。其中猪瘟脾淋苗圩大北农科技集团股份有限公司商品疫苗，猪伪狂犬病阳性病料的DNA和猪大肠杆菌的DNA由
【申请人】按照现有技术分离鉴定保存。
[0028]
实施例3敏感性测定
将1.3提取的DNA作不同程度的稀释，分别用实施例1的方法进行PCR扩增，扩增结束后以1yL的PCR产物进行电泳，检测PCR方法的敏感性。结果如图2所示，说明DNA模板在经过10—MO—7稀释后，采用所述优化的条件扩增仍能在10—5时扩出片段，表明其敏感性较高。
[0029]
实施例4 PCR检测方法的验证试验
采用实施例1的方法，对发明人分离鉴定的5株PCV2(发明人最近几年从苏中地区(泰州市及周围地区)发病猪场分离到多株不同生物学特性的PCV2毒株，并对其进行了 Cap基因序列测定(GenBank登录号:KC788750、KF039888、KR)39889、KF039890、KF039891)和进化树分析)的PKl5细胞培养物进行了PCV2的检测，同时设阴性对照(猪伪狂犬病病毒PKl5细胞培养物)，计算与病毒分离鉴定方法检测结果的符合率。结果显示，2种方法检测5株PCV2和阴性对照，阴性和阳性结果完全符合，符合率为100%。
[0030]
实施例5 PCR检测方法的应用
采用实施例1的方法，对泰州海陵区、高港区及兴化市等6个地区发病猪的脾脏、淋巴结和肺等病变组织进行了 PCV2的检测。
[0031]
采用最佳的扩增条件，对所采的67份疑似PMffS的病料进行了 PCV2的检测。结果显示，其中42份表现为阳性，其阳性率可达62.6%。
[0032]
本实验根据GenBank上发表的PCV2全基因序列JX682407，设计一对扩增PCV2片段的特异性引物，扩增片段长度为153bp，对其反应条件及程序进行优化，建立的PCV2的PCR检测方法，其特异性和敏感性较好，可用于泰州地区PCV2的早期诊断及流行病学调查。对收集的疑似临床病料进行检测，67份病料，其阳性率达62.6%。该检测方法的建立有利于规模化猪场对PCV2的检测及监控，为该病的早期诊断提供了技术平台。
【主权项】
1.一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，其特征在于，顺序包括以下步骤: (I)以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为: 上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3 ； 下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3 ； (2 )对扩增产物进行电泳； (3)分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。2.如权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法以猪伪狂犬病病毒作为阴性对照。3.如权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件及程序为:95°C预变性5min; 94°C变性30s，48-59°C退火30s，72°C延伸30s，共41个循环，最后72°C延伸6min。4.如权利要求3所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件及程序为:95°C预变性5min; 94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，共41个循环，最后72°C延伸6min。5.如权利要求1-4中任一项所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR反应体系为: PCR缓冲液； MgCh 终浓度 2.5mmol/L； dNTP终浓度0.2臟01/1; TaqDNA 聚合酶 Iunit; 上下游引物终浓度均为0.5ymol/l ； 模板2.0μ1; 加ddH20至终体积50 μ?ο6.一种用于猪圆环病毒2型PCR检测方法的引物，其序列为: 上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3 ； 下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3。7.—种用于猪圆环病毒2型的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: PCR缓冲液； 引物对，序列为: 上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3， 下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3 ； MgCl2; dNTP； Taq DNA聚合酶；CldH2O; 阴性对照； DNA Ladder08.如权利要求7所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为猪伪狂犬病病毒。
【文档编号】C12Q1/68GK106086237SQ201610502874
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】曹军平, 董亚青, 郭广富, 朱爱萍
【申请人】江苏农牧科技职业学院